人类原癌基因N

人类原癌基因 N-Ras 抗体的生物信息学分析原癌基因i (proto-oncogene)是细胞内与细胞增殖相关的基因，是维持机体正常生命 活动所必须的，在进化上高等保守。当原癌基因的结构或调控区发生变异，基因产物增多或 活性增强时，使细胞过度增殖，从而形成肿瘤。癌症，也叫恶性肿瘤，相对的有良性肿瘤。 肿瘤是指机体在各种致瘤因素作用下，局部组织的细胞异常增生而形成的局部肿块。良性肿 瘤容易清除干净，一般不转移、不复发，对器官、组织只有挤压和阻塞作用。但恶性肿瘤还 可以破坏组织、器官的结构和功能，引起坏死出血合并感染，患者最终可能由于器官功能衰 竭而死亡。正常细胞中原癌基因的表达水平一般较低，而且是受生长调节的，其表达主要 有三个特点：具有分化阶段特异性；细胞类型特异性；细胞周期特异性。Ras癌基因可以导致正常细胞发生恶性转化，人类40%的肿瘤和ras基因激活相关。人 类ras基因家族包括H-ras、K-ras和N-ras三个基因。以往大量研究都是关注ras基因突 变与胃癌、肺癌等的关系，缺乏对ras抗体的研究。本文利用生物信息学方法，对人类原癌 基因N-Ras抗体(Anti-NRAS)基因的序列结构与功能进行分析和预测，为以后研究更好的 N-Ras抗体奠定基础。一、材料与方法1. 材料Anti-NRAS基因的核苷酸序列和氨基酸序列来自于NCBI,登录号分别为NM_002524.4 和 NP_002515.1。2. 方法表 1 生物信息学软件名称软件说明网址ProtParam蛋白质一级结构分析http:/expasy.org/tools/protparam.htmlPsipred蛋白质二级结构预测http:/bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/SignalP蛋白质信号肽预测http:/www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/COILS蛋白质卷曲螺旋预测http:/www.ch.embnet.org/software/TMHMM蛋白质跨膜结构预测http:/www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/TargetP蛋白质亚细胞定位预测http:/www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/NetNGlyc蛋白质糖基化位点预测http:/www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/其中蛋白质亲疏水性分析和蛋白质三级结构预测采用matlab分析二、结果与分析1. Anti-NRAS基因的核苷酸序列分析用matlab对核苷酸序列单体密度和联合体密度以及二聚体等性质进行分析，如下图所示：6003000ACGG500、400、200、100、Second Base图3二聚体分布,图 1 单体和联合体密度图 2 核苷酸分布2. Anti-NRAS 基因的氨基酸序列分析通过 ProtParam 软件(http:/expasy.org/tools/protparam.html), 分析 Anti NRAS 蛋白的理化性质，如表1 所示。氨基酸残基数和分子量较小，属于小分子蛋白。带正电的氨 基酸数22小于带负电的氨基酸数28 ，它的不稳定系数28. 98小于40%，所以它属于稳定的 蛋白质。总的平均亲水性为 0.317，是负值，说明它是可溶性蛋白。通过 matlab 分析Anti-NRAS蛋白氨基酸序列的组成和氨基酸原子之间的距离，如图4和图5所示。除了组氨 酸（H）以外，其它的氨基酸的组成成分比例很相似，说明此蛋白的氨基酸丰富oAn ti -NRAS 蛋白序列的氨基酸的原子距离形成了一幅美丽的金鱼图，说明原子间的排列很有规律。表 2 氨基酸的理化性质氨基酸个数：189原子组成：C927H1479N251O294S12分子量：21229.1不稳定系数：28.98理论等电点：5.01脂肪系数：82.96Asp + Glu 个数：28总平均亲水性：-0.317Arg + Lys 个数：22消光系数：0.661121原子个数：2963Chain A: I nt er-atomic distances1000200400600800|1-i叫.1-12UU图4 Anti-NRAS蛋白的氨基酸组成图5 Anti-NRAS蛋白原子之间的距离分布图3. Anti-NRAS蛋白的表面亲疏水性分析疏水作用是蛋白质折叠的主要驱动力。一般通过亲疏水性分布图（Hydropathy profile） 来反映蛋白质的折叠情况，其次，氨基酸亲疏水性分析为蛋白质二级结构预测提提供佐证， 是分析蛋白跨膜区的第一步。蛋白质折叠时会形成疏水内核与亲水表面,同时,在潜在跨膜区出现高疏水值区域。可以测定跨膜螺旋等二级结构和蛋白质表面的氨基酸分布。通过matlab中的Kyte and Doolittle算法对Anti-NRAS蛋白进行亲疏水性预测（图5）, 其中正值表示疏水，负值表示亲水。结果表明，Anti-NRAS蛋白的疏水区（score0）分布 在 23-44,64-79,99-110,130-140,159-162,180-182 这五个区域内， 而极强亲水区在16,60,89,124,150,170 等附近。从图中可以看出，亲水的面积是要大于疏水的面积的，总 体为亲水性，与上面的理化分析是一致的。4. Anti-NRAS 蛋白的信号肽分析4信号肽是位于蛋白质 N 端的一段氨基酸序列，用于引导蛋白质细胞的正确定位以及跨 膜的运输，利用SignalP对Anti-NRAS蛋白进行信号肽的预测,分析结果如图7和表3所示， 标记为C的行是剪切位点打分，标记为S的行是信号肽打分，标记为Y的行是综合接切点打 分。判断是否为分泌蛋白，通过S平均值(mean S-score)来判断，若S平均值0.5，则预 测为分泌蛋白，存在信号肽。由上述结果可知，S=0.1180.5,说明该蛋白不是分泌蛋白，不 存在信号肽。MeasurePositionValueCutoffsignal peptide?max. C190.120max. Y190.120max. S40.137mean S1-180.118D1-180.1190.450NO5. Anti-NRAS 蛋白卷曲螺旋预测卷曲螺旋是一种蛋白质超二级结构，是由2股或2股以上a -螺旋相互缠绕形成麻花状 结构，也是控制蛋白质寡聚化的元件,它存在于多种蛋白质中，许多具有重要生物学功能， 如基因表达调控中的转录因子，蛋白质中含有卷曲螺旋。利用，COILS(网址： htt p:/www.ch.embnet.org/sof tware/COILS_form.h tml)网络工具进行预测。由预测图形(图7)可知，该蛋白序列有四个卷曲螺旋，第一个位于41-77，第二个位 于 85-109，第三个位于 122-137，第四个位于 141-180。E；i .j i n d u I-J =14图8 Coils预测蛋白图形显示结果6. Anti-NRAS蛋白跨膜结构预测跨膜结构域，常常是由跨膜蛋白的效应区域所展现。跨膜蛋白，即跨越膜的两端的蛋 白质，其跨膜部分为B折叠或a螺旋结构，对正确认识和理解蛋白质的功能、结构、分类、 定位有重要的指导意义。利用网络跨膜分析程序TMHMM对Ant i-NRAS蛋白进行跨膜结构预测，结果（图9和表4） 表明，Anti-NRAS蛋白存在细胞膜外，没有跨膜区。图9 Anti-NRAS蛋白跨膜结构TMHMM posterior probabilities for Sequence1.28,=qEqod4.2204060SO100120140160 180transmembraneinsideoutside表4 Anti-NRAS蛋白跨膜结构文本显示结果SequenceTMHMM2.0outside11897. Anti-NRAS蛋白亚细胞定位预测利用 http:/www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/对 Anti-NRAS 蛋白亚细胞定位进行 预测，结果如表8,其中，“cTP” “mTP” “SP” “other”分别表示最终预测为叶绿体转运 肽，线粒体导肽、信号肽、其它类型的分值，这些值不表示真正意义上的可能性，但它们最 高值可能就是TargetP所预测的定位。“Loc”表示基于上面分值所预测的可能定位，表示 除前面三除外的其他位置。从表5中可以看出，Anti-NRAS蛋白不位于线粒体，核糖体等细 胞器，而位于除上面所说的之外的细胞器中。表 5 Anti-NRAS 蛋白亚细胞定位预测NameLenmTPSPotherLocRCAnti-NRAS 蛋白1890.0830.1890.80428.Anti-NRAS 蛋白质结构域分析通过 PFSCAN (网址：http:/hits.isb-sib.ch/cgi-bin/PFSCAN)对 Anti-NRAS 蛋白 质结构域分析，由图11和表9可知，Anti-NRAS蛋白可能存在一个结构域，位于5T65。LVVVGAGGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTI-EDSYRKQVVIDGETCLLDILDTAGQEEYSAMRQYMRTGEGFLCVFAINNSKSFADINLYREQIKRVKDSDD-VPMVLVGNKCDLPTE AIUIU AGFHY GN FTVDTKQAHELAKSYG-IPFIETSAKTRQGVEDAFYTLVREIRQ图 10 Anti-NRAS 蛋白质结构域分布图表5 Anti-NRAS蛋白质结构域打分结果posRaw-scoreN-scoreE-value5-165323.2104.1221.6 e-979.Anti-NRAS 蛋白糖基化位点预测利用糖基化位点网站 http:/www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/预测 Anti-NRAS 蛋 白质在人类蛋白质中的糖基化位点，由图11 和表 6 可知， Anti-NRAS 蛋白质含有两个糖基化位点，分别为85位的NNSK, 172位的NSSD，其他位点的可能性相对较小。NetNG1 yc 1 B ： pred i cted N-g 1 ycosy 1 at i on s i tes i n Seque门匚;eFotent i a 1T h r e s h o 1 dccIFmIRSCo=nIdlz:4060100120140160180图11 Anti-NRAS蛋白糖基化位点预测表6 Anti-NRAS蛋白糖基化位点及分数PositionPotentialJury agreement N-Glyc result85NNSKA0.5394(4/9)+172NSSD0.6062(6/9)+10- Anti-NRAS蛋白的二级结构预测6蛋白质二级结构中C表示coil (无规则卷曲)，H表示helix(a-螺旋)，E表示 ext ended(卩折叠)， 利用 Psipred prot ein structure predic tion server (网址 http:/bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)对 Anti-NRAS 蛋白的二级结构预测，从图 12 可知， a螺旋占31.2% (59AA)，无规则卷曲占9.52% (18AA)，没有卩折叠。1MTEYKLVVVGAGGVGKSALTIQLIQITHFVDEYDPTIEDSYRKQVVIDGET50 51CLLDILDTAGQEEYSAMRDQYHRTGEGFLCVFAIMHSKSFADIKLYREQI100 101KRVKDSDDPHLGHKCDLPrRrDTKQAHELAKSTGIPFIETSAKrRQ150 151GVEDAFYTLVREIRQYRMKKLKSSDDGTQGCMGLPCVVHKeyHelixSheetDisorderedDompred BoundaryDomSSEA BoundaryAnnotationsml|T|Q10.000。八 SO. -旋養曲蝮折卷_ -图12 Anti-NRAS蛋白二级结构上11. Anti-NRAS蛋白质三级结构分析蛋白质三级结构的预测和分析，对理解蛋白质结构和功能之间的关系有着极其重要的 意义。利用 PDB 数据库，网址：http:/www.rcsb.org/pdb/home/home.do 得出 E-Value: 1.89644E-92, Score:858,再利用 mat lab 中的 molviewer 函数显示三级结构（图 11）,然后利用matlab中的ramachandran函数进行Anti-NRAS蛋白质三维立体分子结构的 预测（图12），Ram-achandran plots是反映立体化学质量的参数，它通过分析角和角 的分布方式大致评估模拟的结构是否与自然结构趋势相同。预测蛋白质残基的二面角有90% 以上位于红色区域，表明Anti-NRAS蛋白具有有稳定的空间结构。线框模型wirtframe model卡通模型Cartoon mod&tOO853O5453O 59 4随着人类基因组计划的完成,生物科学从基因组时代进入了后基因组时代生物信息学 作为分子生物学和计算机技术高度结合的交叉学科，已经广泛应用在预测蛋白质结构和功能 以及确定蛋白质生物学特性等研究领域，在后基因组时代必将扮演着重要的角色。本文利用 生物信息学的各种软件及在线工具，对Anti-NRAS蛋白的结构和功能进行预测和分析。预测蛋白序列中卷曲螺旋的位置是当前生物信息学中重要的研究课题8， 因为通过对 蛋白质卷曲螺旋的预测能为该蛋白的功能研究提供重要线索。分析发现，Anti-NRAS基因蛋 白存在 4个卷曲螺旋，卷曲螺旋的特异性作用常常形成二聚体，卷曲螺旋这种结构模式简单 而有规律。预测蛋白质序列中跨膜螺旋的位置是当前生物信息学中重要的研究课题，因为通过膜 蛋白跨膜结构预测能为蛋白的功能研究提供重要的线索。目前对Anti-NRAS蛋白的结构研究还很少，我们对Anti-NRAS蛋白进行了理化性质、 信号肽、跨膜分析、亚细胞定位等分析。同时我们对Anti-NRAS蛋白的二级结构的预测以及 对三级结构的同源建模预测，对 Anti-NRAS 蛋白有了一个全面的了解，为进一步阐明 Anti-NRAS基因在细胞内的生物学调控机制提供了线索。