PCR引物设计基本思路

PCR 引物设计基本思路1. 根据实验需要，确定需要扩增的 DNA 序列，并知道其 CDS 区序列（编码结构基因区,即从起始密码子区至终止密码子区）ncbi网站查询RBS149.153/gene=eryFCDS158.1372/gene=eryF1 ggatcccgat cgtgtcggag gaagaggcca agtcgcgccg ccccgaccag ctgctggtgc61 tgccctggat ctaccgcgac gggttcgtcg aacgcgagca ggagttcctc gctggcggcg121 gaaagctgat cttcccccta ccccgactgg aagtcgt atg acgaccgttc ccgatctcga181 aagcgactcc ttccacgtcg actggtaccg cacctacgcc gagctgcgcg agaccgcgcc241 ggtgacgccg gtgcgcttcc tcggccagga cgcgtggctg gtcaccggct acgacgaggc301 gaaggccgcg ctgagcgacc tgcgcctgag cagcgacccg aagaagaagt acccgggcgt361 ggaggtcgag ttcccggcat acctcggttt ccccgaggac gtgcggaact acttcgccac421 caacatgggc accagcgacc cgccgaccca cacccggctg cgcaagctgg tgtcgcagga481 gttcaccgtc cgccgcgtgg aggcgatgcg gccccgcgtc gagcagatca ccgcggagct541 gctcgacgag gtgggcgact ccggcgtggt cgacatcgtc gaccgcttcg cccacccgct601 gcccatcaag gtcatctgcg agctgctcgg cgtcgacgag aagtaccgcg gggagttcgg661 gcggtggagc tcggagatcc tggtcatgga cccggagcgg gccgaacagc gcgggcaggc721 ggccagggag gtcgtcaact tcatcctcga cctggtcgag cgccgccgca ccgagcccgg781 cgacgacctg ctgtccgcgc tgatcagggt ccaggacgac gatgacggtc ggctcagcgc841 cgacgagctg acctccatcg cgctggtgct gctgctggcc ggtttcgagg cgtcggtgag901 cctcatcggg atcggcacct acctgctgct cacccacccg gaccagctcg cgctggtgcg961 gcgggacccg tcggcgctgc ccaacgccgt cgaggagatc ctgcgctaca tcgctccgcc 1021 ggagaccacc acgcgcttcg ccgcggagga ggtggagatc ggcggtgtcg cgatccccca 1081 gtacagcacg gtgctggtcg cgaacggcgc ggccaaccgc gacccgaagc agttcccgga 1141 cccccaccgc ttcgacgtca cccgcgacac ccgcggccac ctgtcgttcg ggcagggcat 1201 ccacttctgc atgggccggc cgctggccaa gctggagggc gaggtggcgc tgcgggcgct 1261 gttcggccgc ttccccgctc tgtcgctggg aatcgacgcc gacgacgtgg tgtggcggcg 1321 ttcgctgctg ctgcggggca tcgaccacct accggtgcgg ctcgacgga t gagcacctgg 1381 ctgcggcggt tcggtcctcc cgtcgagcac cgggcgcggc tggtgtgctt cccgcacgcg 1441 ggagccgcgg ccgactccta cctcgacctc gcgcgcgcct tggcgcccga gatcgacgtg 1501 cacgccgtgc agtacccggg gcgccaggac cgccgcgacg aggagcccct gggcaccgcc 1561 ggcgagatcg ccgacgaggt ggccgccgtg ctgcgcgcgt cgggcggcga cggcccgttc 1621 gccctgttcg ggcacagcat gggcgcgttg atcgcctacg agacggcgcg caggctcgaa 1681 cgcgagcccg gcggcgggcc gctgcggctg ttcgtgtccg ggcagaccgc cccgcgcgtg 1741 cacgagcgcc gcaccgacct gcccggcgac gacggtctgg tggacgagct gcgccggctc 1801 ggcaccagcg aggcggcgct ggccgacgag gccctgctcg ccatgtcgct gccggtgctg 1861 cgcgccgact accgcgtgct gcgctcctac gcctgggcgg acggaccacc gctgcgggcc 1921 ggcatcaccg cgctgtgcgg cgacgccgac ccgctgaccg cgaccgggga cgccgagcgc1981 tggttgcagc actcggtcat ccccggccgg accaggacct tccccggcgg gcacttctac 2041 ctgggtgaac aggtcaccga ggtggccggt gccgtgcgcc gggacctgct acgcgccggg 2101 cttgcgggct gaggcgatca cgaagtcgag cgcgggcagc tcgcccttca tgcccgagtc 2161 gctggtcagc gaccgcttga cctggctgta gaagagcctg ctcacgctct tcttgaacga 2221 ctcgtcctgc aggcacctgg ctg2. 选择所需的载体,确定合适的酶切位点。 所选择的酶切位点尽量为多克隆位点的中间酶切位点，且载体上其它地方无该酶切位 点。这样连接以后再构建新的质粒时选择酶的空间更大些。并保证所需扩增的DNA序列中 无该酶切位点（generuner分析）。Hind IIIpUC182686 bpSphl PstlSallXbal Bam HI Smal IKpnlSac IEcoRIMCS3. 初步确定设计的引物长度。一般为153 Obp，引物过短会影响到扩增的特异性，过长会影响扩增速率。如果扩增 产物W500bp，引物长度为1618bp即可。若扩增产物为45kb，引物最好不要少于24bp。 引物3末端应含有所研究基因特异序列中的173Obp。4.5 正向引物的设计：4.1 酶切位点的位置选择。一般情况下都需要在引物的 5， 3端增加酶切位点，然后利用该 酶将扩增产物切下，接到相应的载体上。A：扩增的DNA用于表达时:(1) 自身有启动子。如：LOCUS VITVHBA 689 bp DNA linear BCT 26-APR-1993 DEFINITION Vitreoscilla sp. hemoglobin (VHb) gene, partial cds.ACCESSIONM30794 M31721 X13516VERSIONM30794.1 GI:155319KEYWORDShemoglobin; promoter region.SOURCEVitreoscilla sp.ORGANISMVitreoscilla sp.Bacteria; Proteobacteria; Betaproteobacteria; Neisseriales;Neisseriaceae; Vitreoscilla.REFERENCE1 (bases 42 to 689)AUTHORSKhosla,C. and Bailey,J.E.TITLE The Vitreoscilla hemoglobin gene: molecular cloning, nucleotidesequence and genetic expression in Escherichia coliJOURNALMol. Gen. Genet. 214 (1), 158-161 (1988)MEDLINE89143453PUBMED3067078REFERENCE2 (bases 1 to 210)AUTHORSKhosla,C. and Bailey,J.E.TITLECharacterization of the oxygen-dependent promoter of theVitreoscilla hemoglobin gene in Escherichia coliJOURNALJ. Bacteriol. 171, 5995-6004 (1989)COMMENTOriginal source text: Vitreoscilla sp. DNA.SWISS-PROT; P04252; BAHG$VITSP.FEATURESLocation/Qualifierssource1.689/organism=Vitreoscilla sp./mol_type=genomic DNA/db_xref=taxon:60misc signal33.40/note=promoter 2-35 signal55.61TO signal73.79misc signal86.92/note=promoter 1RBS130.133/note=putative ribosome binding site; putativeCDS142.582/note=hemoglobin/codon_start=1/transl_table=11/protein_id二AAA27585.1/db_xref=GI:155320/translation=MLDQQTINIIKATVPVLKEHGVTITTTFYKNLFAKHPEVRPLFDMGRQESLEQPKALAMTVLAAAQNIENLPAILPAVKKIAVKHCQAGVAAAHYPIVGQEL LGAIKEVLGDAATDDILDAWGKAYGVIADVFIQVEADLYAQAVEORIGIN1 aagcttacag gacgctgggg ttaaaagtat ttgagttttg atgtggatta agttttaaga61 ggcaataaag gtgctgctac accatactga tgtatggcaa aaccataata accatactga121 atgaacttaa ggaagaccct catgttagac cagcaaacca ttaacatcat caaagccact181 gttcctgtat tgaaggagca tggcgttacc attaccacga ctttttataa aaacttgttt241 gccaaacacc ctgaagtacg tcctttgttt gatatgggtc gccaagaatc tttggagcag301 cctaaggctt tggcgatgac ggtattggcg gcagcgcaaa acattgaaaa tttgccagct361 attttgcctg cggtcaaaaa aattgcagtc aaacattgtc aagcaggcgt ggcagcagcg421 cattatccga ttgtcggtca agaattgttg ggtgcgatta aagaagtatt gggcgatgcc481 gcaaccgatg acattttgga cgcgtggggc aaggcttatg gcgtgattgc agatgtgttt541 attcaagtgg aagcagattt gtacgctcaa gcggttgaa t aaagtttcag gccgctttca601 ggacataaaa aacgcaccat aaggtggtct ttttacgtct gatatttaca cagcagtttg661 gctgttgcca aaacttggga caaatattg 扩增片段里应包含启动子，所以酶切位点应该在启动子前面。 可在所扩增的 DNA 序列的启动子前寻找是否有该酶切位点，若有则直接利用该酶切 位点进行扩增；若无可寻找与其基本相似的位点进行扩增。(2)扩增片段里自身无启动子。因为在 5端增加的酶切位点(所选的酶切位点与启动子的酶切位点相同)中必须含起 始密码子，如Neo I (CCATGG), Nde I(CATATG)，设计引物时，酶切位点的起始密码子 要和DNA序列的起始密码子重叠。如上例：若添加的酶切位点为NdeI，引物的5端酶 切位点应设计位5CATAT TTAGAC3；若添加的酶切位点为NcoI,因为其位点ATG 后的G与DNA起始密码子后的T不配对，在处理这个问题上有两种方法：一种是用G 取代T,其缺点是破坏了阅读框，可能对表达会有影响；另外一种方法是将酶切位点上 的G改为T,相应的酶切位点应改为ACATGT，并查询是否有该酶存在，若有，可以直 接利用，因为同尾酶也可连接。若无，可用平末端连接。B：若扩增的DNA用于阻断。如eryF：1 ggatcccgat cgtgtcggag gaagaggcca agtcgcgccg ccccgaccag ctgctggtgc61 tgccctggat ctaccgcgac gggttcgtcg aacgcgagca ggagttcctc gctggcggcg121 gaaagctgat cttcccccta ccccgactgg aagtcgt atg acgaccgttc ccgatctcga181 aagcgactcc ttccacgtcg actggtaccg cacctacgcc gagctgcgcg agaccgcgcc241 ggtgacgccg gtgcgcttcc tcggccagga cgcgtggctg gtcaccggct acgacgaggc301 gaaggccgcg ctgagcgacc tgcgcctgag cagcgacccg aagaagaagt acccgggcgt361ggaggtcgagttcccggcatacctcggtttccccgaggacgtgcggaactacttcgccac421caacatgggcaccagcgacccgccgacccacacccggctgcgcaagctggtgtcgcagga481gttcaccgtccgccgcgtggaggcgatgcggccccgcgtcgagcagatcaccgcggagct541gctcgacgaggtgggcgactccggcgtggtcgacatcgtcgaccgcttcgcccacccgct601gcccatcaaggtcatctgcgagctgctcggcgtcgacgagaagtaccgcggggagttcgg661gcggtggagctcggagatcctggtcatggacccggagcgggccgaacagcgcgggcaggc721ggccagggaggtcgtcaacttcatcctcgacctggtcgagcgccgccgcaccgagcccgg781cgacgacctgctgtccgcgctgatcagggtccaggacgacgatgacggtcggctcagcgc841cgacgagctgacctccatcgcgctggtgctgctgctggccggtttcgaggcgtcggtgag901cctcatcgggatcggcacctacctgctgctcacccacccggaccagctcgcgctggtgcg961gcgggacccgtcggcgctgcccaacgccgtcgaggagatcctgcgctacatcgctccgcc1021ggagaccaccacgcgcttcgccgcggaggaggtggagatcggcggtgtcgcgatccccca1081gtacagcacggtgctggtcgcgaacggcgcggccaaccgcgacccgaagcagttcccgga1141cccccaccgcttcgacgtcacccgcgacacccgcggccacctgtcgttcgggcagggcat1201ccacttctgcatgggccggccgctggccaagctggagggcgaggtggcgctgcgggcgct1261gttcggccgcttccccgctctgtcgctgggaatcgacgccgacgacgtggtgtggcggcg1321ttcgctgctgctgcggggcatcgaccacctaccggtgcggctcgacgga tgagcacctgg1381ctgcggcggttcggtcctcccgtcgagcaccgggcgcggctggtgtgcttcccgcacgcg1441ggagccgcggccgactcctacctcgacctcgcgcgcgccttggcgcccgagatcgacgtg1501cacgccgtgcagtacccggggcgccaggaccgccgcgacgaggagcccctgggcaccgcc1561ggcgagatcgccgacgaggtggccgccgtgctgcgcgcgtcgggcggcgacggcccgttc1621gccctgttcgggcacagcatgggcgcgttgatcgcctacgagacggcgcgcaggctcgaa1681cgcgagcccggcggcgggccgctgcggctgttcgtgtccgggcagaccgccccgcgcgtg1741cacgagcgccgcaccgacctgcccggcgacgacggtctggtggacgagctgcgccggctc1801ggcaccagcgaggcggcgctggccgacgaggccctgctcgccatgtcgctgccggtgctg1861cgcgccgactaccgcgtgctgcgctcctacgcctgggcggacggaccaccgctgcgggcc1921ggcatcaccgcgctgtgcggcgacgccgacccgctgaccgcgaccggggacgccgagcgc1981tggttgcagcactcggtcatccccggccggaccaggaccttccccggcgggcacttctac2041ctgggtgaacaggtcaccgaggtggccggtgccgtgcgccgggacctgctacgcgccggg2101cttgcgggctgaggcgatcacgaagtcgagcgcgggcagctcgcccttcatgcccgagtc2161gctggtcagcgaccgcttgacctggctgtagaagagcctgctcacgctcttcttgaacga2221ctcgtcctgcaggcacctggctg因为只需要扩增出一定长度的与染色体 DNA 同源的序列就可以，所以对酶切位点的位 置无特殊要求。只需要寻找与所需扩增的 DNA 配对较好的区域作为酶切位点就行。如 上，可选择 ggatcc。4.2 克隆 PCR 产物的方法之一，是在 PCR 产物两端设计一定的限制酶切位点，经酶切克 隆到用相同酶切的载体上。但实验证明，大多数限制酶对裸露的酶切位点不能切断。必 须在酶切位点旁边加上一个至几个保护碱基，才能使所定的限制性酶对其识别位点进行 有效切断。加的个数见 Biolabs242 所示，加的种类要和扩增的 DNA 序列相匹配。如 NdeI,Biolabs 显示在其酶切位点上加 4 个核苷酸时，酶切 2 小时，酶切效率达到 50%， 而加 1 个核苷酸时，酶切20 小时酶切效率仍然为 0%，所以应在酶切位点前加4 个核苷 酸；为了达到尽可能与需要的 DNA 配对，所以应选 gaac；4.3 在所添加的酶切位点后加 17-30 个与扩增的 DNA 配对的核苷酸序列。 结合以上几点，对于 vhb 基因 5端引物可以为 5-gaac CATATG ttagac cagcaaacca ttaacatc3。 对于 eryF 基因可设计为 5-nnnggatcccgat cgtgtcggag gaag34.4 不同细胞对密码子的使用频率各不相同，密码子的使用频率与细胞内相应 tRNA 的丰 富是一致的，密码子使用频率高意味着需要较多的相应tRNA,二者之间的相互协调有 利于细胞内一些含量高的蛋白质的顺畅表达。同理，当人们期望人工合成的基因能在细 胞内高效表达，也要选择该细胞偏好的密码子作为基因的密码子，这样可以充分利用细 胞内丰富度高的tRNA，使基因得到高效表达。所以对引物起始密码子以后的几个密码 子要根据密码子的简并性进行改变。大肠杆菌基因密码子的使用情况：原核生物的代表 大肠杆菌基因的研究开展最早，进展也最快。比较了大肠杆菌中 13 种含量较多的蛋白 质的密码子使用情况发现这些高度表达的基因中密码子的使用有以下规律：对于以 C 或 U结尾的同义密码子，如前两个碱基为A、U，则第三个碱基优先使用C；前两个碱基 为C、G,则第三个碱基优先使用U。这样的选择有利于在翻译时密码子与反密码子相 互作用，两者的作用能不太强也不太弱，而一中度为宜即所谓最适相互作用能。5. 反向引物的设计(1) 表达时，要考虑终止密码子的位置，所扩增的片段里必须包括终止密码子，所以 酶切位点应该在终止密码子后寻找。酶切位点的选择原理与 5端一样。(2) 扩增的 DNA 用于阻断。与表达时相同，只是无需过于要求酶切位点的位置。6. 应注意碱基分布的均衡性。引物应避免嘌呤或嘧啶的堆积现象，避免连续出现4 个以上的 同一碱基。7. 检查两条引物是否存在二级结构或二聚体。(dnaman分析)如上，VHB ggatcccgat cgtgtcggag gaag；Two primers complementarity.Max complementarity in continuous: 4 bp, free energy=-1.60 Kcal/mol5-CCCTGCAGCAGTCGCTGGGTGAG-3|3-GGCTGGTGTATCCTGTCGCCTAGGTG-5Max complementarity in discontinuous: 9 bp5-CCCTGCAGCAGTCGCTGGGTGAG-3| | | | | |3-GGCTGGTGTATCCTGTCGCCTAGGTG-58.计算 Tm 值。一般退火温度为55C60C，而Tm值比退火温度高515C。两条引物的Tm值最好 相同，相差不要超过3C。9.特异性分析。必须保证酶切位点后的特异性序列在已知的序列中不存在，否则会出现非特 异性条带。（generuner分析）EryF引物正向：5-AAGGATCCAAGTCGCGCCGCCC-3反向：5 -CAAGGATCCCATGCTGTGCCCGAA3PCR 反应量的选择：1. 要扩增的是总DNA,在PCR反应前应预先变性总DNA（即100C水浴中煮沸510min）。2. 酶的选择对于扩增高GC的片段，应使用LA Taq酶，缓冲液也应该用GC Buffer。3. 酶量的选择酶量过多时易发生非特异性反应；而酶量过少时，反应性能下降。一般50ul的体系可使 用 2.5U 的酶（即 5U/ul 加 0.5ul）。4. 模板 DNA 的用量总DNA为0.11 ug；片段DNA为0.110ng。5. 引物用量终浓度为0.11.0uM。引物浓度太低时，有时扩增产物太少；引物浓度太高时，比较容 易出现非特异性扩增反应。通常模板DNA的量较多或High complexity DNA（如总DNA） 作模板时，引物浓度应该低一些；当模板DNA的量较少或Low complexity DNA （如 plasmid 等）作模板时，引物浓度应高一些。2 X Gcbuffer25ul用量参考TaKaRa目录dNTP8ulPrimer 10.5ul (稀释后的浓度为25uM，终浓度0.25umol/L)Primer 20.5ul（终浓度 0.25umol/L）LA Taq 总 DNA0.5ul(产品浓度为5U/ul)6ul（浓度是 0.05 ug/ul,质量为 0.3ug）50ul体系PCR 反应PCR的反应液应在冰中调制，然后安置于PCR反应仪上进行PCR反应。这种冷启动法可增强PCR反应的特异性，减少PCR反应中的非特异性带，能得到良好的PCR反应结果。PCR 反应条件的选择1)变性时间、温度及延伸温度基本固定。2)退火温度一般为5560C，对于GC%小于50%, 一般用55C； GC%50%时一般用60C。退火温度太高会得不到扩增产物；太低时容易发生非特异性反应。若此时有非特异性带，可提高退火温度，但不应高于68 C，因为合适的退火温度应在4568C之间。3)退火时间：一般以每 Kb 设定在 30s1min。4)延伸时间：延伸时间太短时，会得不到扩增产物或者会有一些短的非特异性产物优先生成；而太长时，会出现涂布现象。一般扩增片段W500bp，采用1 min；大 于 500bp 时，采用 3min。95C5min94C1.5min65C30sA x3072C2min72C7min手把手教你在线做 PCR 引物设计前言：我是刚刚注册到丁香园，在 PCR 技术讨论版看见置顶贴，“请求助引物设计的战友先进来这 里！”稍微浏览了一下，发现很多朋友对 PCR 引物设计还不是很熟悉，我愿意把自己积累的一点引物设 计方面的经验和大家分享，希望不会做引物设计的朋友看完之后，可以不用再发求助贴而是自己动手做 引物设计或者引物检验。开始之前：其实非常简单，不需要你下载任何软件，但是你得有一台电脑能上网。当然，最重要的 是，你要很清楚用于做引物的模板序列，至于怎么找模板序列，不再本贴的讨论范围。另外，要先对 PCR 目的序列的长度有个大致估计，好了，马上开始吧：第一步：找到Primer3的站点。你不用记住这个站点，但是要记住“Primer3”这个词，然后打 开 GOOGLE 首 页 ， 输 入 Primer3 ， 跳 出 来 的 第 一 个 项 目 就 是 了 “ Primer3 Input 0.4.0 （primer3-web/htdocs/input-040.htm）” 网址是 http:/frodo.wi.mit.edu/第二步：贴上模板序列。进入Primer3站点，可以看到一个引物设计的界面。（附件Word文档里 有图）在“Paste source sequence below （5- 3 ”下面的大空框里面把你的模板序列粘帖进去。注意是 5-3方向的，数字或者空格都没关系，软件会自动过滤的。第二步：重要参数设定。首先是“Product Size Ranges”,如果你不希望软件给你随便做的话，首 先要调整的就是这个参数。默认的参数实际上是从100到1000，这个你得自己改，如果你希望产物的大 小符合你的预期，尽可能把范围改小，比如480-500,具体看情况调整。第二个参数是Primer Size”，默 认值一般可以用，但是，当你用熟了这个软件，你自己就知道该怎么改了。第三个参数是PiimsiJTm”这 个和 Primer Size 差不多。第四步:Pick primers：点一下这个按钮，符合你大小预期的primer就出来了，看看Primer3 Output 的界面，多么漂亮！你要的primer出来了，而且有primer在序列上的位置比对图，还有primer本身的信 息，包括位置，长度， Tm， GC 含量，任何位置互补碱基数， 3端互补碱基数，以及引物序列，（注意， 下游引物是 5-3），还有产物大小，两引物间任意互补碱基数，两引物间 3端互补碱基数等。如果引物 尚在参数设定的范围内，但还不是最佳，将会给出警告。 比如（随便举例，本人在做一个超长引物）：WARNING: Left primer is unacceptable:High 3 stabilityOLIGOstartlentmgc% anyJ3seqLEFT PRIMER13369.0245.456.001.00TAATACGACTCACTATAGGGGTGAAAGACTGCCRIGHT PRIMER13883467.8629.416.002.00AAAGGGTTAATTTGCATGCTTTATTTACACACATSEQUENCE SIZE:1388INCLUDED REGION SIZE: 1388PRODUCT SIZE:1388, PAIRANYCOMPL: 500,PAIR 3COMPL:3.00第五步：引物设计检验： 可以仅仅设计一向引物，只要在 Pick left primer 或者 Pick right primer 前面的勾勾掉一个就可以。也可以自己定义引物，放在Primer框里，（注意，下游引物的书写反向仍然是 5-3）如果符合设定的条件，软件将对给出引物评分，同时给出警告信息，根据警告信息可以适当对自 定义引物做些调整即可，警告信息也让你做实验的时候心中有数。对于文献发表的引物，最好都要检查 一下，这样就可以避免被别人有意无意误导。至于RT-PCR所用的引物，最好是使得产物跨过内含子，这 样避免潜在DNA对RT-PCR的干扰。实际做引物的时候，要把内含子都去掉，仅仅把外显子序列放入源 序列框中，并且通过自定义引物设计的方法，使上下游引物分别全部或者部分落在不同外显子上。至于 如何快速识别内含子和外显子以及电子PCR,我将抽空另做说明。至于设计出来的引物的实际效果，根据我的经验，一般情况下都能做到PCR 一次成功，也许随便那 一段序列做引物也能达到很好的效果，但是不管怎么说，软件做引物可以让自己心中有数。最后， GOOD LUCK TO EVERYONE!