生物化学技术3吸附层析

第三章第三章 吸吸 附附 层层 析析 层析又称为色谱或色层，是俄国植物学家茨层析又称为色谱或色层，是俄国植物学家茨维特在分离植物色素时发现并最先应用的一种分维特在分离植物色素时发现并最先应用的一种分离纯化方法。其总的原理是离纯化方法。其总的原理是根据各种被分离组分根据各种被分离组分在固定相和流动相的在固定相和流动相的分配系数分配系数不同不同达到分离的目达到分离的目的的 层析法根据层析类型分，可分为柱层析、纸层析法根据层析类型分，可分为柱层析、纸层析和薄层层析；根据具体分离原理分，可分为层析和薄层层析；根据具体分离原理分，可分为吸附层析、分配层析、疏水层析、离子交换层析、吸附层析、分配层析、疏水层析、离子交换层析、亲和层析、凝胶过滤层析等具体层析方法亲和层析、凝胶过滤层析等具体层析方法 吸附层析（吸附层析（absorption chromatography）又称色层法又称色层法或色谱法；是根据各种被分离组分在固定相和流动相的或色谱法；是根据各种被分离组分在固定相和流动相的分配系数分配系数不同达到分离的目的一类分离纯化方法不同达到分离的目的一类分离纯化方法吸附层析的概念吸附层析的概念 目目 的的掌握掌握吸附柱层析、薄层层析及聚酰胺薄层层析的基本原理和操作方法吸附柱层析、薄层层析及聚酰胺薄层层析的基本原理和操作方法 层层 析析 方方 法法 的的 类类 型型 第一节第一节 吸吸 附附 柱柱 层层 析析 吸附柱层析是以吸附柱层析是以固体吸附剂为固定相固体吸附剂为固定相制备成色谱制备成色谱柱，以柱，以有机溶剂或缓冲液为流动相有机溶剂或缓冲液为流动相，用于分离纯化的，用于分离纯化的一种层析方法一种层析方法 吸附柱层析的概念吸附柱层析的概念吸附层析吸附层析的固定相的固定相极性极性:如羟基磷灰石、硅胶、氧化铝、人造沸石等如羟基磷灰石、硅胶、氧化铝、人造沸石等非极性：如活性碳等非极性：如活性碳等流动相通常为有机溶剂或缓冲液流动相通常为有机溶剂或缓冲液一、常一、常 用用 术术 语语 1固定相固定相 固定相是由层析基质组成的。其基质包括固体物质固定相是由层析基质组成的。其基质包括固体物质(如吸如吸附剂、离子交换剂附剂、离子交换剂)和液体物质和液体物质(如固定在纤维素或硅胶上的如固定在纤维素或硅胶上的溶液溶液)，这些物质，这些物质能与相关的化合物进行可逆性的吸附、溶能与相关的化合物进行可逆性的吸附、溶解和交换作用解和交换作用2流动相流动相 在层析过程中推动固定相上的物质向一定方向移动的液在层析过程中推动固定相上的物质向一定方向移动的液体或气体。在柱层析中又称为洗脱剂或洗涤剂；在薄层层体或气体。在柱层析中又称为洗脱剂或洗涤剂；在薄层层析中又称为展开剂析中又称为展开剂3层析层析 以基质为固定相以基质为固定相(柱状或薄层状柱状或薄层状)，以液体或气体为流动，以液体或气体为流动相，使有效成分和杂质在这相，使有效成分和杂质在这两个相中连续多次地进行两个相中连续多次地进行分分配、吸附或交换配、吸附或交换，最终使混合物得到分离，最终使混合物得到分离的过程的过程4操作容量操作容量 是反映基质（固定相）对某种成分的结合能力的指标是反映基质（固定相）对某种成分的结合能力的指标；它表示在特定条件下，某种成分与基质反应达到平衡；它表示在特定条件下，某种成分与基质反应达到平衡时，存在于基质上的饱和容量，一般以每克时，存在于基质上的饱和容量，一般以每克(或毫升或毫升)基基质结合某种成分的毫摩尔数或毫克数来表示。质结合某种成分的毫摩尔数或毫克数来表示。其数值大其数值大，表明基质对某种成分的结合力强；否则反之，表明基质对某种成分的结合力强；否则反之5床体积床体积(Vt)是指膨胀后的基质在层析柱中所占有是指膨胀后的基质在层析柱中所占有的体积的体积(Vt)。它是基质的外水体积它是基质的外水体积(Vo)和内水体积和内水体积(Vi)以及自身体积以及自身体积(Vg)的总的总和，详见图和，详见图3-1，即，即V=Vo+Vi+Vg6洗脱体积洗脱体积(Ve)是指某一成分从柱顶部到底部的洗脱液中出现浓度达是指某一成分从柱顶部到底部的洗脱液中出现浓度达到最大值时的流动相到最大值时的流动相体积。用体积。用Ve 表示表示(见图见图3-7中中OB)7外水体积外水体积(Vo)外水体积指基质颗粒之间体积的总和外水体积指基质颗粒之间体积的总和 8内水体积内水体积(Vi)内水体积是指基质颗粒内部体积的总和内水体积是指基质颗粒内部体积的总和 9基质体积基质体积(Vg)基质体积是指基质自身所具有的体积。基质体积是指基质自身所具有的体积。Vo、Vi和和Vg都是随着床体积和基质性质变化而变都是随着床体积和基质性质变化而变化的化的10膨胀度膨胀度 在一定溶液中，单位重量的基质充分溶胀后所占有的体积在一定溶液中，单位重量的基质充分溶胀后所占有的体积（用（用V表示）。即每克溶胀基质所具有的床体积表示）。即每克溶胀基质所具有的床体积 一般亲水性基质的膨胀度比疏水性的大一般亲水性基质的膨胀度比疏水性的大11分配系数分配系数 是指一组分在固定相与流动相中含量的比值，常用是指一组分在固定相与流动相中含量的比值，常用K表示表示12.迁移率迁移率 指一组分在相同时间内，在固定相移动的距离与流动相移指一组分在相同时间内，在固定相移动的距离与流动相移动距离之比值。常用动距离之比值。常用Rf表示表示 二、基本原理二、基本原理 利用被分离样品中不同组分与吸附剂之间利用被分离样品中不同组分与吸附剂之间吸附能力吸附能力的差异的差异（或各组分的分配系数不同）进行分离。吸附能力大（或分（或各组分的分配系数不同）进行分离。吸附能力大（或分配系数大）的组分在柱子上的保留时间长，吸附能力小（或配系数大）的组分在柱子上的保留时间长，吸附能力小（或分配系数小）的组分很快被洗脱分配系数小）的组分很快被洗脱 混合物在层析柱中分离的过程实质上是吸附与解吸附的混合物在层析柱中分离的过程实质上是吸附与解吸附的过程过程三、吸三、吸 附附 剂剂（一）吸附剂的选择（一）吸附剂的选择1.具备条件：具备条件：表面积大、吸附选择性好、稳定性强、成本表面积大、吸附选择性好、稳定性强、成本低廉等低廉等2.选择原则：选择原则：由吸附剂本身和被吸附物质的理化性质而定。由吸附剂本身和被吸附物质的理化性质而定。根据根据“相似相溶相似相溶”原理，为了便于解吸附（洗脱），对于原理，为了便于解吸附（洗脱），对于极性强的分离物，应选择极性小的吸附剂；而对于极性弱极性强的分离物，应选择极性小的吸附剂；而对于极性弱的分离物则选择极性强的吸附剂的分离物则选择极性强的吸附剂（二）吸附剂的性质（二）吸附剂的性质2020世纪世纪5050年代初期，年代初期，TiseliusTiselius等用制备的羟基磷等用制备的羟基磷灰石灰石 CaCa5 5(P0(P04 4)3 3OHOH2 2（HAHA）分离蛋白质。目前国内）分离蛋白质。目前国内已有商品出售已有商品出售 1.羟基磷灰石羟基磷灰石（1）性质）性质 吸附容量高吸附容量高稳定性好（稳定性好（T85，均可使用），均可使用）使用广泛（可用于制备和纯化使用广泛（可用于制备和纯化pro、酶、核酸等）、酶、核酸等）分离效果好分离效果好HA的的Ca基团基团与生物分子表面的与生物分子表面的负电荷基团负电荷基团的作用，的作用，对分离起重要作用；而对分离起重要作用；而PO4基团与生物分子表面的正基团与生物分子表面的正电荷的作用仅起次要作用电荷的作用仅起次要作用u使用使用HA作为固定相基质时应注意作为固定相基质时应注意HA为干粉时，需事先浸泡膨胀达到为干粉时，需事先浸泡膨胀达到23ml/g后，按后，按1 6加加入缓冲液悬浮，除去细小的颗粒入缓冲液悬浮，除去细小的颗粒HA悬浮液需用旋涡振荡器混合，因为其他搅拌器如磁棒、悬浮液需用旋涡振荡器混合，因为其他搅拌器如磁棒、玻棒等易破坏其晶体结构玻棒等易破坏其晶体结构忌用柠檬酸缓冲液和忌用柠檬酸缓冲液和pH的缓冲液处理的缓冲液处理色谱柱再生时，先用色谱柱再生时，先用1 mol/L NaCl洗涤，然后用洗涤，然后用4倍床体积倍床体积的平衡缓冲液冲洗即可的平衡缓冲液冲洗即可细颗粒细颗粒HA的操作容量和分辨率均较大颗粒高，但须采用的操作容量和分辨率均较大颗粒高，但须采用较大直径的柱子较大直径的柱子2.2.硅胶硅胶（1）性质）性质 含水量：含水量：含水量高，则吸附性（活性）小，当含水量高，则吸附性（活性）小，当其表面游离水含量其表面游离水含量17%时，其结合力很小；此时，其结合力很小；此时仅能作为分配层析的固定相时仅能作为分配层析的固定相粒度：粒度：粒度小，则分离效果较好（如用粒度小，则分离效果较好（如用200400目的硅胶能有效地分离多种主物的有效成分）目的硅胶能有效地分离多种主物的有效成分）（2）活化：）活化：110烘烤烘烤0.51h。活化后立即使用或短期贮存。活化后立即使用或短期贮存与干燥器中与干燥器中四、洗脱剂四、洗脱剂条件条件 纯度较高纯度较高稳定性好稳定性好能较完全地洗脱下被分离的成分能较完全地洗脱下被分离的成分黏度小黏度小易和所需的成分分开易和所需的成分分开选择洗脱剂的顺序应从极性小选择洗脱剂的顺序应从极性小 大大 一般，一般，pro或核酸被极性强的或核酸被极性强的HA吸附后，要用含有吸附后，要用含有盐梯度的缓冲液洗脱；而甾体、色素等化合物被极性较盐梯度的缓冲液洗脱；而甾体、色素等化合物被极性较弱的硅胶吸附后，则可用有机溶剂洗脱弱的硅胶吸附后，则可用有机溶剂洗脱五、层析柱的制备和层析操作五、层析柱的制备和层析操作（一）层析柱（一）层析柱 层析柱是下端为细口并带有筛板的玻管。柱子的直径与层析柱是下端为细口并带有筛板的玻管。柱子的直径与长度之比一般为长度之比一般为1 101 40；吸附剂颗粒极细时，宜选用大；吸附剂颗粒极细时，宜选用大比例（粗）的层析柱，反之用细层析柱，这样可节省时间和比例（粗）的层析柱，反之用细层析柱，这样可节省时间和提高分辨率。层析柱的床体积由吸附剂的量和膨胀度决定提高分辨率。层析柱的床体积由吸附剂的量和膨胀度决定（二）吸附剂的用量（二）吸附剂的用量 吸附剂的用量主要由吸附剂自身的操作容量和分离物中吸附剂的用量主要由吸附剂自身的操作容量和分离物中各成分的性质决定（一般为被分离样品的各成分的性质决定（一般为被分离样品的3050倍）倍）当操作容量小时，则吸附剂用量要大；另外，当样品中当操作容量小时，则吸附剂用量要大；另外，当样品中各组分的性质相似，难以分开时，应加大吸附剂的用量，有各组分的性质相似，难以分开时，应加大吸附剂的用量，有时甚至超过时甚至超过100倍倍（三）装柱（三）装柱1.干法装柱干法装柱直接加吸附剂至柱中，然后倒入溶剂直接加吸附剂至柱中，然后倒入溶剂此法不易排尽气泡，容易导致层析不均匀此法不易排尽气泡，容易导致层析不均匀2.湿法装柱湿法装柱先加适量溶剂至柱内，排走空气，然后将预先浸先加适量溶剂至柱内，排走空气，然后将预先浸泡好的吸附剂搅均，随即将此混悬液倾入柱中泡好的吸附剂搅均，随即将此混悬液倾入柱中（图（图3-5）；待其自然沉淀至柱高的）；待其自然沉淀至柱高的1/4 1/3 时，时，打开下端出口，让溶剂慢慢流出，使柱子上端悬打开下端出口，让溶剂慢慢流出，使柱子上端悬浮液徐徐下降至需要的高度；并用浮液徐徐下降至需要的高度；并用23倍量的洗脱倍量的洗脱剂流过层析柱，使其达到平衡剂流过层析柱，使其达到平衡注：注：吸附剂表面要平整，应一直浸泡在溶剂液面以下，严吸附剂表面要平整，应一直浸泡在溶剂液面以下，严防产生气泡。湿法装柱均匀，不易留有气泡防产生气泡。湿法装柱均匀，不易留有气泡（四）上样和洗脱（四）上样和洗脱经平衡好的层析柱，当平衡液到达固定相表面时，用滴管轻轻地经平衡好的层析柱，当平衡液到达固定相表面时，用滴管轻轻地将待分离样品液加置固定相表面（注意避免冲动基质，且样品液体将待分离样品液加置固定相表面（注意避免冲动基质，且样品液体积应小于床体积的积应小于床体积的1/2）；待样品液进入固定相时，用滴管加洗脱剂，）；待样品液进入固定相时，用滴管加洗脱剂，并在上端连接洗脱剂瓶连续洗脱，同时下端与部分收集器接通，分并在上端连接洗脱剂瓶连续洗脱，同时下端与部分收集器接通，分级收集级收集将收集的每管溶液进行浓缩和活性测定。以管号或洗脱体积为横将收集的每管溶液进行浓缩和活性测定。以管号或洗脱体积为横坐标，每管样品的浓度或活度为纵坐标，若层析峰无重叠，则各成坐标，每管样品的浓度或活度为纵坐标，若层析峰无重叠，则各成分能完全分离（图分能完全分离（图3-7）为了获得满意分离效果，洗脱速度恰当控制（若太快，洗脱物在为了获得满意分离效果，洗脱速度恰当控制（若太快，洗脱物在两相中平衡不完全；太慢，则洗脱物会扩散；结果都会导致分离度两相中平衡不完全；太慢，则洗脱物会扩散；结果都会导致分离度下降）下降）分离出的样品经浓缩或冻干处理后，可进行纯度测定及保存分离出的样品经浓缩或冻干处理后，可进行纯度测定及保存 加加 样样 操操 作作 示示 意意 图图（五）柱子再生（五）柱子再生各种层析柱，其再生方法因固定相不同而异各种层析柱，其再生方法因固定相不同而异(1)纯化生命物质纯化生命物质72：天然的双链天然的双链(ds)和热变性单链和热变性单链(ss)小牛胸腺小牛胸腺DNA在在HA层析柱层析柱的分离图谱的分离图谱 六、实例应用六、实例应用(2)分离蛋白质的亚基分离蛋白质的亚基114 14C-组氨酸标记的兔球蛋白亚基在组氨酸标记的兔球蛋白亚基在HA层析柱的分离图谱层析柱的分离图谱 第二节第二节 薄薄 层层 层层 析析 薄层层析薄层层析(thin layer chromatography，TLC)是以是以涂布于玻板或涤纶片等载体上的涂布于玻板或涤纶片等载体上的基质为固定相，以液体基质为固定相，以液体为流动相的一种层析方法为流动相的一种层析方法薄层层析的概念薄层层析的概念 1展层时间短，薄层层析分离混合物一般仅需展层时间短，薄层层析分离混合物一般仅需1560min 2设备简单、操作方便，既适用于分析，也适用于制备设备简单、操作方便，既适用于分析，也适用于制备 3温度变化和溶剂饱和程度对温度变化和溶剂饱和程度对Rf值影响较小值影响较小 4可使用腐蚀性显色剂可使用腐蚀性显色剂(用淀粉作黏合剂和葡聚糖凝胶作固用淀粉作黏合剂和葡聚糖凝胶作固定相的薄板除外定相的薄板除外)5灵敏度高灵敏度高薄层层析有以下优点薄层层析有以下优点第三节第三节 聚酰胺薄膜层析聚酰胺薄膜层析 聚酰胺薄膜层析聚酰胺薄膜层析是是1966年之后发展起来的一种层析方年之后发展起来的一种层析方法。特别应指出的是，用此法分析氨基酸衍生物法。特别应指出的是，用此法分析氨基酸衍生物DNP-氨氨基酸、基酸、PTH-氨基酸、氨基酸、DNS-氨基酸以及氨基酸以及DABTH-氨基酸氨基酸1）时，具有灵敏度高、分辨力强、展层迅速和操作简便等优时，具有灵敏度高、分辨力强、展层迅速和操作简便等优点，它超过了这类化合点，它超过了这类化合物过去使用的纸层析、纸电泳和薄物过去使用的纸层析、纸电泳和薄层层析层层析(茚三酮法茚三酮法)等方法等方法 一、聚酰胺薄膜层析的概念一、聚酰胺薄膜层析的概念1用用DNS氨基酸的聚酰胺薄膜层析鉴定肽氨基酸的聚酰胺薄膜层析鉴定肽N末端末端二、应用实例二、应用实例2 2用用DABTHDABTH氨基酸的薄层法分析蛋白质序列氨基酸的薄层法分析蛋白质序列