逆境胁迫对植物生理生化指标的影响

YUNNAN NORMAL U NIVERSITY本科学生综合性实验报告学号 084120423 姓名 罗双洪学院生科 专业、班级08生技实验课程名称教师及职称开课学期2010 至 2011 学年下学期填报时间 2011 年 6 月 15 日云南师范大学教务处编印一实验设计方案实验序号九实验名称逆境胁迫对植物生理生化指标的影响实验时间2011.5实验室4301.实验目的(1) 掌握逆境胁迫下一些植物生理指标测定方法；(2) 了解脯氨酸(丙二醛、HO)的积累2 2(3) 了解逆境胁迫下植物生理生化指标的变化以及逆境伤害和适应的原因。2实验原理、实验流程或装置示意图1.逆境胁迫与Pro的积累(1) 植物在遇到干旱、高温、低温、盐渍等逆境胁迫情况下，植物体内通过 蛋白质的降解、从头合成和降低脯氨酸脱氢酶活性等途径合成脯氨酸(Proline, Pro),从而提高了植物对逆境的抵抗能力。(2) 在酸性条件下与茚二酮发生反应生成红色化合物，此化合物在520 nm 处有最高吸收峰。2.逆境胁迫与丙二醛的积累丙二醛(MDA)是常用的膜脂过氧化指标，在酸性和高温度条件下，可以 与硫代巴比妥酸(TBA)反应生成红棕色的三甲川(3,5,5-三甲基恶唑2,4- 二酮)，其最大吸收波长在532nm。但是测定植物组织中MDA时受多种物质的 干扰，其中最主要的是可溶性糖，糖与TBA显色反应产物的最大吸收波长在 450nm，532nm处也有吸收。植物遭受干旱、高温、低温等逆境胁迫时可溶性 糖增加，因此测定植物组织中MDATBA反应物质含量时一定要排除可溶性糖 的干扰。3逆境胁迫与H O的积累2 2(1) 植物在遇到干旱、高温、低温、盐渍等逆境胁迫或衰老的情况下，植物 体内以HO为代表的活性氧(reactive oxygen species, ROS)大量积累， 作为胁迫信号或适应信号启动一系列死亡或适应生理过程。(2) 在酸性条件下(pH-1.6), HO将Fe2+氧化为Fe3+， Fe3+进 步与2 2二甲酚橙反应形成紫色的复合物Fe3+ -XO，此复合物的最大波长为560 nm， 在一定范围内，其颜色深浅与HO含量呈线性关系。在此反应中加入山梨醇2 2可提高测定H O的灵敏度。2 24实验的一般流程：选取材料一提取目标物质一测定一计算一比较3.实验设备及材料试剂：PBS(提取液)，3%磺基水杨酸(SSA),冰乙酸，茚三酮，0.5%TCA,0.6%TBA, 50mM PBS (pH=6.8,内含 1 mMHA)，5%Ti(SO4)2，20% H SO , 4 224石英砂等。仪器：研钵，移液枪，分光光度计，离心机等。实验材料：正常条件下的玉米幼苗，干旱条件下的玉米幼苗。2. 实验方法步骤及注意事项1. 试验方法步骤：(1) 逆境胁迫与Pro的积累 Pro的提取：分别取0.5 g实验组和对照组的胚芽鞘一加入3 ml 3%磺基水 杨酸(SSA)和少许石英砂一充分研磨一用2 ml 3% SSA洗研钵一5000 rpm 离心10 min 一上清液定容至5 ml。 测定：上清液各2 ml -分别加入2 ml冰乙酸和2 ml茚三酮试剂一煮沸 15 min 一冷却后分别测定A520A 计算：Pro con ten t 二 520 x V (mmol.gTFW)e x L x W(2) 逆境胁迫与丙二醛(MDA)的积累 MDA提取：分别取0.5 g实验组和对照组一加入3 ml 50mM PBS (pH=7.8)或 0.5%TCA和少许石英砂一充分研磨一用2 ml PBS或0.5%TCA洗研钵一5000 rpm 离心10 min 一上清液定容至5 ml。测定：分别取上清液各2 ml 一加入0.6%TBA (用0.6% TCA配制)2 ml-煮 沸12 min一冷却一 5000 rpm离心10 min 一分别测定OD 和OD计算：OD450 C1 X85.4OD532 二 C1 X7.4+155000 X C2求解方程得 C1 /(mmol/L)=11.71 OD450C 2/(u mol/L)=6.45 OD532 -0.56 OD450式中，C1为可溶性糖的浓度；C2为MDA的浓度(3) 逆境胁迫与HO的积累2 2 HO提取：分别取0.5 g实验组和对照组一加入3 ml 50mM PBS (pH=6.8, 内含1mM HA)和少许石英砂一充分研磨一用2 ml PBS洗研钵一5000 rpm离心 10 min 一上清液定容至5 ml。 测定：分别取上清液各2 ml-加入2 ml 5%Ti(SO丄用20%(v/v) H SO配4 224制，空白调零用20% H SO取代一反应10 min5000 rpm离心10 min 测、24定 OD410 计算：H O con tent = A41O / e.L.W X V X V1/ V 2 (mmol.gTFW)22410T122试验注意事项： 研磨要充分，注意材料不要溅出，用提取液洗研钵时要尽量充分； 正确离心并且正确取舍液体或沉淀； HqO的积累测定时，实验组添加的试剂是5% Ti(SO4)2对照组使用的试剂是20% H SO取(由于5%Ti(SO4)2是使用H SO配制而成的)；244 2243. 实验数据处理方法(1) 逆境胁迫与Pro的积累 记录Pro的提取及测定过程中的现象：A 分别测定 A 计算：Pro con tent =520 x V (mmol.g-1FW)520 x L x W(2) 逆境胁迫与丙二醛的积累 记录MDA提取和测定过程中的现象： 分别测定OD450和并OD532计算：OD450 C1 X 85.4OD532 = C1 X7.4+155000 X C2 求解方程得 C1 /(mmol/L)=11.71 OD450 C 2/(u mol/L)=6.45 OD532 -0.56 OD450 式中，C1为可溶性糖的浓度；C2为MDA的浓度(3) 逆境胁迫与H O的积累2 2 记录H O提取及测定时的现象2 2 测定 OD41O 计算：H O con tent 二 A41O /e .L.W X V X V1/V 222410T12(mmol.gTFW)4. 参考文献【1】李合生主编.植物生理学学习指导与题解武汉：华中科技大学出版社，2003【2】张志良、瞿伟菁植物生理学实验指导:第3版M.北京:高等教育出版社,2003.【3】潘瑞炽主编.植物生理学(第五版)北京：高教出版社，2004.【4】潘瑞炽主编.植物生理学(第五版)北京：高教出版社，2004.二.实验报告1. 实验现象及结果(1) 结果记录表：条件重量体积OD值现象ProOD520干旱0.5g5 ml1.463深红正常0.5g5 ml0.278浅红MDAOD450OD532干旱0.5g5 ml1.6640.486黄色正常0.5g5 ml0.7400.282浅黄H 20OD410干旱0.5g5 ml0.735浅红正常0.5g5 ml0.024浅红(2) 计算过程： 逆境胁迫与Pro的积累干旱条件下：Pro content =520 x V = 1.463x5 =4.5154 (mmol.g-lFW)ex L x W 3.24*1*0.5总正常条件下：a0 272Pro content = 520 x V =:x5= 0.8488 (mmol g-lFW)ex L x W 3.24*1*0.5总 逆境胁迫与丙二醛的积累干旱条件下：可溶性糖 C1 /(mmol/L)=11.71 OD450 =11.71X 1.664=19.49 (mmol/L) MDA C 2 /(mol/L)=6.45 OD532-0.56 叫=6.45X0.486-0.56X1.664=2.20(口 mol/L)正常条件下：可溶性糖 C1 /(mmol/L)=11.71 OD450 =11.71 X 0.740=8.6654 (mmol/L) MDA C 2 /(mol/L)=6.45。几？-0.56 叫=6.45X0.282-0.56X0.740=1.40 (口mol/L) 逆境胁迫与H2O2的积累干旱条件下：H O content = A 41(/ e .L.W X Vt X V J V2=0.735/0.28 口 mol/L.cmX 1cmX0.5gX4mlX 5ml/2ml=13.125 (mmol.g-1FW)正常条件下：HO content = A 4, .L.W X 卩卩 X V J V 22 2=0.024/0.28 口 mol/L.cm X lcmX0.5gX4mlX 5ml/2ml=0.426（mmol.g-lFW）2. 对实验现象、实验结果的分析1. 实验植物（玉米）生长特性干旱条件下的玉米植株生长情况为：茎部分呈现暗红色，叶片呈黄绿色，与 正常条件下生长的玉米植株对比，其茎生长矮小，叶片基本伸展不开，呈蜷缩 状，根系短小粗壮，研磨时干旱条件下的玉米植株比正常条件下的玉米植株难 充分研磨，说明整个生长器官的含水量很低。2. 试验现象的分析在试验中不同的物质测定试验中，试验时溶液呈现的颜色不同。因为试验 指标不同，试验时采用的材料（玉米）处理条件不同，所以试验结果没有可比 性，只能作描述，不能的到一个具体的结论。3计算结果分析Pro的积累结论：干旱条件下Pro的积累较高丙二醛的积累结论：干旱条件下丙二醛（MDA）的积累和可溶性糖的积累较高H2O2的积累结论：干旱条件下HO的积累明显较高2 24植物的旱害及抗旱性（1）干旱及旱害根据干旱发生的场所和产生的原因，可分为三种：土壤干旱、大气干燥以 及生理干旱。土壤干旱是指土壤可利用水缺乏。当土壤干旱时，根系吸水满足 不了叶片蒸腾失水的需要，植物发生水分亏缺，不能维持正常的生理活动，而 受到伤害。土壤干旱时将引起植物的永久萎蔫。永久萎蔫指由于土壤水分缺乏 引起的萎蔫，这种萎蔫，经过夜晩（停止蒸腾）也把不能解除。要解除萎蔫， 必须给土壤补充水分。永久萎蔫时的土壤含水量称为永久萎蔫系数，这时的土 壤水势约为-1.5MPa。（2）旱害的机理干旱时植物的伤害体现在两个方面：整体水平：一是抑制生长，降低产 量；二是使植物死亡。干旱抑制生长和使植物死亡具有不同的机理；器官、 组织水平：生长受抑，失去正常功能，部分或全部坏死；细胞水平：代谢失 调，膜损伤，失去正常功能，甚至死亡。干旱抑制植物生长的机理：降低细胞膨压，抑制细胞扩大和分裂，从而 抑制植物的伸长生长。抑制光合作用，降低光合生产力；呼吸代谢异常； 物质代谢紊乱。3. 实验结论从实验数据的计算结果对比能够知道Pro、MDA、H2O2的积累在干旱条件 下均比正常条件下的高，即逆境胁迫对植物影响上述几项生理生化指标的增加。 1结合旱生植物的抗旱机制，抗旱植物应具有下列特征：(1) 发达的根系，可吸收土壤深层的水分，在干旱时保证充足的水分供应；(2) 灵敏的气孔调节能力和特殊的气孔结构，如气孔内陷，发达的角质层， 减少蒸腾失水；(3) 在干旱时，叶片卷曲或脱落，降低蒸腾面积，减少蒸腾损失。叶片脱落 对植物度过干旱期有利，但对生物产量和经济产量将会产生不利影响；(4) 渗透调节能力强，增大细胞保水或吸水能力；(5) 细胞体积小，减轻脱水时的机械损伤；(6) 细胞原生质含有较多的保护性物质，如活性氧清除能力强等。2. 提高植物抗旱的途径(1) 提高植物抗旱根本途径是进行抗旱育种，培育抗旱品种。(2) 提高抗旱性的常用措施有： 抗旱锻炼：人为创造不同程度的干旱条件，提高植物对干旱的适应能力。 促进根系发育，提高渗透调节能力，积累保护性物质，增强抗脱水能力。 合理施肥：多施P、K肥。P素促进蛋白质的合成，增大原生质的水合度， K作为渗透物质和促进碳水化合物运输，降低渗透势。 化学调控：施用植物生长调节剂ABA、PP333、S3307、多效唑、黄腐酸等。三实验总结本次实验成败之处及其原因分析、改进措施:1、成功之处：通过实验了解和掌握了逆境胁迫对植物生理生化指标的影响的测定原理 和方法，使学过的理论知识上升到更具体化的层次。实验中涉及到三种生理生 化指标（Pro、MDA、HO ）的积累的测定，每种指标都单独设置对照组，分2 2别是玉米干旱和正常情况下生长的对照。本次试验能够使我们更深入的了解逆 境胁迫对植物生理生化指标的影响以及更好的防治它带来的危害。我们通过实 验真正的学习到了实验所要求的操作技术，接触到的实验操作和分析方法在大 脑中形成的印象，能够使我们在自己设计实验的时候多一些选择和思路。可以 说基本上是达到实验的目的。2、不足之处：在实验过程中弄清楚了实验的原理和操作，但是由于在Pro测定和MDA测 定中，时间比较紧凑，来不及细细回想，因此对部分操作步骤不是很清晰，虽 然在理论上弄清楚了实验的操作步骤，但是具体的操作依然存在模糊的地方。 在实验中我们消耗掉大量不必要的时间去讨论，说明在一些小环节上还有疑 问，着点应该改进，比如在上实验课之前就要弄清楚它的每一个有怀疑的地方， 就会节省很多时间来操作。在HO的积累测定过程中，对有些步骤把握不准2 2确，导致实验失败，又再次从头开始做，花费了很多的时间，同时在重新做的 过程中我们为了赶时间，导致一些操作步骤不太精准，例如秤取材料时没有做 到精准的操作，如离心机的操作，摆放不规范就影响了离心的效果，测定OD 值时分光光度计的数值一直在缓慢的变化之中，没及时记下上面的数字，这样 做就不能达到预期的结果。教师评语及评分:签名：年 月 日