蛋白质的测定使用凯氏定氮法解说

项目七项目七食品中蛋白质及氨基食品中蛋白质及氨基酸态氮的测定酸态氮的测定【学习目标学习目标】v1、掌握食品中氮含量与蛋白质含量之间的换、掌握食品中氮含量与蛋白质含量之间的换算。算。v2、掌握凯氏定氮装置的搭建技术。、掌握凯氏定氮装置的搭建技术。v3、掌握蛋白质的测定技术。、掌握蛋白质的测定技术。【基础知识基础知识】v1、蛋白质及氨基酸概述、蛋白质及氨基酸概述v蛋白质由两性氨基酸通过肽键结合在一起的大分子化合物，蛋白质由两性氨基酸通过肽键结合在一起的大分子化合物，它主要含的元素是它主要含的元素是C、H、O、N。v一般来说，一般来说，pro的的平均含氮量为平均含氮量为16/100，既一份氮相当于份，既一份氮相当于份蛋白质，此数值称为蛋白质系数。蛋白质，此数值称为蛋白质系数。v所以在用凯氏定氮法定量所以在用凯氏定氮法定量pro时，将测得的总氮时，将测得的总氮%乘上乘上pro的的换算系数换算系数即为该物质的即为该物质的pro含量。含量。v注意：注意：v含含N是蛋白质区别其他有机化合物的主要标志。是蛋白质区别其他有机化合物的主要标志。v不同种类食品的蛋白质系数有所不同，如玉米、荞麦、青豆、鸡蛋等不同种类食品的蛋白质系数有所不同，如玉米、荞麦、青豆、鸡蛋等为，花生为，大米为，大豆及其制品为，小麦粉为、全小麦、大麦、燕为，花生为，大米为，大豆及其制品为，小麦粉为、全小麦、大麦、燕麦、裸麦和小米是；硬果类为；麦、裸麦和小米是；硬果类为；牛乳及其制品为。牛乳及其制品为。2、原理、原理v蛋白质是含氮的有机化合物。食品与蛋白质是含氮的有机化合物。食品与硫酸硫酸和和硫酸铜硫酸铜、硫酸钾硫酸钾一同一同加热消化加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸胺。然后酸胺。然后碱化蒸馏碱化蒸馏使氨游离，用使氨游离，用硼酸吸收硼酸吸收后以硫酸或后以硫酸或盐酸盐酸标准溶液标准溶液滴定滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质的含量。的含量。v氨基酸氨基酸HClNv注意注意v此法测定得到的蛋白质含量，实际上包括核酸、生物碱、含氮类脂、叶此法测定得到的蛋白质含量，实际上包括核酸、生物碱、含氮类脂、叶啉和含氮色素等非蛋白质氮化合物，故称为啉和含氮色素等非蛋白质氮化合物，故称为粗粗pro。结果处理滴定2HCLOB)NH（吸收BOH2NH蒸馏NaOHSO)(NH消化催化剂SOH）2N样品（7424333424423、适用范围、适用范围v国家标准第一法国家标准第一法v适用于各种食品中蛋白质的测定适用于各种食品中蛋白质的测定4、任务分解、任务分解v任务一：任务一：湿法消化湿法消化v任务二：任务二：碱法蒸馏碱法蒸馏v 硼酸吸收硼酸吸收v任务三：任务三：盐酸滴定盐酸滴定v任务四：任务四：数据记录与计算数据记录与计算任务一：湿法消化任务一：湿法消化v子任务子任务1：仪器及试剂的准备：仪器及试剂的准备v仪器：仪器：子任务子任务1：仪器及试剂的准备：仪器及试剂的准备试剂试剂作用作用硫酸铜硫酸铜a催化作用催化作用：加速有机物的氧化分解。：加速有机物的氧化分解。b消化完全的指示剂消化完全的指示剂：蓝绿色，澄清，透明；：蓝绿色，澄清，透明；c蒸馏时碱性反应的指示剂蒸馏时碱性反应的指示剂：变深蓝色或产生黑：变深蓝色或产生黑色沉淀色沉淀硫酸钾硫酸钾提高溶液沸点提高溶液沸点，从而加快有机物分解，从而加快有机物分解 浓硫酸浓硫酸氧化作用氧化作用：有机物质氧化分解为：有机物质氧化分解为H2O和和CO2子任务子任务2：样品预处理：样品预处理固体试样固体试样 0.22g半固体试样半固体试样 25g液体试样液体试样 1025g样品充分混匀样品充分混匀直接消化直接消化子任务子任务3：样品称量、消化：样品称量、消化奶粉奶粉硫酸铜硫酸铜6g6g硫酸钾硫酸钾20mL20mL浓硫酸浓硫酸玻璃珠玻璃珠小火加热炭化小火加热炭化至泡沫完全停止至泡沫完全停止轻摇轻摇 大火加热大火加热保持瓶中液体微沸保持瓶中液体微沸至蓝绿色澄清透明至蓝绿色澄清透明继续加热继续加热1h冷却冷却加加20mL水水冷却冷却同时做试剂同时做试剂空白试验空白试验思考思考v1 1、玻璃珠的作用？、玻璃珠的作用？v2 2、小漏斗的作用？、小漏斗的作用？v3 3、消化过程为什么要不断转动凯氏瓶？、消化过程为什么要不断转动凯氏瓶？v4 4、开始消化时为什么用小火？、开始消化时为什么用小火？v5 5、消化液不易澄清透明时可采用的措施？、消化液不易澄清透明时可采用的措施？v6 6、消化完成时的产物？、消化完成时的产物？v7 7、加、加20mL20mL水的作用？水的作用？v8 8、空白试验的目的？、空白试验的目的？任务二：碱法蒸馏、硼酸吸收任务二：碱法蒸馏、硼酸吸收v子任务子任务1：仪器及试剂的准备：仪器及试剂的准备v仪器：仪器：10mL100mL 3只只子任务子任务1：仪器及试剂的准备：仪器及试剂的准备v水蒸气发生器：水蒸气发生器：v装水至装水至2/32/3处，加入数粒处，加入数粒玻璃珠玻璃珠，加，加甲基橙指示剂甲基橙指示剂数滴及数滴及硫酸硫酸数数mlml，使水呈微红色，使水呈微红色按上图所示搭好按上图所示搭好装置装置v注意注意v装置搭建好了之后要先进行捡漏，利用虹吸原理。装置搭建好了之后要先进行捡漏，利用虹吸原理。v在蒸汽发生瓶中要加在蒸汽发生瓶中要加甲基橙指示剂甲基橙指示剂数滴及数滴及硫酸硫酸数数mlml以使其以使其始终保持酸性，以防水中氨蒸出。始终保持酸性，以防水中氨蒸出。子任务子任务1：仪器及试剂的准备：仪器及试剂的准备v试剂：试剂：v40%40%氢氧化钠氢氧化钠v20%20%硼酸溶液硼酸溶液v混合指示剂混合指示剂v1 1、1 1份份甲基红乙醇溶液甲基红乙醇溶液（1g/L1g/L）与）与5 5份份溴甲酚绿乙醇溴甲酚绿乙醇溶液溶液（1g/L1g/L）临用时混合）临用时混合 酒红色酒红色绿色绿色v2 2、2 2份份甲基红乙醇溶液（甲基红乙醇溶液（1g/L1g/L）与与1 1份份亚甲基蓝乙醇亚甲基蓝乙醇溶液溶液（1g/L1g/L）临用时混合）临用时混合 紫红色紫红色绿色绿色子任务子任务2：碱化蒸馏、硼酸吸收：碱化蒸馏、硼酸吸收v硼酸溶液硼酸溶液 100mL100mL三角瓶三角瓶 加加1 12 2滴混合指示剂滴混合指示剂 冷凝管下端插入三角瓶液面下冷凝管下端插入三角瓶液面下 准确吸取准确吸取10mL10mL试试样样 由小玻杯流入反应室由小玻杯流入反应室 少量水洗涤小漏斗少量水洗涤小漏斗 盖紧玻璃塞盖紧玻璃塞 量筒取溶液量筒取溶液 倒入小玻杯倒入小玻杯 提起玻提起玻塞使其缓慢流入反应室塞使其缓慢流入反应室 立即塞紧玻璃塞立即塞紧玻璃塞 加水加水于小玻杯防漏气于小玻杯防漏气 通蒸汽通蒸汽 颜色变化时开始计时颜色变化时开始计时蒸馏蒸馏5min 5min 移动接受瓶使液面离开冷凝管下端移动接受瓶使液面离开冷凝管下端 再蒸馏再蒸馏1min 1min 用少量水冲洗冷凝管下端外部用少量水冲洗冷凝管下端外部 取取下接收瓶下接收瓶 v注意v加入NaOH一定要过量，判断NaOH是否过量的方法，看反应室内液体颜色v加碱加碱足量的判断：足量的判断：v溶液溶液会变成会变成深蓝色深蓝色或或产生黑色沉淀产生黑色沉淀v原理：原理：过量过量的氢氧化钠会跟硫酸铜反应生成的氢氧化钠会跟硫酸铜反应生成氢氧化氢氧化铜蓝色沉淀铜蓝色沉淀，蓝色沉淀在加热的情况下会分解成，蓝色沉淀在加热的情况下会分解成黑黑色的氧化铜沉淀色的氧化铜沉淀。v如果没有上述现象，说明氢氧化钠加的量不足，需如果没有上述现象，说明氢氧化钠加的量不足，需要继续加入氢氧化纳，直到产生上述现象为止。要继续加入氢氧化纳，直到产生上述现象为止。v样液中的样液中的硫酸铵硫酸铵在碱性条件下释放出在碱性条件下释放出氨氨，为，为防止样液防止样液中氨气逸出。中氨气逸出。一是加入氢氧化钠溶液要过量，二是要水一是加入氢氧化钠溶液要过量，二是要水封，三要夹紧废液蝴蝶夹后再通蒸汽，四要在蒸馏过程封，三要夹紧废液蝴蝶夹后再通蒸汽，四要在蒸馏过程中要注意接头处有无松漏现象中要注意接头处有无松漏现象v加热蒸馏出来的氨可以用加热蒸馏出来的氨可以用硼酸进行吸收硼酸进行吸收，因为硼酸只，因为硼酸只呈微弱酸性，不影响指示剂的变色反应，但是具有吸收呈微弱酸性，不影响指示剂的变色反应，但是具有吸收氨的作用，与氨形成氨的作用，与氨形成强碱弱酸盐强碱弱酸盐 。v冷凝管下端先插入硼酸吸收液液面以下才能蒸馏。吸冷凝管下端先插入硼酸吸收液液面以下才能蒸馏。吸收液温度不应超过收液温度不应超过4040，避免氨气逸出，避免氨气逸出，若超过时可置若超过时可置于冷水浴中使用。于冷水浴中使用。v检验蒸馏是否完成的方法：检验蒸馏是否完成的方法：奈氏试纸法奈氏试纸法。原理原理:NH4+或或NH3遇奈氏试剂会反应生成综红色的碘化汞铵化合物，如遇奈氏试剂会反应生成综红色的碘化汞铵化合物，如NH4+或或NH3含量较少，试纸呈黄色，若含量过多，呈棕黄含量较少，试纸呈黄色，若含量过多，呈棕黄色或棕红色的沉淀反应色或棕红色的沉淀反应v在蒸馏时，在蒸馏时，蒸汽发生要均匀充足蒸汽发生要均匀充足，蒸馏过程中不得停火断，蒸馏过程中不得停火断汽汽,否则会发生否则会发生倒吸倒吸。v蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面，再蒸蒸馏完毕后，应先将冷凝管下端提离液面，再蒸1 1分钟，分钟，将附着在尖端的吸收液完全洗入吸收瓶内，再将吸收瓶移开，将附着在尖端的吸收液完全洗入吸收瓶内，再将吸收瓶移开，最后关闭电源最后关闭电源，绝不能先关闭电源，否则吸收液将发生，绝不能先关闭电源，否则吸收液将发生倒吸倒吸。v所用的试剂溶液所用的试剂溶液 必须用必须用无氨蒸馏水无氨蒸馏水配制。配制。任务三：盐酸滴定任务三：盐酸滴定v子任务子任务1：仪器及试剂的准备：仪器及试剂的准备v仪器：仪器：v25mL25mL酸式滴定管酸式滴定管1 1套套v试剂试剂v标准溶液标准溶液子任务子任务2：盐酸滴定：盐酸滴定v接收瓶接收瓶 以以HCL标准滴定液滴定标准滴定液滴定 灰色终点灰色终点 记录记录VHcl（1 1）硼酸吸收）硼酸吸收液的颜色液的颜色（2 2）吸收氨气）吸收氨气后的硼酸吸收液后的硼酸吸收液的颜色的颜色（3 3）盐酸滴定）盐酸滴定终点的颜色终点的颜色v注意注意v混合指示剂在混合指示剂在碱性溶液中呈碱性溶液中呈绿色绿色,在在中性溶液中性溶液中中呈呈灰色灰色,在在酸性溶液酸性溶液中呈中呈红色红色。v酸式滴定管的正确使用酸式滴定管的正确使用项目名称项目名称检测日期检测日期样品名称样品名称检验依据检验依据内容内容1 12 23 3 空白空白样品质量样品质量m/gm/gV V初初 /mL/mLV V终终 /mLmL消耗的体积消耗的体积V V1 1 /mL /mL吸取消化液体积吸取消化液体积V V3 3 /mL/mL蛋白质含量（蛋白质含量（g/100gg/100g）平均值（平均值（g/100gg/100g）两次测定之差两次测定之差/平均值平均值精密度精密度CyCy （g/100gg/100g）F F：牛乳及其制品的蛋白质换算系数：牛乳及其制品的蛋白质换算系数6.386.38任务四、数据记录与计算任务四、数据记录与计算v有效数字：有效数字：v蛋白质含量蛋白质含量1 g/100 g时，结果保留时，结果保留三位三位有效数字有效数字v蛋白质含量蛋白质含量1 g/100 g时，结果保留时，结果保留两位两位有效数字。有效数字。v精密度：精密度：v在重复性条件下的两次独立测定结果的绝对差值不在重复性条件下的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的得超过算术平均值的10%（g/100g）小结小结步骤步骤反应前后颜色变化反应前后颜色变化湿法消化湿法消化凯氏烧瓶：样品无色（加硫酸前）凯氏烧瓶：样品无色（加硫酸前）加加硫酸炭化黑色硫酸炭化黑色消化后红棕色消化后红棕色 棕褐棕褐色色消化终点蓝绿色消化终点蓝绿色/墨绿色墨绿色淡蓝色淡蓝色（冷却后溶液）（冷却后溶液）碱化蒸馏碱化蒸馏反应室：深蓝色或黑色沉淀反应室：深蓝色或黑色沉淀硼酸吸收硼酸吸收紫红色紫红色绿色绿色盐酸滴定盐酸滴定甲基红和溴甲酚绿混合指示剂：绿色甲基红和溴甲酚绿混合指示剂：绿色灰色灰色甲基红和亚甲基蓝混合液：绿色甲基红和亚甲基蓝混合液：绿色蓝紫色蓝紫色v凯氏定氮法用于所有动物、植物类食品的蛋白质含量的测凯氏定氮法用于所有动物、植物类食品的蛋白质含量的测定，但因样品中含有核酸、生物碱、含氮类脂、卟啉以及定，但因样品中含有核酸、生物碱、含氮类脂、卟啉以及含氮色素等非蛋白质含氮化合物，所以测定结果为含氮色素等非蛋白质含氮化合物，所以测定结果为粗蛋白粗蛋白质含量。质含量。v若要测定样品的蛋白氮若要测定样品的蛋白氮,则需要向样品中加入则需要向样品中加入三氯乙酸三氯乙酸溶液溶液,使其最终浓度为使其最终浓度为5%,5%,然后测定未加入三氯乙酸的样品及加入然后测定未加入三氯乙酸的样品及加入三氯乙酸溶液后样品中的含氮量三氯乙酸溶液后样品中的含氮量,进一步计算出蛋白质含量进一步计算出蛋白质含量:蛋白氮蛋白氮=总氮总氮-非蛋白氮非蛋白氮任务五：试验器具的清洗整理任务五：试验器具的清洗整理【拓展学习拓展学习】v1、其他蛋白质测定方法、其他蛋白质测定方法分光光度法分光光度法v（1）原理）原理v食品中的蛋白质在催化加热条件下被分解，分解产生的氨与食品中的蛋白质在催化加热条件下被分解，分解产生的氨与硫酸结合生成硫酸结合生成硫酸铵硫酸铵，在，在pH 4.8 pH 4.8 的的乙酸钠乙酸钠-乙酸乙酸缓冲溶液中缓冲溶液中与与乙酰丙酮乙酰丙酮和和甲醛甲醛反应生成反应生成黄色黄色的的3,5-3,5-二乙酰二乙酰-2,6-2,6-二甲基二甲基-1,4-1,4-二氢化二氢化吡啶化合物吡啶化合物。在波长。在波长400nm400nm下测定吸光度值，与下测定吸光度值，与标准系列比较定量，结果乘以标准系列比较定量，结果乘以换算系数换算系数，即为蛋白质含量。，即为蛋白质含量。v（2）特点）特点v快速、污染少、操作简单、省时快速、污染少、操作简单、省时v 国家标准测定蛋白质国家标准测定蛋白质第二法第二法v2、改良式凯氏装置、改良式凯氏装置江苏畜牧兽医职业技术学院江苏畜牧兽医职业技术学院泰州市质监局泰州市质监局v3、自动凯氏定氮法、自动凯氏定氮法1.1.原理原理 同常量凯氏定氮法同常量凯氏定氮法2.2.主要仪器主要仪器 自动凯氏定氮仪：自动凯氏定氮仪：该装置内具有自动加碱蒸馏装置，自动吸该装置内具有自动加碱蒸馏装置，自动吸收和滴定装置以及自动数字显示装置。收和滴定装置以及自动数字显示装置。消化装置：消化装置：由优质玻璃制成的凯氏消化瓶及红外加热装置组由优质玻璃制成的凯氏消化瓶及红外加热装置组合成的消化炉。合成的消化炉。3、试剂、试剂 除硫酸铜与硫酸钾制成片剂外，其他试剂与常量测定相同。除硫酸铜与硫酸钾制成片剂外，其他试剂与常量测定相同。4、优点、优点灵敏、准确、快速以及用量少灵敏、准确、快速以及用量少l准确称取某乳粉样品克，经凯氏法消化定容至准确称取某乳粉样品克，经凯氏法消化定容至100ml100ml，移，移取取5ml5ml消化液进行蒸馏，用消化液进行蒸馏，用20ml20ml硼酸吸收，再用滴定，结果硼酸吸收，再用滴定，结果消耗，试计算该乳粉的蛋白质含量？消耗，试计算该乳粉的蛋白质含量？l试述蛋白质测定中，样品消化过程所必须注意的事项，消试述蛋白质测定中，样品消化过程所必须注意的事项，消化过程中内容物颜色发生什么变化？为什么？化过程中内容物颜色发生什么变化？为什么？l样品经消化进行蒸馏前，为什么要加入氢氧化钠？这时溶样品经消化进行蒸馏前，为什么要加入氢氧化钠？这时溶液发生什么变化？为什么？如果没有变化，说明什么问题？液发生什么变化？为什么？如果没有变化，说明什么问题？须采用什么措施？须采用什么措施？v子项目二子项目二v14酱油中氨基酸态氮的测定酱油中氨基酸态氮的测定（GB/T 5009.39-2003 ）任务一：相关仪器设备及试剂的准备v仪器设备：碱式滴定管、移液管、200mL烧杯、100容量瓶、酸度计、磁力搅拌器、滴定台v试剂：浓度为36%中性甲醛；氢氧化钠标准溶液：（需临用前标定）任务二：成分分析任务二：成分分析1.1.原始记录表格的设计原始记录表格的设计项目名称项目名称检测日期检测日期样品名称样品名称检验依据检验依据样品滴定样品滴定次数次数加甲醛前加甲醛前加甲醛后加甲醛后空白滴定空白滴定V2V2初读初读数数末读末读数数消耗消耗体积体积初读初读数数末读末读数数消耗消耗体积体积V1V11 12 2氨基酸态氮含量氨基酸态氮含量X X（g/100mLg/100mL）=平均值平均值精密度精密度2.2.样品中游离酸中和样品中游离酸中和v吸取5mL试样100mL容量瓶中定容混匀后吸取20.0mL200mL烧杯加水60mL插入酸度计的指示电极和参比电极开动磁力搅拌器氢氧化钠标准溶液滴定至酸度计指示pH记录消耗体积3.3.滴定样品中氨基酸酸基含量滴定样品中氨基酸酸基含量v上述烧杯加入10mL甲醛溶液混匀再用氢氧化钠标准的溶液继续滴定至pH记录消耗体积V1【拓展拓展】v本法原理：v氨基酸含有酸性的-COOH和碱性的-NH2，它们相互作用使氨基酸成为中性的内盐，不能直接用碱液滴定它的羧基。当加入甲醛时，氨基与甲醛结合，其碱性消失，使羧基显示出酸性，这样就可以用氢氧化钠溶液滴定-COOH，并用间接法测定氨基酸的总量。4.4.空白试验空白试验v取80mL蒸馏水200mL洁净烧杯先用氢氧化钠标准溶液滴定pH加入中性甲醛溶液用氢氧化钠标准溶液（）滴定至pH记录消耗体积V25.5.数据处理数据处理v精密度：精密度：在重复性条件下的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%任务三：试验器具的清洗整理任务三：试验器具的清洗整理