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LOGO创新化学实验与研讨基金资助工程争辩创新化学实验与研讨基金资助工程争辩D-D-丝氨酸的毛细管电泳丝氨酸的毛细管电泳-非接触式电导非接触式电导分别检测研讨分别检测研讨专业：化学工程与工艺专业：化学工程与工艺导师：谢天尧导师：谢天尧 副教授副教授报告人：韦昱报告人：韦昱 07306407LOGOD-丝氨酸的毛细管电泳丝氨酸的毛细管电泳-非接触式电导分别检测研讨非接触式电导分别检测研讨实验及实验及讨论讨论研讨方案研讨方案研讨背景研讨背景选题选题意义意义结论结论LOGOD-丝氨酸的毛细管电泳丝氨酸的毛细管电泳-非接触式电导分别检测研讨非接触式电导分别检测研讨u选题意义选题意义uD-D-丝氨酸是哺乳动物脑内丝氨酸是哺乳动物脑内NMDANMDA型谷氨型谷氨酸受体酸受体(NR1/NR2(NR1/NR2型型)的辅助激动剂，在的辅助激动剂，在动物的大脑中终身都维持着很高的浓动物的大脑中终身都维持着很高的浓度；脑内的神经元和胶质细胞都含有度；脑内的神经元和胶质细胞都含有D-D-丝氨酸并且具有特异的生物合成、丝氨酸并且具有特异的生物合成、胞外释放、摄取和降解途径。胞外释放、摄取和降解途径。uD-D-丝氨酸作为一种重要的胶质细胞递丝氨酸作为一种重要的胶质细胞递质，在中枢神经系统参与调理突触可质，在中枢神经系统参与调理突触可塑性、觉得信息传送、神经发育及神塑性、觉得信息传送、神经发育及神经兴奋性毒性等生理及病理过程经兴奋性毒性等生理及病理过程,并逐并逐渐成为阿尔采末病渐成为阿尔采末病(AD)(AD)等神经系统疾等神经系统疾病新的治疗靶点。病新的治疗靶点。LOGOD-丝氨酸的毛细管电泳丝氨酸的毛细管电泳-非接触式电导分别检测研讨非接触式电导分别检测研讨u研讨背景研讨背景u如何分别检测如何分别检测D-D-丝氨酸？丝氨酸？u针对其外消旋体的拆分已开发了优先针对其外消旋体的拆分已开发了优先结晶法、构成非对映体立体异构体结结晶法、构成非对映体立体异构体结晶法、酶促法、色谱法包括：液相晶法、酶促法、色谱法包括：液相色谱、气相色谱、薄层色谱、配位色色谱、气相色谱、薄层色谱、配位色谱、离子交换色谱毛细管电泳法和谱、离子交换色谱毛细管电泳法和萃取法等。萃取法等。u存在的问题：存在的问题：u丝氨酸由于其构造简单，分别难度较丝氨酸由于其构造简单，分别难度较大，且没有紫外或荧光吸收，常需衍大，且没有紫外或荧光吸收，常需衍生后才可得到检测。生后才可得到检测。u 如何建立如何建立D-SerD-Ser有效检测的快速方有效检测的快速方法，大大降低检测本钱，仍是分析任法，大大降低检测本钱，仍是分析任务者面临的具有挑战性的课题。务者面临的具有挑战性的课题。LOGOD-丝氨酸的毛细管电泳丝氨酸的毛细管电泳-非接触式电导分别检测研讨非接触式电导分别检测研讨u研讨背景研讨背景u高效毛细管电泳高效毛细管电泳HPCEHPCE是一类以毛细是一类以毛细管为分别通道，以高压直流电场为驱动管为分别通道，以高压直流电场为驱动力的新型液相分别分析技术，因具有低力的新型液相分别分析技术，因具有低耗、快速、高效、环境友好等特点而成耗、快速、高效、环境友好等特点而成为新兴的手性分别分析中极具吸引力的为新兴的手性分别分析中极具吸引力的分析方法。非接触电导检测是近年来出分析方法。非接触电导检测是近年来出现的新的检测技术，对于缺乏紫外现的新的检测技术，对于缺乏紫外-可见可见吸收基团氨基酸那么无须先作衍生化处吸收基团氨基酸那么无须先作衍生化处置置,可以进展直接检测。可以进展直接检测。LOGOD-丝氨酸的毛细管电泳丝氨酸的毛细管电泳-非接触式电导分别检测研讨非接触式电导分别检测研讨u研讨方案研讨方案u本课题提出采用高效毛细管电泳本课题提出采用高效毛细管电泳-非接非接触式电导法，以铜触式电导法，以铜-L-L-精氨酸作为配体精氨酸作为配体交换选择剂，与羟丙基甲基纤维素交换选择剂，与羟丙基甲基纤维素HPMCHPMC构成二元手性选择体系，建构成二元手性选择体系，建立快速、灵敏和低本钱的立快速、灵敏和低本钱的D-D-丝氨酸的丝氨酸的分别分析新方法。分别分析新方法。LOGOD-丝氨酸的毛细管电泳丝氨酸的毛细管电泳-非接触式电导分别检测研讨非接触式电导分别检测研讨u分别分析原理分别分析原理u毛细管电泳是以高压直流电场为驱动毛细管电泳是以高压直流电场为驱动力，以毛细管为分别通道，根据样品力，以毛细管为分别通道，根据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差中各组分之间淌度和分配行为上的差别而实现高效，快速的新型液相分别别而实现高效，快速的新型液相分别分析技术；而非接触式电导检测器是分析技术；而非接触式电导检测器是近年开展起来的一种新型电导检测方近年开展起来的一种新型电导检测方法。法。LOGOD-丝氨酸的毛细管电泳丝氨酸的毛细管电泳-非接触式电导分别检测研讨非接触式电导分别检测研讨u实验部分实验部分u仪器和试剂仪器和试剂u手性选择体系的选择手性选择体系的选择u最正确实验条件确实定最正确实验条件确实定u线性范围、重现性、检出限测定线性范围、重现性、检出限测定LOGOD-丝氨酸的毛细管电泳丝氨酸的毛细管电泳-非接触式电导分别检测研讨非接触式电导分别检测研讨u仪器仪器CES2019型毛细管电泳仪型毛细管电泳仪LOGOD-丝氨酸的毛细管电泳丝氨酸的毛细管电泳-非接触式电导分别检测研讨非接触式电导分别检测研讨u实验试剂实验试剂u氢氧化钠氢氧化钠(NaOH(NaOH，广州化学试剂厂，分，广州化学试剂厂，分析纯析纯)、柠檬酸、柠檬酸(Cit(Cit，广州化学试剂厂，广州化学试剂厂，分析纯分析纯)、乙酸铜、乙酸铜(Cu(CH3COO)2H2O(Cu(CH3COO)2H2O，天津市科密欧化学试剂开发中心，分天津市科密欧化学试剂开发中心，分析纯析纯)、羟丙基甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素(HPMC(HPMC，山，山东赫达股份，分析纯东赫达股份，分析纯)、D,L-D,L-丝氨酸、丝氨酸、L-L-丝氨酸丝氨酸(D,L-Ser(D,L-Ser、L-SerL-Ser，国药集团，国药集团化学试剂，层析纯化学试剂，层析纯)、L-L-精氨酸精氨酸(L-Arg(L-Arg，上海伯奥生物科技，层析纯上海伯奥生物科技，层析纯)。所用水。所用水为超纯水。为超纯水。LOGOD-丝氨酸的毛细管电泳丝氨酸的毛细管电泳-非接触式电导分别检测研讨非接触式电导分别检测研讨u手性选择体系的选择手性选择体系的选择仅用Cu()丝氨酸对映体未能到达分别Cu()+L-Arg分别度Rs=1.6Cu()-L-Arg+HPMC分别度Rs=2.1LOGOD-丝氨酸的毛细管电泳丝氨酸的毛细管电泳-非接触式电导分别检测研讨非接触式电导分别检测研讨u手性选择体系的选择手性选择体系的选择u图图1 1 两种不同的手性选择体系对分别两种不同的手性选择体系对分别度的影响度的影响uFig.1 The effect of two Fig.1 The effect of two different chiral selectors on the different chiral selectors on the resolutionresolutionua.Cu()-L-Arg a.Cu()-L-Arg b.Cu()-L-Arg-HPMCb.Cu()-L-Arg-HPMC26.027.028.029.030.031.0-150-100-50050Signal/mVUt/minDLa27.028.029.030.031.032.033.0-10-50510DLbSignal/mVt/minLOGOD-丝氨酸的毛细管电泳丝氨酸的毛细管电泳-非接触式电导分别检测研讨非接触式电导分别检测研讨u铜离子浓度对分别度的影响铜离子浓度对分别度的影响u图图2 Cu()2 Cu()浓度对分别度的影响浓度对分别度的影响uFig.2 The effect of Cu()Fig.2 The effect of Cu()concentration on the resolutionconcentration on the resolutionu本实验选择本实验选择Cu()Cu()的最正确浓度为的最正确浓度为2.5mmol/L2.5mmol/L。2.02.22.42.62.81.61.82.02.2RsC/mmol L-1LOGOD-丝氨酸的毛细管电泳丝氨酸的毛细管电泳-非接触式电导分别检测研讨非接触式电导分别检测研讨uL-精氨酸浓度对分别度的影响精氨酸浓度对分别度的影响u图图3 L-精氨酸浓度对分别度的影响精氨酸浓度对分别度的影响uFig.3 The effect of L-Arg concentration on the resolutionu本实验选择本实验选择L-精氨酸的最正确浓度为精氨酸的最正确浓度为5.0 mmol/L。LOGOD-丝氨酸的毛细管电泳丝氨酸的毛细管电泳-非接触式电导分别检测研讨非接触式电导分别检测研讨uHPMCHPMC浓度对分别度的影响浓度对分别度的影响u图图4 HPMC4 HPMC浓度对分别度的影响浓度对分别度的影响uFig.4 The effect of HPMC Fig.4 The effect of HPMC concentration on the resolutionconcentration on the resolutionu因此，本实验选择因此，本实验选择HPMCHPMC最正确浓度为最正确浓度为10 mg/L10 mg/L。051015201.41.61.82.02.22.42.6RsC/mg L-1LOGOD-丝氨酸的毛细管电泳丝氨酸的毛细管电泳-非接触式电导分别检测研讨非接触式电导分别检测研讨u缓冲溶液的组成、浓度及缓冲溶液的组成、浓度及pH的影响的影响uNaOH-Cit体系在非接触电导检测法中体系在非接触电导检测法中有良好的基线和灵敏的呼应，但缓冲有良好的基线和灵敏的呼应，但缓冲溶液浓度太高易引起基线漂移。经过溶液浓度太高易引起基线漂移。经过实验发现，柠檬酸浓度对对映体分别实验发现，柠檬酸浓度对对映体分别的影响很大，浓度太低，丝氨酸不出的影响很大，浓度太低，丝氨酸不出峰；浓度太高，水峰提早，对映体也峰；浓度太高，水峰提早，对映体也得不到分别，见下表。得不到分别，见下表。u表表1 柠檬酸浓度对分别度的影响柠檬酸浓度对分别度的影响u故实验选择故实验选择Cit浓度为浓度为0.4 mmol/L。CCit(mmol/L)0.20.40.60.81.0Resolution(Rs)-2.31.8-LOGOD-丝氨酸的毛细管电泳丝氨酸的毛细管电泳-非接触式电导分别检测研讨非接触式电导分别检测研讨u缓冲溶液的组成、浓度及缓冲溶液的组成、浓度及pH的影响的影响u固定柠檬酸浓度后，参与固定柠檬酸浓度后，参与NaOH以调以调理运转液的理运转液的pH。在。在24 mmol/L浓度浓度范围内调查范围内调查NaOH浓度对分别度的影浓度对分别度的影响，见表响，见表2。u表表2 NaOH浓度对分别度的影响浓度对分别度的影响u故实验选择故实验选择NaOH浓度为浓度为3.0 mmol/L。CNaOH(mmol/L)2.02.43.03.44.0Resolution(Rs)0.91.62.41.91.9LOGOD-丝氨酸的毛细管电泳丝氨酸的毛细管电泳-非接触式电导分别检测研讨非接触式电导分别检测研讨u缓冲溶液的组成、浓度及缓冲溶液的组成、浓度及pH的影响的影响u图图5 pH对分别度的影响对分别度的影响uFig.5 The effect of pH on the resolutionLOGOD-丝氨酸的毛细管电泳丝氨酸的毛细管电泳-非接触式电导分别检测研讨非接触式电导分别检测研讨1电动进样电动进样对离子组分存在对离子组分存在进样歧视进样歧视2重力进样重力进样无进样歧视无进样歧视3分散进样分散进样进样具双向性，进样具双向性，有进样歧视有进样歧视u进样方式的选择进样方式的选择故本实验采用重力进样。故本实验采用重力进样。LOGOD-丝氨酸的毛细管电泳丝氨酸的毛细管电泳-非接触式电导分别检测研讨非接触式电导分别检测研讨u进样方式的选择进样方式的选择u图图6 进样时间对分别度的影响进样时间对分别度的影响uFig.6 The effect of injection time on the resolutionu进样时间为进样时间为60s时分别度最高，时分别度最高，Rs=2.6。LOGOD-丝氨酸的毛细管电泳丝氨酸的毛细管电泳-非接触式电导分别检测研讨非接触式电导分别检测研讨u进样方式的选择进样方式的选择u此外，进样时间还对峰高及峰面积有此外，进样时间还对峰高及峰面积有较大影响，见表较大影响，见表3。u表表3 进样时间的影响进样时间的影响u故实验选择故实验选择Cit浓度为浓度为0.4 mmol/L。进样时间进样时间（s）304050607080100120峰高L-Ser4955748410010513964D-Ser51689210912212917082峰面积L-Ser10611460211926832916296245701444D-Ser11021683268833843354346850651850LOGOD-丝氨酸的毛细管电泳丝氨酸的毛细管电泳-非接触式电导分别检测研讨非接触式电导分别检测研讨u分别电压的选择分别电压的选择u本实验调查了分别电压从本实验调查了分别电压从10kV至至15kV对丝氨酸对映体分别的影响，见对丝氨酸对映体分别的影响，见表表4。u表表4 分别电压对迁移时间和分别度的分别电压对迁移时间和分别度的影响影响u故实验选择故实验选择Cit浓度为浓度为0.4 mmol/L。working voltage(kV)1012131415Resolution(Rs)2.62.32.01.81.6Migrating time of D-Ser(min)48.832.726.523.521.8LOGOD-丝氨酸的毛细管电泳丝氨酸的毛细管电泳-非接触式电导分别检测研讨非接触式电导分别检测研讨运转液体系：运转液体系：3.0 mmol/L NaOH+0.4 mmol/L Cit+2.5 mmol/L Cu(Ac)2+5.0 mmol/L L-Arg+10.0 mg/L HPMCpH=9.67重力进样，进样时间为60s分别电压为13kV 最正确实验条件LOGOD-丝氨酸的毛细管电泳丝氨酸的毛细管电泳-非接触式电导分别检测研讨非接触式电导分别检测研讨u线性范围与检出限线性范围与检出限u图图7 D-7 D-丝氨酸线性校正曲线图丝氨酸线性校正曲线图u表表5 5 线性范围与检出限线性范围与检出限 待测组分待测组分回归方程回归方程相关系数相关系数线性范围线性范围（mg/L）检出限检出限（mg/L）D-丝氨酸y=-123.8+981.9xr=0.99991100 0.5LOGOD-丝氨酸的毛细管电泳丝氨酸的毛细管电泳-非接触式电导分别检测研讨非接触式电导分别检测研讨u重现性测定重现性测定u在一样条件下，在一样条件下，D-Ser以以3 mg/L的浓的浓度反复进样度反复进样4次，测其重现性，见表次，测其重现性，见表6。u表表6 重现性测定重现性测定u结果阐明：实验证明本方法具有较高结果阐明：实验证明本方法具有较高的灵敏度和良好的重现性。的灵敏度和良好的重现性。序号序号1234RSD/%迁移时间（min）23.124.722.623.33.9峰面积24002473261626805.0LOGOu实践样品分析实践样品分析u图图8 D-8 D-丝氨酸小鼠脊髓样品丝氨酸小鼠脊髓样品HPCE-C4DHPCE-C4D谱谱图图uFig.8 The electropherogram of D-Fig.8 The electropherogram of D-Ser in rat spinal cord Ser in rat spinal cord D-丝氨酸的毛细管电泳丝氨酸的毛细管电泳-非接触式电导分别检测研讨非接触式电导分别检测研讨-4.10.04.18.312.416.520.724.828.933.1-40-200204060D-SerineSignal/mVt/minLOGOD-丝氨酸的毛细管电泳丝氨酸的毛细管电泳-非接触式电导分别检测研讨非接触式电导分别检测研讨u拆分机理初步讨论拆分机理初步讨论u在缓冲溶液中，铜离子与在缓冲溶液中，铜离子与L-精氨酸以精氨酸以1 2构成三元络合物：构成三元络合物：uL-Arg+Cu()(L-Arg)CuuL-Arg+(L-Arg)Cu()Cu(L-Arg)2u当丝氨酸对映体进入缓冲系统时，当丝氨酸对映体进入缓冲系统时，D-Ser和和L-Ser分别取代一分子的分别取代一分子的L-Arg,构成两种不同的三元络合物构成两种不同的三元络合物:uL-Ser+Cu(L-Arg)2 (L-Arg)Cu(L-Ser)+L-ArguD-Ser+Cu(L-Arg)2 (L-Arg)Cu(D-Ser)+L-ArgLOGOD-丝氨酸的毛细管电泳丝氨酸的毛细管电泳-非接触式电导分别检测研讨非接触式电导分别检测研讨u拆分机理初步讨论拆分机理初步讨论u根据根据(L-Arg)Cu(L-Ser)和和(L-Arg)Cu(D-Ser)稳定性和光学构造的差稳定性和光学构造的差别，引起二者电泳淌度的不同，别，引起二者电泳淌度的不同，D,L-Ser得到分别，本实验中得到分别，本实验中L-Ser比比D-Ser先流出。先流出。u由于由于(L-Arg)Cu(L-Ser)和和(L-Arg)Cu(D-Ser)的稳定性系数差别不够的稳定性系数差别不够大，丝氨酸对映体分别度较小。缓冲大，丝氨酸对映体分别度较小。缓冲溶液中参与溶液中参与HPMC后，后，HPMC与与Cu()-L-Arg构成二元手性选择体系，构成二元手性选择体系，D,L-Ser分别度提高。分别度提高。LOGOD-丝氨酸的毛细管电泳丝氨酸的毛细管电泳-非接触式电导分别检测研讨非接触式电导分别检测研讨u结论结论u从实验结果可以看出，本实验提出的从实验结果可以看出，本实验提出的采用高效毛细管电泳采用高效毛细管电泳-非接触式电导法，非接触式电导法，以铜以铜-L-精氨酸作为配体交换选择剂，精氨酸作为配体交换选择剂，与羟丙基甲基纤维素与羟丙基甲基纤维素HPMC构成构成二元手性选择体系分别检测二元手性选择体系分别检测D-丝氨酸丝氨酸的新方法，高效简便、环境友好、本的新方法，高效简便、环境友好、本钱低、检出限低，可用于实践样品的钱低、检出限低，可用于实践样品的分析运用。分析运用。LOGO赞赏中山大学化学院创新研讨基金的资助！赞赏谢天尧教师的悉心指点！赞赏袁秋月师姐对本实验给予的耐心的指点和协助！报告人：报告人：0707化工化工 韦昱韦昱
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