《Sanger法测序》PPT课件

杨华志杨华志 唐金凤唐金凤 胡志锋胡志锋 周巧云周巧云 杨晓琴杨晓琴CCME 03第第2 2页页 HLA的介绍的介绍 测序原理测序原理Sanger法测序法测序 测序反应操作流程及注意事项测序反应操作流程及注意事项 简单的峰图分析简单的峰图分析CCME 03第第3 3页页CCME 03第第4 4页页为什么要进行为什么要进行HLAHLA检测检测 HLA 是迄今为止发现的多态性最高的基因系统之一，它与同种异体器官移植的排斥反应密切相关，而且该基因的高度多态性在法医学上的亲子鉴定、个人识别以及疾病相关性和人类进化研究方面也起着重要作用。HLA配型在器官移植中是必要的。HLA的相容性程度（配型的符合程度）是决定移植物长期存活的主要因素之一。CCME 03第第5 5页页1 1、血清学分型、血清学分型2 2、细胞学分型、细胞学分型3 3、DNADNA分型分型 PCR-RFLPPCR-RFLP技术技术 PCR-SSOPCR-SSO技术技术 PCR-SSPPCR-SSP技术技术 PCR-SBTPCR-SBT技术技术CCME 03第第6 6页页 PCR-SBT:以PCR扩增所要分析的基因片断，然后对DNA序列进行分析，可以直接得到基因型。分辨率高，可大规模进行，精确度高，能直接发现新的等位基因。SBT法法HLA高分辨分型已逐步在欧美国家高分辨分型已逐步在欧美国家推广，并成为推广，并成为“金标准金标准”。目前我们华大也以SBT法为主，并结合SSP方法进行HLA的配型。CCME 03第第7 7页页PCR-SBTPCR-SBT法分型的基本流程法分型的基本流程backbackCCME 03第第8 8页页测序原理测序原理双脱氧链终止法（Sanger法）：19771977年，英国人年，英国人Fred Sanger Fred Sanger 发现，如果在发现，如果在DNADNA复制过程中掺入复制过程中掺入ddNTPddNTP，就会产生一系列末端终止，就会产生一系列末端终止的的DNADNA链，并能通过电泳按长度分辨链，并能通过电泳按长度分辨。不同末端终不同末端终止止DNADNA链的长度是由掺入到新合成链上随机位置的链的长度是由掺入到新合成链上随机位置的ddNTPddNTP决定的。决定的。CCME 03第第9 9页页ONHHOHHOHHCH2OPOHOOH（H）ONHHOHHOHHCH2OPOHOOH（H）ONHHOHHOHHCH2OPOHOOH（H）ONHHOHHOHHCH2OPOHOOH（H）（H）ONHHOHHOHHCH2OPOOHOONHHOHHHCH2OPOHOOH（H）5 磷酸磷酸3 羟基羟基3,5 -磷酸磷酸二酯键二酯键测序原理测序原理CCME 03第第1010页页测序原理测序原理CCME 03第第1111页页测序原理测序原理CCME 03第第1212页页PCRPCR与测序反应的比较与测序反应的比较 PCR 测序反应测序反应DNA 聚合酶聚合酶 Taq酶酶 测序酶测序酶引物引物 一对一对 单向单向底物底物 dNTP dNTP+ddNTP*模板模板 量少量少 质量要求高质量要求高产物产物 等长的等长的DNA片段片段 长短不一的片段长短不一的片段 3端带荧光标记端带荧光标记 测序原理测序原理backbackCCME 03第第1313页页测序反应操作步骤测序反应操作步骤 实验前准备实验前准备 Mix配制配制 测序引物稀释测序引物稀释 编板号（编板号（日期日期_S位点位点_测序引物测序引物_纯化板编号纯化板编号_（其它）（其它）反应加样反应加样 短暂离心后上短暂离心后上PCR仪仪 CCME 03第第1414页页 预约预约PCR仪仪 编写测序反应表编写测序反应表 根据要检测的样品数计算试剂的需要量根据要检测的样品数计算试剂的需要量 查看实验所需的耗材是否够用查看实验所需的耗材是否够用 用用70乙醇擦桌面，不能残留粉尘乙醇擦桌面，不能残留粉尘测序反应实验前准备测序反应实验前准备backCCME 03第第1515页页MixMix配制配制Step1：按实验需要的体系和用量计算各组分的加量，：按实验需要的体系和用量计算各组分的加量，冰上或冰上或4避光缓慢解冻避光缓慢解冻2.5BigDye；计算公式：计算公式：1（V）2.5（VBD）5（VBuffer）其中其中V反应体系体积，通常反应体系体积，通常5l；VBD2.5BigDye 体积；体积；VBuffer5Buffer体积体积Step2：振荡：振荡3秒或颠倒秒或颠倒5次混匀，离心次混匀，离心10秒，冰上或秒，冰上或4避光保存，当天使用；剩余避光保存，当天使用；剩余mix可可-20保存，避保存，避免反复冻融，解冻免反复冻融，解冻2次内用完。次内用完。常用配方：常用配方：试剂名称试剂名称每每5l反应体系理论用量反应体系理论用量模板DNAPCR产物20-50ng；质粒100-200ng引物3.2pmol2.5BigDye0.5l0.4l0.3l0.2l5Buffer0.75l0.8l0.85l0.9l超纯水加至5lCCME 03第第1717页页MixMix配制注意事项配制注意事项 对多个使用相同引物的测序反应可以把引物加到对多个使用相同引物的测序反应可以把引物加到mix中中 配制配制mix和稀释引物的和稀释引物的millipore水应分别使用；水应分别使用；吸取不同的试剂要换枪头；吸取不同的试剂要换枪头；试剂打开后应立即吸取并盖好盖子，接触样品的试剂打开后应立即吸取并盖好盖子，接触样品的容器、试剂严禁长时间暴露在空气中，时刻防止容器、试剂严禁长时间暴露在空气中，时刻防止污染！污染！backCCME 03第第1818页页引物稀释引物稀释干粉稀释干粉稀释Step1：按合成报告单上的分装规格计算稀释至所需浓：按合成报告单上的分装规格计算稀释至所需浓度应加入的超纯水；度应加入的超纯水；Step2：将干粉离心：将干粉离心12000rpm，2min；Step3：加入一定体积的：加入一定体积的millipore水后盖好离心管盖；水后盖好离心管盖；Step4：振荡：振荡1分钟，室温放置分钟，室温放置30分钟，使其充分溶解；分钟，使其充分溶解；Step5：再次振荡：再次振荡30秒，离心秒，离心10秒。秒。CCME 03第第1919页页引物稀释引物稀释液体稀释：液体稀释：根据以下公式计算（通常使用液浓度）根据以下公式计算（通常使用液浓度）加水量加水量=(储存液体积储存液体积储存液浓度储存液浓度/使用液浓度使用液浓度)-储存储存液体积液体积 按预算的体积在离心管中加入按预算的体积在离心管中加入millipore水，吸取所水，吸取所需体积的指定引物储存液加入水中，充分振荡需体积的指定引物储存液加入水中，充分振荡30秒秒，离心，离心10秒，备用。秒，备用。CCME 03第第2020页页稀释引物注意事项稀释引物注意事项1、引物稀释前要离心，液体引物、引物稀释前要离心，液体引物12000rpm离离 心心30s,干粉引物干粉引物12000rpm离心离心2min。2、打开干粉引物离心管盖时动作尽量轻缓，、打开干粉引物离心管盖时动作尽量轻缓，打开的角度不超过打开的角度不超过45。3、每次稀释引物前，均需用新的、每次稀释引物前，均需用新的millipore水。水。4、加水稀释时注意枪头的更换，避免交叉污、加水稀释时注意枪头的更换，避免交叉污染。染。5、稀释完后，将引物的流水号和引物名称一、稀释完后，将引物的流水号和引物名称一一对应写在新的一对应写在新的Ep管上。管上。backCCME 03第第2121页页反应加样反应加样 按按测序反应表测序反应表将待测样本和测序引物摆放到将待测样本和测序引物摆放到96试管架上对应位置；移液器调至所需量程；实试管架上对应位置；移液器调至所需量程；实验用品放在便于操作的位置；测序反应板标记板验用品放在便于操作的位置；测序反应板标记板号后开始加样。号后开始加样。按照反应体系加样：按照反应体系加样：每次加完后都要离心一下，检查每个孔是 否都已加入，然后才 进行下一步A、B位点用位点用1/27体系体系 DR位点用位点用1/20体系体系 1/27体系体系：1/20体系：体系：模板模板 1.0 L 模板模板 1.0 LBigdye（2.5）0.3L Bigdye（2.5）Primer（）（）1.0 L Primer（）（）1.0 L 去离子水去离子水 1.85 L 去离子水去离子水-5L 5L加样时注意事项：加样时注意事项：1.使用前检查移液器量程设定是否准确；使用前检查移液器量程设定是否准确；2.使用时检查吸取液体量是否准确，排液后枪头内使用时检查吸取液体量是否准确，排液后枪头内不能有残留；不能有残留；3.在距管口在距管口3-5毫米处贴管壁加微量试剂毫米处贴管壁加微量试剂.加样时注意事项：加样时注意事项：4.加样使用的枪头在枪头盒中的位置对应测序反应加样使用的枪头在枪头盒中的位置对应测序反应板每个孔的位置；每加完一种试剂后都要在黑色板每个孔的位置；每加完一种试剂后都要在黑色背景上检查，有少加或漏加情况时应立即补足，背景上检查，有少加或漏加情况时应立即补足，确认无误后方可进行下一步操作；确认无误后方可进行下一步操作；5.加错试剂时立即在测序反应表中记录，在新的板加错试剂时立即在测序反应表中记录，在新的板孔中重新加样；孔中重新加样；6.加不同试剂或相同试剂加入含有不同试剂的板孔加不同试剂或相同试剂加入含有不同试剂的板孔 中中，必需换枪头；必需换枪头；back上PCR仪：1.短暂离心后上短暂离心后上PCR仪。仪。2.测序反应程序：测序反应程序：96，2min96，10s55，5s60，2min25cycles15，；3.PCR仪程序运行结束后冷却到仪程序运行结束后冷却到15，退出程序，退出程序，取下测序反应板，记录取下测序反应板，记录PCR仪运行情况；在纯化板仪运行情况；在纯化板左边画上左边画上“”代表已上代表已上PCR仪；冰箱冷藏区特定位仪；冰箱冷藏区特定位置置保存，待纯化，并通知纯化岗同事。保存，待纯化，并通知纯化岗同事。上上PCR仪注意事项：仪注意事项：1.上机前确认样品板的孔都加了样品；上机前确认样品板的孔都加了样品；2.确认确认PCR程序是否正常终止；程序是否正常终止；3.程序结束后，观察每孔是否有蒸干现象；程序结束后，观察每孔是否有蒸干现象；4.连续使用连续使用PCR仪时，两轮之间让机器待机仪时，两轮之间让机器待机20分钟以上。分钟以上。backCCME 03第第2626页页CCME 03第第2727页页测序峰图的简单分析测序峰图的简单分析我们所用的峰图分析软件为：我们所用的峰图分析软件为：整板峰图的大概情况：整板峰图的大概情况：原始数据原始数据Raw窗口：窗口：CCME 03第第3030页页原因：原因：1、模板质量差；、模板质量差；2、模板浓、模板浓度过高或者过低；度过高或者过低；3、纯化时样、纯化时样 品品丢失；丢失；4、引物降解或者加错；、引物降解或者加错；5、Bigdye浓度过低或者失效；浓度过低或者失效；6、水水污染；污染；7、PCR仪温度不稳定仪温度不稳定解决方案解决方案：1、检测模板纯度；、检测模板纯度；2、调节模板浓度；、调节模板浓度；3、换新的、换新的引物；引物；4、提高提高Bigdye浓度；浓度；5、换水；、换水；6、检、检 测测PCR仪；仪；7、保证纯化时酒精的浓保证纯化时酒精的浓 度及体度及体积，倒甩时速度不能高于积，倒甩时速度不能高于 185g无反应无反应测序引物问题：测序引物问题：现象：每个峰后面有个同样荧现象：每个峰后面有个同样荧光信号的小光信号的小“尾巴尾巴”。原因：合成是引物多一个碱基。原因：合成是引物多一个碱基。对策：重新合成引物。对策：重新合成引物。现象：每个峰前面有个同样荧光现象：每个峰前面有个同样荧光信号的小信号的小“尾巴尾巴”。原因：合成时引物少一个碱基。原因：合成时引物少一个碱基。对策：重新合成引物。对策：重新合成引物。引物或模板不纯：引物或模板不纯：现象：整个峰图噪音都比较高；现象：整个峰图噪音都比较高；原因：引物或模板不纯；原因：引物或模板不纯；对策：选用高纯度的引物，或模版纯化要充分。对策：选用高纯度的引物，或模版纯化要充分。CCME 03第第3333页页原因：原因：1、模板不纯；、模板不纯；2、模板、模板上有两个引物结合位点；上有两个引物结合位点；3、加入两个引物；加入两个引物；4、退火温度、退火温度 过低；过低；5、纯化时污染、纯化时污染解决方案解决方案：1 1、优化、优化PCRPCR反应条反应条件；件；2 2、重新设计引物；、重新设计引物；3 3、提、提 高测序反应的退火温度；高测序反应的退火温度；4 4、加加 样及纯化时要防止污染样及纯化时要防止污染套峰套峰CCME 03第第3434页页原因：原因：1、太多的模板量；、太多的模板量；2、Bigdye稀释过度；稀释过度；3、模板、模板量量 过少；过少；4、引物过量；、引物过量；5、模模 板纯化不好；板纯化不好；6、模板上、模板上有不有不 容易测通的区域（如容易测通的区域（如poly G）解决方案解决方案：1、检测模板浓度、检测模板浓度及纯度；及纯度；2、减少反应体积优、减少反应体积优于提高模于提高模 板稀释度；板稀释度；3、检测、检测引物浓度是否引物浓度是否 正确；正确；4、检测、检测是否有不易测通的是否有不易测通的 区域存在。区域存在。读长短读长短CCME 03第第3535页页原因：原因：1、部分测序反应失败；、部分测序反应失败；2、模板量太多或太少；、模板量太多或太少；3、测序反应后纯化丢失了部分样品；测序反应后纯化丢失了部分样品；测序结果背景高并且信号值低(150)POLY结构对信号的影响：结构对信号的影响：Poly在序列的在序列的前端对信号影前端对信号影响较小响较小Poly在序列的在序列的后端对信后端对信号影响较大号影响较大Poly-G/poly-C很容易导致信号中断和信号乱：很容易导致信号中断和信号乱：Thank you!Thank you!back