青蒿素的提取工艺及含量测定

青蒿素的提取工艺及含量测定摘要：青蒿素是目前治疗疟疾的特效药。本文采用热提取的方法对药用植物青蒿 进行提取，提取收率为4%,此法工艺简单，操作容易，周期短，成本底，收率高。 在测定时主要采用薄层层析法和分光光度计法对其进行定性定量的测定，含量为 98.59%,达到国家药典的标准。实验证明：热提一-柱层析法具有可应用性和可操 作性。关键词：青蒿；青蒿素；含量测定Abstract: Artemisinin as specific drug for the malaria at present. Through , thermal extraction method of medicinal plants for extraction of artesunate in this paper,with a yield of 4% , it is a simple method that operates easily、 cycle short、 becomes the background、 receiving rate is high. Determination of the major TLC and its spectrophotometer for the Qualitative and Quantitative determination , The content is 98.59%, Achieves the national pharmacopoeia the standard, It is proved that the heat raisesthe Column chromatographyanalysis law to have may the application and may be operational by experiment.Key words: Artemisin， Artemisinin， Content determination图1青蒿素的结构式青蒿是我国的传统中药，民间用于消暑、退热、治感冒 等，青蒿还具有抗疟、抗血吸虫、抗病毒与增强机体免疫等 作用。在我国数百名科学工作者的协作中，从青蒿中提取了 它的抗疟有效成分，一种新型倍半菇内酯，后命名为青蒿素， 青蒿素为无色针状结晶，分子式为C H 0 ,其结构式如图1,15225熔点为156-157C，易溶于氯仿、丙酮、乙酸乙酯和苯，可溶 于乙醇、乙醸，微溶于冷石油醸，几乎不溶于水。因其具有特殊的过氧基团，对热不 稳定，易受湿、热和还原性物质的影响而分解国内外大量的理化试验、药理研究和 临床应用表明青蒿素是抗疟的有效成分，认为青蒿素的发现是抗疟研究史上的重大突 破，并成为世界卫生组织推荐的抗疟药品，特别是对脑型疟疾和抗氯卩奎性疟疾有很好 疗效。近年来青蒿素的抗疟活性在世界范围内被广泛关注，在疟疾流行地区青蒿素的 需求量增加。此后又发展了一系列现已作为正式抗疟药物的青蒿素的衍生物，此时我 国研制的青蒿素类抗疟药物以高效、安全、对抗药性疟疾有特效而风靡全球，1995年 蒿甲醸被WT0列入国际药典，这是我国第一个被国际公认的独创新药。青蒿素的化学 结构十分独特，自上市至今20多年，尚未发生抗药性的病例。由于青蒿素是抗恶性疟 疾的特效药，目前的售价为225美元/go近年的统计资料表明3世界每年近300万人死 于疟疾，尤其是非洲的发病率极高，对青蒿素的需求量较大，世界每年的需求量为1501， 而年产量仅有501左右，形成明显的供不应求局面。目前对青蒿素的提取常用冷提- 结晶法，但此法周期长，提取效率低，本实验采用热提-柱层析法缩短了提取时间， 提高了提取效率。1 仪器、试剂与材料50ml圆底烧瓶、回流冷凝管、721型分光光度计（上海分析仪器厂）、分析天平（上海 精科天平厂）、微量移液管（上海求精玻璃仪器厂）、电热恒温水浴锅、恒温烘箱、干燥器 柱层析、硅胶薄层板（由青岛海洋化工厂生产，薄层层析板用硅胶G加0.3%CM C-Na制备 而成。显色剂为2%香草醛-浓硫酸（1：1）混合液。喷雾后，电吹风加热显色）等。乙醚、乙醇、氢氧化钠、乙酸乙酯、异丙醇、石油醚均为分析纯。 青蒿的原材料及其标准样由海裕药业提供。2 方法与步骤2.1 提取称取100g青蒿叶粉（过30目筛），加入8倍石油醚（800毫升，沸程6090C）,水 浴55C搅拌回流提取5小时，第二次提取加入6倍石油醚（600毫升，沸程6090C）， 水浴55C搅拌回流提取3小时，第三次提取加入4倍石油醚（400毫升，沸程6090C）， 水浴55C搅拌回流提取2小时，得滤液一、二、三，分装，渣子回收尽石油醚重复使用。2.2 柱层析2.2.1 装柱2倍原料硅胶（200克100200目），干法装柱：打开层析柱的下端阀门，在柱的上 端入一漏斗，硅胶经漏斗成一细流慢慢均匀地加入柱中，中间不能间断，装好后，柱上端 放一层脱脂棉，压紧，填实，用石油醚走通即可上药。2.2.2 上药将提取滤液按先后次序加入柱中（先加第一次提取滤液），完后用200ml石油醚洗涤。2.2.3 洗脱洗脱液为石油醚-异丙醇（体积比95：5）混合液。分段（每100毫升为一段）收集， 薄层检测（展开剂为石油醚-乙醚=6：4），收集合格段。2.3 浓缩先常压浓缩（温度小于70C ）青蒿素段层析液，然后减压再浓缩至有晶体析出为止， 静置 12 小时，过滤得粗晶和母液。母液再减压浓缩再结晶，合并两次粗晶，剩下母液可 与下批一起再上柱。2.4 重结晶将结晶用90%乙醇60毫升加热（温度小于70C ）溶解，趁热真空抽滤，滤液静置12 小时结晶，过滤，母液再减压浓缩再结晶过滤，合并晶体，60C真空烘干得产品0. 40克, 收率0.40%。2.5 定性定量测定2.5.1 定性测定：硅胶薄层检测法吸取一定量样品青蒿素溶液，点样于以硅胶G制作的薄板上，在距薄层一端1.5厘米 平行线上点7个样品点，间隔9毫米，其中2、6位上点对照样品溶液，采用石油醚（沸 程6090C）:乙醚=6 : 4作展开剂，再挥去溶剂，喷以显色剂2%香草醛一浓硫酸, 在80C箱中烘半小时取出，结果青蒿素的色点由黄变绿再变为海蓝色。同时可根据海蓝色 斑点的深浅和大小与对照品比较，粗略估算与结果一致。2.5.2 定量测定：紫外分光光度法1）标准曲线的测定精确称取80C下干燥至恒重的青蒿素标准品10mg，置于100ml容量瓶中，用95%醇定 容，分别吸取2,4,6, & 10ml于50ml容量瓶中，用95%乙醇补充至10ml，再用0.2%NaOH 定容至50ml，样品置于（501）C水浴中反应30min，流水冷却至室温。在292nm波长处，测定各溶液的吸光度。结果如表1所示，根据吸光度浓度标准曲线如图2，得到直线回归方程Y=0.9569X-0.0162,标准曲线线性相关系数为r=0.9989。表1 青蒿素标准曲线测定结果Concentration(mg/50ml)0.200.400.600.801.00Absorbance(Abs)0.17520.36400.54980.76320.9407青蒿素标准曲线图10.9)sbA(ecnabrosb0.80.70.60.50.40.30.20.100.2 0.4 0.6 0.8 1Concentration (mg/50ml)图2 青蒿素标准曲线图2）样品的测定从样品中精确称取2mg于10ml容量瓶中，用95%乙醇定容，吸取3ml于50ml容量瓶 中，用95%乙醇补充至10ml,再用0.2%Na0H定容至50ml, 50C水浴中反应30min后取出, 流水冷却至室温。紫外区 292nm 处测吸收值为 0.5421。根据直线回归方程 Y=0.9569X-0.0162,可以计算出样品中青蒿素的含量98.59%。2.6 精密度试验取同一批提取物,依法测定5次,提取物中青蒿素的含量为98.59%、98.64%、98.58% 98.57%、98.59%。计算相对标准偏差RSD=1.51%。以上试验表明本系统的稳定性和精密度 都较好。3 结果与分析3.1 结果此次实验提取收率为 0.40%，样品中青蒿素的含量 98.59%，达到了中国药典的标准3.2 工艺流程的可行性分析图 3 青蒿素工艺流程图该流程如图 3 是在传统的冷提基础上进行修改、优化而得出的，其可行性表现在：（1）工艺简单，操作容易，周期短，成本底，收率高：1）所需设备简单，在选溶剂 时选用了可回收溶剂石油醚，它降低成本的同时也保护了环境； 2）目前对青蒿素的提 取主要有：水蒸汽蒸馏3、有机溶剂萃取4-6、超临界流体萃取7、微波萃取等方法8。水 蒸汽蒸馏法工艺简单，操作容易，周期较长，成本低，但只适用于青蒿中挥发性成分的提 取，不能提取青蒿素；有机溶剂法提取青蒿素，工艺路线成熟，操作容易，周期短，成本 底，易于工业化；超临界流体萃取和微波萃取周期短，但成本太高，不适用于工业化生产；3）它与传统的冷提相比增加了加热和搅拌，从而缩短了时间，提高了提取效率。（2）溶剂-石油醚（沸程6090C）：在选择溶剂时有乙醚、氯仿、正己烷、石油 醚可选，最后选取了石油醚，是因为参照了文献13，氯仿和乙醚在波长200-240nm之间有 很强的杂质峰，其中氯仿提取产物中杂质峰最强，乙醚次之，此两种溶剂的杂质峰远远大 于石油醚。正己烷虽然杂质峰较弱，但提取率较石油醚低。考虑到乙醚和氯仿的挥发性、 刺激性气味和正己烷回收温度较高，超过了 60C，而青蒿素在温度超过60C以后则过氧 桥结构被很快破坏，完全失去药效。所以 4 种溶剂中石油醚为较适宜的溶剂。（3）吸附剂-硅胶：1）它是应用最广泛的一种吸附剂，化学惰性强，具有较大的 吸附量，易制备不同类型、孔径、表面积的多孔硅胶；2）易再生：用600C的火烧就可 以再生，从而节约能源，降低成本。（4）原料粉碎度-30 目：粉碎是天然产物制备过程中的必要环节，可增加原料的表 面积，促进有效成分的溶解与传递，加速有效成分的浸出；但过细，原料比表面积太大， 吸附作用增强，反而影响扩散速度，同时影响过滤，最终影响提取率15。4 结论本次实验采用热提-柱层析工艺，提取收率为 0.40%，通过分光光度计对样品中青蒿 素的含量测定为98.59%，根据中国药典的要求已达到了药品的标准。实验证明该工艺流程 （图 3）是可行的，它可为改进青蒿素提取工艺、提高回收率、增加青蒿素生产的经济效 益和工厂化生产提供一定的科学依据。参考文献1 于宗德，孙芳华，青蒿素理化性质及其测定方法的研究进展J,江西农业大学学报， 1999,4:606-611.2 陈杨，朱世民，陈洪渊，青蒿素类抗疟研究进展，药学学报，1998，33(3):234-239.3 屠呦呦，药学学报，1981，16(5):366.4 Vonwiller S C，Planta Med，1993，32(5):59-62.5 Klayman D L，J of Nat Prod、2004，47(4):715.6 Singh A，.Planra Med，1998，54(6):474.7 葛发欢，中药材，1995，18(6):316.8 Xu Zhu J，Huang D Z，et al.Tetrahed ron，1986，42:819-828.9 Schmid G，Hofheinz W.J.Am.Chem.Soc.，2005，114:974-979.10 MeiXG，Huang W，Wang C G，Production of taxol by two-phase culture Tax us cell suspensionJ.Bio technology(生物技术)，2000,10(1):10-12.11 Hu P，Yuan Y J， Miao Z Q.Effccts of fed-batch carbohy-drate，nitrogen phosphorus on grow th of Taxus chinensisvar mairei cell during su spension cul tureJ.Chin Tradi t Herb Drugs(中草药)，2002,33(1):28-31.12 Shen X K，Yan K D，L uo Z Y.Determ of artcm is in content by ultravio letme terJ.Chin Pham A nal(药物分析杂志)，1999,3(2):24-26.13 张积强，陈强，青蒿中青蒿素含量的测定，陕西化工1996(3)：34-35.14 韦国锋，覃特云，提取青蒿素实验条件的研究，左江民族医学学报， 1999，17(2)：137.15 李国栋，周全，赵长文，青蒿素类药物的研究现状J,中国药学杂志， 1998,33(7):385.