单抗制备流程

单抗制备技术原理和流程单克隆抗体简单回顾机体受到抗原刺激后，由浆细胞合成并分泌一组能与抗原特异性结合的免疫球蛋白，即抗体。抗原上可以引起机体产生抗体的结构叫做抗原决定簇，或者抗原表位，一个抗原可以有多个不同的抗原表位。由单一B淋巴细胞产生仅识别某一特定抗原表位的抗体为单克隆抗体。由多种B淋巴细胞产生，识别多个抗原表位的抗体被称为多克隆抗体。单克隆抗体的特点特异性高：单抗特异性太高，以至于无法跨物种应用。抗体组成：仅有一种抗体亚型组成，比如IgG1、IgG2、IgG3。批次差异：和多抗一样，容易产生批次间差异。实验检测：由于单抗特异性高，因此检测时，产生的背景更少，结果重现性。抗原变异：但是相比于多抗，单抗对微小抗原变化（如轻微变性、糖基化异质性、多态性）的包容性更弱。但可以通过合并靶抗原相同的两种及以上抗体进行补偿。抗体制备：对制备技术要求高，制备杂交瘤细胞的时间较长，花费更高，制备周期更长。单克隆抗体的应用1. 分析抗原的细微结构及探测抗原的特定结构域；2. 可用于分离、特征化及纯化特定分子抗原；3. 产品可直接用于临床诊断和治疗，或用于以单抗为弹头的“生物导弹”药物，直接导向肿瘤等。单克隆抗体的制备单抗制备的方法主要包括杂交瘤技术和展示抗体库技术。实验室主要用杂交瘤技术，而大规模生产中主要用杂交瘤技术或者展示抗体库技术。抗体库技术的要求更高，制备时间更短，易于人源化，因此更适合规模生产。杂交瘤技术发展多年，颇受认可，实验操作较为简单，可生产特异性强的单抗，因此在大多数实验室中应用。1.杂交瘤技术关于杂交瘤技术，我们已经开展过几次专题解读，这里不再赘述。您可以移步查看下列文章：杂交瘤技术简述及基本原理杂交瘤细胞系如何建立杂交瘤筛选一选择培养基筛选杂交瘤筛选一特异性抗体筛选杂交瘤细胞克隆方法图2.杂交瘤技术制备单克隆抗体原理示意图。TunwW(HOPR.Tcfe*Mint|Us*ELISAi&peterrrfyhy时MFNbrpduqnq加咖谥EtwxJyHybndemBproducingijaskwmrwwnsJartbM)-Graonosfromski口也1fT2.抗体库技术抗体库技术是在已知抗体基因序列的前提下，将基因序列克隆到相应载体（比如噬菌体，哺乳细胞等），进行重组抗体的表达。下面，我们以噬菌体抗体库技术举例，讲解抗体库技术原理。噬菌体抗体库技术原理噬菌体展示技术是利用基因工程手段将外源基因片段插入噬菌体特定蛋白基因，利用噬菌体表达并展示重组融合蛋白的技术。2018年的诺贝尔化学奖颁给了噬菌体展示的发明者乔治.史密斯。噬菌体展示主要包括重组噬菌体、辅助噬菌体和宿主细菌等，先后发展出了噬菌体M13,入,T4,T7展示系统。辅助噬菌体是指由能为噬菌体提供复制和包装过程所需要的酶和结构蛋白质的完整噬菌体，即不含外源基因。丝状噬菌体pill蛋白和pVIII蛋白最常用于展示外源性重组蛋白。外源蛋白能够融合在Pill蛋白中间或者N段。图3.噬菌体展示技术原理。抗体库生产单抗流程（1）抗体库构建选取高质量的mRNA，逆转录得到抗体的轻链和重链的DNA，将PCR扩增得到的轻链和重链基因与载体连接，导入感受态细菌中。如果该噬菌体不包含噬菌体所需的全部基因，还要加入辅助噬菌体。然后进行细胞培养，重组蛋白得到展示与表达。（2）淘选利用免疫反应进行淘选。即将表达的单抗与靶抗原进行免疫反应，在经过洗脱，稀释和扩增结合的噬菌体。经过3-4轮，即可得到高度特异性的抗体噬菌体。（3）分析淘选得到的噬菌体还需要经过ELISA检测。主要过程是在包被有靶抗原的板子上加入噬菌体孵育，洗脱未结合的噬菌体，加入偶联酶的噬菌体抗体和酶特异性显色剂。若是发生显色反应，说明噬菌体抗体能与靶抗原结合。选出显色的噬菌体用于单抗的生产。通过高通量测序技术，还能对抗体的序列进行分析。生产出的抗体，也能用于下游检测，如ELISA，免疫荧光，免疫印迹，和免疫沉淀等。检验合格的单抗能在科学研究、临床诊断、医药研究等方面发挥重要作用。安必辞物科技有限公司抗萍阵构建連转隶掀幡筍和亜旅基国陀瞼链(LC)和厦惟(HC)基內fiPCfU物与瑶的萍樂体琳啡按书穿孔摂郴电俎能圖*转啓in人俺更桶肠加人辅肋瑞啟悴洱选分析將喘也陣耳日标抗原穷有“孵I选瞬则VH肿I载卫轆测膜基因分析下游苛析匚皿叭娥疫黄颠旧;彌帧财iCWB)f如诙注(IP)图4.利用噬菌体抗体库的临床应用流程。