最新细胞电生理学与膜片钳技术1PPT文档

1991 Nobel基金会的颁奖评语：膜片钳技术点燃了细胞和分子水平的生理学研究的革命之火，为细胞生理学的研究带来了一场革命性的变化，它和基因克隆技术并驾齐驱，给生命科学研究带来了巨大的前进动力。2、膜片钳技术及其应用、膜片钳技术及其应用 3、离子通道药理学、离子通道药理学1、细胞电生理学、细胞电生理学OUTLINE 细胞电生理学细胞电生理学 Electrophysiology细胞生理学：揭示细胞的生理过程，用电生细胞生理学：揭示细胞的生理过程，用电生理方法记录生物电活动理方法记录生物电活动测量测量离子、离子通道离子、离子通道细胞兴奋细胞兴奋生物电信号生物电信号细胞生理学细胞生理学膜的膜的“流动镶嵌模型流动镶嵌模型”细胞膜和离子学说建立（细胞膜和离子学说建立（Hodgkin，et al.1946年年）磷脂双层的磷脂双层的屏蔽作用屏蔽作用Na-K 泵泵K+o Na+i离子通道(ion(ion channels)channels)离子通道是细胞膜上的一种特殊整合蛋白，对某离子通道是细胞膜上的一种特殊整合蛋白，对某些离子（些离子（K K+、NaNa+、CaCa2+2+等等）能）能选择通透选择通透，其功能是，其功能是细细胞生物电活动胞生物电活动的基础。的基础。特性：特性：通透性（permeation）选择性（selectivity）门控性（gating）研究技术：研究技术：膜片钳技术和分子克隆技术膜片钳技术和分子克隆技术 配体门控通道配体门控通道 阳离子通道：乙酰胆碱、谷氨酸、五羟色胺受体阳离子通道：乙酰胆碱、谷氨酸、五羟色胺受体 阴离子通道：甘氨酸和阴离子通道：甘氨酸和氨基丁酸受体氨基丁酸受体 乙酰胆碱受体乙酰胆碱受体 电压门控通道电压门控通道：钾、钠、钙离子通道钾、钠、钙离子通道电压门控钾离子通道电压门控钾离子通道 环核苷酸门控通道环核苷酸门控通道 气味分子与气味分子与G蛋白偶联型受体结合，激活腺苷酸环化酶，蛋白偶联型受体结合，激活腺苷酸环化酶，产生产生cAMP，开启，开启cAMP门控阳离子通道（门控阳离子通道（cAMP-gated cation channel），引起钠离子内流，膜去极化，产生神经），引起钠离子内流，膜去极化，产生神经冲动，最终形成嗅觉或味觉。冲动，最终形成嗅觉或味觉。机械门控通道机械门控通道 一类是牵拉活化或失活的离子通道，另一类是剪切力敏一类是牵拉活化或失活的离子通道，另一类是剪切力敏感的离子通道，前者几乎存在于所有的细胞膜，研究较多感的离子通道，前者几乎存在于所有的细胞膜，研究较多的有血管内皮细胞、心肌细胞以及内耳中的毛细胞等，后的有血管内皮细胞、心肌细胞以及内耳中的毛细胞等，后者仅发现于内皮细胞和心肌细胞者仅发现于内皮细胞和心肌细胞 水通道水通道 2003年诺贝尔化学奖：年诺贝尔化学奖：Pete Agre、Roderick MacKinnon2、膜片钳技术及其应用、膜片钳技术及其应用3、离子通道药理学、离子通道药理学 1、细胞电生理学、细胞电生理学OUTLINE 电生理学研究简史：二千年前，观察到电鳐鱼放电现象。1825年，Nobili发明了电流计，用其证实了肌肉有电流存在。1912年，Bridge 确定了AP的“全或无”现象。同年，Oxford提出了突触的概念及反射弧的生理学研究，获1932年Nobel奖。1937年，Hodgkin和Huxley在枪乌贼巨大神经轴突细胞内实现细胞内电记录，获1963年Nobel奖。1946年，凌宁和Gerard创造拉制出尖端直径小于1m的玻璃微电极，并记录了骨骼肌的电活动。玻璃微电极的应用使的电生理研究进行了革命性的变化。Voltage clamp（电压钳技术）由Cole和Marmont 发明，并很快由Hodgkin和Huxley完善，真正开始了定量研究，建立了HH模型（膜离子学说),是近代兴奋学说的基石。1948年，Katz利用细胞内微电极技术记录到了终板电位；1969年，又证实NM接触后的Ach以“量子式”释放，获1976年Nobel奖。1976年，德国的Neher和Sakmann发明Patch Clamp（膜片钳）。并在蛙横纹肌终板部位记录到乙酰胆碱引起的通道电流。1980年，Sigworth、Hamill、Neher等在记录电极内施加负压吸引，得到了10100 G的高阻封接(giga seal)，大大降低记录噪声，实现了单根电极既钳制膜电位又记录单通道电流。获1991年Nobel奖。History of Ion Channel Study 1955年，Hodgkin和Keens应用电压钳(Voltage clamp)在研究神经轴突膜对钾离子通透性时发现，放射性钾跨轴突膜的运动很像是通过许多狭窄空洞的运动，并提出了“通道”的概念。1963年，描述电压门控动力学的Hodgkin-Huxley模型（简称H-H模型），荣获诺贝尔医学/生理学奖。1976年，Neher和Sakmann建立膜片钳(Patch clamp)技术。1983年10月，Single-Channel Recording一书问世，奠定了膜片钳技术的里程碑。1991年，Neher和Sakmann的膜片钳技术荣获诺贝尔医学/生理学奖。1963年诺贝尔生理学/医学奖发现了发现了神经细胞膜的周边和中央部分与兴奋和抑神经细胞膜的周边和中央部分与兴奋和抑制有关的离子机制制有关的离子机制艾克尔斯艾克尔斯Sir John Carew Eccles澳大利亚澳大利亚澳大利亚国家大学澳大利亚国家大学1903年年-1997年年 霍奇金霍奇金Alan Lloyd Hodgkin英国英国英国剑桥大学英国剑桥大学1914年年-1998年年赫克斯利赫克斯利Andrew Fielding Huxley英国英国英国伦敦大学英国伦敦大学1917年年-The Nobel Prize in Physiology or Medicine (1991)Erwin Neher Bert Sakmann 1/2 of the prize 1/2 of the prize Federal Republic of Germany Federal Republic of Germany Max-Planck-Institut fr Biophysikalische Chemie,Goettingen,Federal Republic of Germany Max-Planck-Institut fr medizinische Forschung,Heidelberg,Federal Republic of Germany b.1944b.1942膜片钳技术 膜片钳技术：从一小片(约几平方微米)膜获取电子学方面信息的技术，即保持跨膜电压恒定电压钳位，从而测量通过膜离子电流大小的技术。通过研究离子通道的离子流，从而了解离子运输、信号传递等信息。基本原理 利用负反馈电子线路,将微电极尖端所吸附的一个至几个平方微米的细胞膜的电位固定在一定水平上,对通过通道的微小离子电流作动态或静态观察,从而研究其功能。膜片钳技术实现膜电位固定的关键是在玻璃微电极尖端边缘与细胞膜之间形成高阻（10）密封,使电极尖端开口处相接的细胞膜片与周围环境在电学上隔离,并通过外加命令电压钳制膜电位。由于玻璃微电极尖端管径很小,其下膜面积仅约12,离子通道数量很少,一般只有一个或几个通道,经这一个或几个通道流出的离子数量相对于整个细胞来讲很少,可以忽略,也就是说电极下的离子电流对整个细胞的静息电位的影响可以忽略,那么,只要保持电极内电位不变,则电极下的一小片细胞膜两侧的电位差就不变,从而实现电位固定。膜片钳技术的优点 膜片钳技术实现了小片膜的孤立和高阻封接的形成，由于高阻封接使背景噪声水平大大降低，相对地增宽了记录频带范围，提高了分辨率。另外,它还具有良好的机械稳定性和化学绝缘性。而小片膜的孤立使对单个离子通道进行研究成为可能。膜片钳记录的各种模式 根据膜片与电极之间的关系，可将膜片记录主要分为种模式。首先建立的单通道记录法（Single channel recording）是细胞吸附式，其后又建立了膜内面向外和膜外面向外的模式；还有一种是全细胞记录法（hole cell recording）的全细胞式。现在又发展了开放的细胞吸附式膜内面向外和穿孔囊泡膜外面向外的模式，以及穿孔膜片的模式。细胞吸附膜片(cell-attached patch mode)一种将微电极吸附在细胞膜上对单离子通道电流进行记录的模式。优点是不破坏细胞的完整性,内环境保持正常。缺点是不能人为直接地控制细胞内环境条件，不能确切判明细胞内电位。即使在浴液中加入刺激物质，也不能到达与电极内液接触的膜片的细胞外面。但是，如果膜片离子通道对浴液中的刺激物有反应，则可以说明这种刺激物是经过某些细胞内第二信使的介导间接地起作用。内面向外膜片(inside-out patch)在细胞吸附模式高阻封接形成后,将微管电极提起,使吸附的膜片从胞体上被切割下来，就得到“内面向外”膜片。此种模式，可直接且自由地经浴液介导而调控细胞内液的条件，并可在和细胞活动无关的形式下观察到单一离子通道的活动。但是，由于胞质渗漏，可能丢失某种通道调控因子，离子通道活动出现run-down（或run-up）现象。全细胞记录式(hole-cell recording)在细胞吸附模式下继续以负压抽吸使电极管内细胞膜破裂,电极胞内液与胞内液直接相通,而与浴槽液绝缘,这种形式记录膜片以外部位的全细胞膜的离子电流。它既可记录膜电位又可记录膜电流。其中膜电位可在电流钳情况下记录,或将玻管连到标准高阻微电极放大器上记录。外面向外膜片(outside-out patch)在全细胞模式上将微管电极向上提起,可得到切割分离的膜片，断端游离部分自行融合成脂质双层,此时高阻封接仍然存在。而膜外侧面接触浴槽液。用这种模式，可自由改变细胞外液的情况下，记录单一离子通道的电流活动。开放细胞吸附膜内面向外模式（open cell-attached inside-out mode）将细胞吸附式的膜片以外的某部位的胞膜进行机械地破坏，经破坏孔调控细胞内液，并在细胞吸附状态下进行内面向外的单一离子通道记录。这种方法的细胞体积越大，破坏部位离被吸附膜片越远或破坏孔越小，都可导致细胞因子外流变慢。穿孔膜片模式（perforated patch mode）为克服全细胞模式的胞质渗漏问题，Horn和Marty将与离子亲和的制霉菌素（或二性霉素）经膜片微电极灌流到含类甾醇的细胞膜片上，形成只允许一价离子通过的孔，用此法在膜片上做很多导电性孔道借此对全细胞膜电流进行记录。因为此模式的胞质渗漏极为缓慢，局部串联阻抗较全细胞模式高，所以钳制速度很慢，故也称为缓慢全细胞模式。穿孔囊泡膜外面向外模式(perforated vesicle outside-out mode)穿孔膜片模式将电极向上提起，便在微电极尖端处形成一个膜囊泡（膜内面向外膜片断端融合封闭而成）。如果条件较好，此膜囊泡内不仅有细胞质因子还可有线粒体等细胞器存在。所以在有比较接近正常的细胞内信号传递条件和代谢条件的基础上，可能记录到膜外面向外模式的单一离子通道。过去认为，膜片钳只能在培养细胞或酶解的细胞上进行，这样得到的细胞膜表面比较光滑，才能够形成高阻封接，但缺点是组织的正常三维结构被破坏，并且对神经中枢内突触特有的传递机能的研究无法展开。于是，一些学者建立了组织切片膜片钳技术（Slice patch），就能在哺乳动物脑片制备上做全细胞记录。组织切片膜片钳技术（Slice patch）1992年，在脑片膜片钳技术上，美国Ferster 实验室首次报道在在体猫的视皮层用膜片钳全细胞记录研究了视刺激诱发的兴奋性和抑制性突触后电位相互影响及节律性膜电位的变化规律。1993年，德国的Dodt和Sakmann合作，利用红外电视显微镜监视，使得膜片钳记录不但能够在神经元胞体及其树突上进行，而且可同时在这两个不同的部位作膜片钳记录。为研究化学门控性通道性质，我国学者秦达意采用 oil-gate concentration jump method，配合膜片钳记录和分析离子通道在各种化学条件下的开放与关闭以及激活与失活的动态过程。膜片钳技术的应用 分辨单通道电流,直接观察通道的开闭过程;区分离子通道的离子选择性及其门控特性(如区分电压、化学或门控性通道),发现新的离子通道及亚型;在记录单个通道电流()和全细胞电流()的基础上,可分别计算出细胞膜上的通道数()和开方概率(),依公式=;用以检测某些递质能否打开通道(外面向外膜片),或是否接受第二信使的调控(内面向外膜片);研究腺苷酸环化酶、多磷酸磷脂酰肌醇激酶、蛋白激酶等活性变化,以及细胞膜上信使物质二酰甘油花生四烯酸等对离子通道型受体的调节机制(应用全细胞钳或外面向外膜片);研究受体的激活态、失活态和静息态的功能；研究不同离子强度对通道特性的影响及细胞内信使物质如1,4,5-三磷酸肌醇、环腺苷酸(cAMP)、环磷酸鸟苷(cGMP)、Ca2+等对离子通道型受体的调节机制(内面向外膜片)。研究药物对电压和化学内控性通道的影响。Neher等首创将膜片钳技术与Fura 2 荧光测钙技术结合,同时进行如细胞内荧光强度、细胞膜离子通道电流及细胞膜电容等多指标变化的快速交替测定,这样便可得出同一事件过程中,多种因素各自的变化情况,进而可分析这些变化间的相互关系。Neher将可光解出钙离子的钙螯合物引入膜片钳技术,进而可以定量研究钙离子浓度与分泌率的关系及最大分泌率等指标。膜片钳技术与其它技术相结合 他又创膜片钳的膜电容检测与碳纤电极电化学检测联合运用的技术。之后又将光电联合检测技术与碳纤电极电化学检测技术首先结合起来。这种结合既能研究分泌机制,又能鉴别分泌物质,还能互相弥补各单种方法的不足。Eberwine等于1991年首先将膜片钳技术与RT-PCR技术结合起来运用,可对形态相似而电活动不同的结果作出分子水平的解释，从此开始了膜片钳与分子生物学技术相结合的时代：基因重组技术,膜通道蛋白重建技术。