DNA的生物合成课件

主要内容 中心法则 DNA的复制 DNA的半保留复制 参与复制的酶类 复制过程 DNA的损伤与修复 DNA损伤 DNA损伤的修复 逆转录DNA 是生物遗传信息的载体1869年，Johann.F.Miescher 首次从从莱茵河鳟鱼细胞核中发现DNA肺炎双球菌转化实验肺炎双球菌转化实验：1928年，Frederick Griffth 实验J.F.MiescherJ.F.MiescherF.GriffthF.Griffth1928,Griffth 肺炎双球菌转化实验肺炎双球菌转化实验DNA是遗传信息载体的证明肺炎双球菌转化实验肺炎双球菌转化实验1944年，Oswald Avery,Colin MacLeod,Maclyn McCarty 证明DNA为生物遗传信息的载体Oswald AveryOswald AveryColin MacLeodColin MacLeodMaclyn McCartyMaclyn McCarty1944年，肺炎双球菌转化实验DNA 双螺旋结构的发现Watson&Crick Nature 171,737-738(1953)中心法则：解释遗传信息在生物大分子之间传递顺序的框架中心法则中心法则朊病毒朊病毒DNA 复制复制RNA 复制复制DNA的生物合成1.DNA复制（replication）2.DNA修复（repair）3.逆转录（reverse transcription）DNA 复制以母链 DNA 为模板合成子链DNA的过程，使亲代的遗传信息得以准确传递到子代。DNA复制机制的实验验证 半保留模型半保留模型（Semiconservetive model）全保留复制模型全保留复制模型(Conservetive model)分散模型分散模型(Dispersive model)DNA 复制方式的三种假说(半保留复制半保留复制)(全保留复制全保留复制)(混合式混合式)DNA 的半保留复制半保留复制（半保留复制（semi-conservative replication）即子代即子代DNA双链分子中，一股链来双链分子中，一股链来自亲代模板，一股链为新合成的。自亲代模板，一股链为新合成的。半保留复制的意义：保证亲代的遗半保留复制的意义：保证亲代的遗传信息准确传递给子代，体现了遗传信息准确传递给子代，体现了遗传的高度保真性。传的高度保真性。原核生物：原核生物：Meselson-Stahl 实验实验 Franklin Stahl半保留复制的实验证明半保留复制的实验证明原核生物复制的起点和方向原核生物复制的起点和方向 E.coli，固定起始点、双向对称复制。T7，一端的17处开始，向两端延伸。枯草杆菌有固定的起始点，双向不对称复制。质粒R6K早期为单向复制，复制了约1/5基因组时进行双向复制。质粒Col E1有固定起始点，但却为单向复制。mt DNA进行进行D环复制（displaced loop）。真核有多个复制起点，双向等速复制。D环复制环复制 DNA的半不连续的半不连续复制复制复制时复制时DNA链延伸可能有三种方式链延伸可能有三种方式12 3 DNA复制的半不连续性复制的半不连续性 一条链连续合成，一条链连续合成，称前导链称前导链(Leading Strand),另另一条链分一条链分段合成段合成，称滞后链，称滞后链(Lagging Strand)。原因：原因：DNA双螺旋分子两条链方向相反，新链合成的方向双螺旋分子两条链方向相反，新链合成的方向只能只能53一个方向合成。一个方向合成。1967年，冈崎实验年，冈崎实验脉冲标记和脉冲追踪脉冲标记和脉冲追踪冈崎令治冈崎令治1978年，年，Olivera 实验实验 细胞内存在 dTTP 和dUTP，而 DNA聚合酶 不能区分它们。dUTPase酶，使 dUTP 变成 dUMP，其不能作为 DNA 合成的底物。尿嘧啶N-糖苷酶（uracilN-glycosylase），切断混入尿苷的糖苷键，形成AP位点。AP内切酶，在AP位点切出一个缺口，进行切除修复。Baldomero M.Olivera参与DNA复制的酶类及蛋白质因子1.DNA聚合酶（聚合酶（DNA polymerase）2.双链双链DNA解链、解旋酶解链、解旋酶3.引物酶引物酶4.连接酶连接酶DNA聚合酶聚合酶(DNA polymerase)1957年，由 Arthur Kornberg,Washington University at St.Louis,从大肠杆菌(E.coli)中发现。1959，获得 Nobel Prize in Physiology or Medicine.依赖DNA的DNA聚合酶(DNA dependent DNA polymerase)原核生物复制的酶系统原核生物复制的酶系统DNA聚合酶的共同特点：(1)需要提供合成模板(2)不能起始新的DNA链，必须要有引物提供3OH(3)合成的方向都是53(4)除聚合酶功能外，还有其他功能，如3-5,5-3外切酶功能。大肠杆菌中的三种DNA多聚酶 DNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶聚合酶不同种类亚基数目不同种类亚基数目1710相对分子质量相对分子质量103 00088 000900 000 5 3 核酸聚合酶活核酸聚合酶活性性+3 5 核酸外切酶活核酸外切酶活性性+5 3 核酸外切酶活核酸外切酶活性性+-聚合速度（核苷酸聚合速度（核苷酸/分）分）1 0001200240015 00060 000持续合成能力持续合成能力32001500500 000分子数分子数/细胞细胞4001001020功能功能切除引物，修复切除引物，修复修复修复复制复制DNA聚合酶 I 的结构与功能DNA聚合酶I有6个结合位点：(1)模板结合位点；(2)引物结合位点；(3)引物3OH结合位点；(4)底物dNTP结合位点；(5)53外切酶结合位点；(6)35校正位点。DNA聚合酶的功能1.53聚合功能聚合功能2.35外切活性外切活性3.53外切活性外切活性 (1)切口平移（切口平移（nick translation）(2)链的置换链的置换 (3)模板转换模板转换（template-switching）4.内切酶活性内切酶活性原核生物复制的酶系统原核生物复制的酶系统DNA聚合酶 I 功能切口平移切口平移(nick translation)原核细胞的DNA聚合酶聚合酶聚合酶II 活性弱活性弱,作用不详作用不详 有从有从53延伸多核苷酸链的聚合酶活性延伸多核苷酸链的聚合酶活性 有从有从35 外切酶的活性外切酶的活性DNA聚合酶的结构与功能DNA聚合酶聚合酶 III 的结构的结构连接酶（连接酶（ligase）将不连续的将不连续的DNA片段的片段的5-PO4与相邻的与相邻的3-OH以以 3-5 磷酸磷酸二酯键连接起来。二酯键连接起来。原核生物通过分解原核生物通过分解NAD为为NMN和和Pi提供能量，真核生物提供能量，真核生物则消耗则消耗ATP。单链结合蛋白（单链结合蛋白（single strand binding protein）负责与DNA单链区域结合 防止新形成的单链DNA重新配对形成双链DNA 防止新形成的单链DNA被核酸酶降解 E.coli 为四聚体，177aa双链双链DNA解链、解旋酶解链、解旋酶 解旋酶解旋酶(helicase):把把DNA双链的氢键打开，催化双螺旋解链双链的氢键打开，催化双螺旋解链需消耗需消耗ATP双链双链DNA解链、解旋酶解链、解旋酶拓扑异构酶（拓扑异构酶（topoisomerase）I型型，切断，切断DNA单链单链;II型型，切断切断DNA双链。双链。需消耗需消耗ATP。兼有内切酶和连接酶活性兼有内切酶和连接酶活性,可迅速使可迅速使DNA两条链断开又接上两条链断开又接上,消除解链酶产生的拓扑张力。消除解链酶产生的拓扑张力。当引入负超螺旋当引入负超螺旋时需要由时需要由ATP提供能量提供能量,同复制有关。同复制有关。引物酶（引物酶（primase）依赖DNA的RNA聚合酶，但不同于转录的RNA聚合酶，以复制起点的DNA序列为模板，合成5-3的RNA短片段复制起始区的结构特点复制起始区的结构特点1.富含AT，双链易于解开，起始复制；2.含有多个回文结构(914个GATC),8个GATC较保守,CATC中的“A”已甲基化;3.具有 4个反向重复顺序，作为蛋白结合位点；4.此顺序的右侧毗邻区域有两个起动子，其可能的作用是：转录产生引物；产生复制必要的蛋白；产生调节功能的RNA；起转录激活作用。原核生物DNA 复制过程 复制的起始复制的起始原核生物只有一个原核生物只有一个起始点（起始点（origin,ori）真核生物有多个起始点。真核生物有多个起始点。1.DNA解为单链解为单链解旋酶：解旋酶：进行解链，形成超螺旋。进行解链，形成超螺旋。拓扑异构酶：拓扑异构酶：超螺旋的转型，把正超螺旋转变为利于复制的超螺旋的转型，把正超螺旋转变为利于复制的负超螺旋，形成负超螺旋，形成复制叉（复制叉（replication fork）。原核生物DNA 复制过程 2.引物合成：引物合成：促进引物合成的蛋白质因子与复制起始点促进引物合成的蛋白质因子与复制起始点(ori)结合，形结合，形成成引发体前体（引发体前体（preprimosome）。引物酶引物酶与与引发体前体结合，引发体前体结合，形成形成引发体（引发体（primosome），合合成与模板成与模板DNA链链3端互补的端互补的RNA引物引物。原核生物DNA复制过程3.复制的延长复制的延长由由DNA聚合酶聚合酶III催化，是主要的复制酶。催化，是主要的复制酶。前导链（前导链（leading chain）：模板）：模板DNA链为链为 35 方向，方向，新链按新链按5 3方向连续合成方向连续合成，合成方向与解链方向一合成方向与解链方向一致。致。滞后链（滞后链（lagging chain）：模板）：模板DNA链为链为53方向，合方向，合成方向与解链方向相反，不能连续合成新链。成方向与解链方向相反，不能连续合成新链。DNA复制是半不连续的过程。复制是半不连续的过程。原核生物DNA复制过程4.复制的终止复制的终止:由由DNA聚合酶聚合酶I和和DNA连接酶催化完成。连接酶催化完成。DNA聚合酶聚合酶I切除引物，并且填补空隙切除引物，并且填补空隙DNA连接酶把连接酶把DNA片段连接起来。片段连接起来。真核生物的五种真核生物的五种DNA聚合酶聚合酶酶活性53聚合酶+35外切核酸酶-+53外切核酸酶-+构成（亚基）44425分子量（kD）3003638160300170250细胞内定位细胞核细胞核线粒体细胞核细胞核主要功能引发修复复制复制修复真核生物的真核生物的DNA聚合酶聚合酶DNA聚合酶聚合酶，负责新链的起始合成，负责新链的起始合成DNA聚合酶聚合酶，负责前导链的延伸，负责前导链的延伸聚合酶聚合酶，可能负责滞后链的延伸，也可能有其他，可能负责滞后链的延伸，也可能有其他功能功能DNA聚合酶聚合酶，负责线粒体，负责线粒体DNA的复制的复制DNA聚合酶聚合酶，修复功能，修复功能真核生物复制的特点：真核生物复制的特点：1.复制起始点多复制起始点多2.引物引物RNA短短3.冈崎片段短冈崎片段短4.DNA聚合酶不同聚合酶不同5.连接酶作用时需要连接酶作用时需要ATP提供提供AMPDNA的损伤与修复DNA损伤 多数是自发性突变，是遗传进化的基础。多数是自发性突变，是遗传进化的基础。环境的理化因素诱导，如紫外线、化学诱导剂环境的理化因素诱导，如紫外线、化学诱导剂如亚硝酸盐等。如亚硝酸盐等。UV，胸腺嘧啶二聚体，胸腺嘧啶二聚体 DNA 损伤类型1.1.点突变（碱基错配）点突变（碱基错配）DNADNA聚合酶复制错误产生聚合酶复制错误产生DNA 损伤类型2.2.碱基的缺失或插入。碱基的缺失或插入。DNA 损伤类型损伤类型3.DNA分子断裂分子断裂DNA单链断裂单链断裂DNA双链断裂双链断裂放放射线射线，重金属，重金属，病毒整合，病毒整合，DNA重排重排DNA损伤的修复损伤的修复 光修复：通过光复活酶光修复：通过光复活酶,修复嘧啶二聚体，广泛修复嘧啶二聚体，广泛存在在于生物界存在在于生物界,但人类缺乏。但人类缺乏。切除修复：切除修复：依靠特异内切核酸酶，识别损伤结构，并进行修复、合成和连接。重组修复重组修复:依靠重组蛋白A,先将同源母链DNA上相应的核苷酸片段转移替补，然后再合成一段序列填充缺口 SOS修复修复:DNA损伤广泛，难以继续复制时的一种应急修复。包括切除修复和重组修复，有多种酶和蛋白参与。特点：快而粗糙，错误率高，故而突变率高。逆转录作用逆转录作用中心法则的重要补充逆转录和逆转录酶的发现逆转录和逆转录酶的发现实验现象：1.1964年，Temin 等首次发现：DNA合成抑制剂可以遏制鸟类肉瘤病毒(ASV)等RNA肿瘤病毒所造成的感染 表明在RNA肿瘤病毒的RNA复制过程中需要合成DNA。2.ASV子代病毒颗粒的产生被放线菌素D所抑制 说明转录对于RNA肿瘤病毒增殖可能是必须的。假说假说 DNA是RNA肿瘤病毒在复制和致癌过程中的中间物 这一过程大致为：RNA肿瘤病毒DNA原病毒（或前病毒）RNA肿瘤病毒。1970年，Temin和Baltimore分别在RNA肿瘤病毒中发现了逆转录酶（reverse transcriptase）Howard TeminDavid Baltimore逆转录的证明逆转录的证明逆转录病毒（逆转录病毒（retrovirus）1.定义：含逆转录酶的定义：含逆转录酶的RNA病毒称为逆转录病毒。病毒称为逆转录病毒。所有的所有的RNA肿瘤病毒都是逆转录病毒，但是，并不是所有的肿瘤病毒都是逆转录病毒，但是，并不是所有的逆转录病毒都致癌。逆转录病毒都致癌。2.逆转录病毒的基因组：逆转录病毒基因组由两条相同的逆转录病毒的基因组：逆转录病毒基因组由两条相同的 正链正链RNA分子组成，其分子组成，其5端有端有cap，3端有端有ployA尾。尾。逆转录酶（逆转录酶（reverse transcriptase）定义：是定义：是RNA指导的指导的DNA聚合酶。聚合酶。具有三种酶活性，即具有三种酶活性，即RNA指导的指导的DNA聚合酶、聚合酶、DNA指导的指导的DNA聚合酶和聚合酶和 RNase H的活性。的活性。合成合成DNA的方向：逆转录酶合成的方向：逆转录酶合成DNA的方向为的方向为53。合成合成DNA的引物：的引物：不能从头合成不能从头合成DNA。引物为逆转录病毒包装时从宿主细。引物为逆转录病毒包装时从宿主细胞获得的胞获得的tRNA分子。分子。一些鸟类逆转录病毒以宿主一些鸟类逆转录病毒以宿主tRNATrp（色氨酸）为引物，（色氨酸）为引物，鼠类逆转病毒则以宿主细胞鼠类逆转病毒则以宿主细胞tRNAPro（脯氨酸）为引物。（脯氨酸）为引物。RNase H活性：是指逆转录酶可以从活性：是指逆转录酶可以从53和和35两个两个方向水解方向水解DNA-RNA杂合分子中的杂合分子中的RNA。逆转录逆转录逆转录（reverse transcription）：是指在逆转录酶的作用下以RNA为模板合成DNA的过程。逆转录是对中心法则的重要修正和补充！逆转录是对中心法则的重要修正和补充！RNA同样具有遗传信息的存储、传递和表达功能逆转录作用图逆转录作用图逆转录原理的应用逆转录原理的应用RT-PCR反转录PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）：是将RNA的反转录（RT）和 cDNA 的聚合酶链式扩增反应（PCR）相结合的技术。RT-PCR过程过程 首先经反转录酶，以RNA为模板逆转录合成 cDNA。然后以 cDNA 为模板，PCR扩增合成目的基因片段。RT-PCR的用途的用途1.检测细胞中基因表达水平；2.检测细胞中RNA病毒的含量；3.直接克隆特定基因的cDNA序列。端粒与端粒酶端粒与端粒酶端粒是端粒是真核细胞线状染色体末端的一小段DNA-蛋白质复合体。端粒与端粒酶端粒与端粒酶端粒是短的多重复的非转录短的多重复的非转录序列（序列（TTAGGG）及一些结合）及一些结合蛋白组成特殊结构。蛋白组成特殊结构。稳定染色体末端结构，防止稳定染色体末端结构，防止染色体间末端连接，并可补染色体间末端连接，并可补偿滞后链偿滞后链5末端在消除末端在消除RNA引引物后造成的空缺物后造成的空缺滞后链末端的复制困境滞后链末端的复制困境端粒酶的发现端粒酶的发现1983年年Blackburn实验：实验：纤毛虫有两个核，一个二倍体的纤毛虫有两个核，一个二倍体的小核，一个多倍体的大核。小核，一个多倍体的大核。纤毛虫在有性生殖过程中，大核纤毛虫在有性生殖过程中，大核由小核发育而来，其中小核由小核发育而来，其中小核rRNA基因为单拷贝。基因为单拷贝。Elizabeth Blackburn 体外切下体外切下rRNA基因，成为游离基因，经过扩增达到一万基因，成为游离基因，经过扩增达到一万拷贝；拷贝；发现：这些经过扩增的发现：这些经过扩增的rDNA小分子末端都有端粒，也就小分子末端都有端粒，也就是具有是具有（G4T2）n重复片段；重复片段；但小核但小核rDNA基因的两端原来没有这段重复序列，这些末基因的两端原来没有这段重复序列，这些末端重复序列，是切下后在纤毛虫细胞内加上去的。端重复序列，是切下后在纤毛虫细胞内加上去的。1983年年Blackburn实验实验端粒酶端粒酶 1984年，年，Blackburn等构建了线性质粒，进等构建了线性质粒，进行了加尾实验行了加尾实验 结果表明：端粒复结果表明：端粒复制的模板并不在端粒上制的模板并不在端粒上加尾和末端结构的内在联系加尾和末端结构的内在联系1985年实验：年实验：以酵母的末端重复序列作为引物时，用四膜虫以酵母的末端重复序列作为引物时，用四膜虫抽提物加上的仍然是四膜虫的端粒抽提物加上的仍然是四膜虫的端粒当加热到当加热到90度或用蛋白酶处理后，也不能延长度或用蛋白酶处理后，也不能延长末端末端端粒酶的结构与功能端粒酶的结构与功能1987年，年，Greider和和Blackbrun分离出端粒酶，其分分离出端粒酶，其分子量在子量在200-500KD。端粒酶是一种含有端粒酶是一种含有RNA的蛋白质，的蛋白质，RNA长长159bp，其中有一段保守序列其中有一段保守序列CAACCCCAA，核酸酶对此，核酸酶对此区域不能剪切。区域不能剪切。端粒酶端粒酶具有逆转录酶活性具有逆转录酶活性，依逆转录机制恢复端粒依逆转录机制恢复端粒处处DNA长度。长度。端粒酶端粒酶RNA的二级结构的二级结构端粒酶端粒酶RNA的核心序列是复制端粒的核心序列是复制端粒DNA的模板。的模板。端粒的复制模型端粒的复制模型1989年，年，Greider and Blackburn提出端粒的复制模提出端粒的复制模型：型：首先是端粒酶与端粒首先是端粒酶与端粒DNA结合，端粒酶中的结合，端粒酶中的RNA与与凸出的凸出的3 引物配对引物配对以以RNA为模板，在为模板，在DNA3端上从头合成端上从头合成DNA延伸延伸6个碱基个碱基合成一个重复单位，端粒酶向合成一个重复单位，端粒酶向DNA模板新合成的模板新合成的3移动，引物再和模板配对，进行循环复制。移动，引物再和模板配对，进行循环复制。最后延伸的最后延伸的3端再回折，以端再回折，以4G体配对的方式形成发体配对的方式形成发夹结构，产生端粒夹结构，产生端粒端粒酶与老化端粒酶与老化每一次细胞分裂染色体都要从末端丢失核苷酸，端每一次细胞分裂染色体都要从末端丢失核苷酸，端粒的缩短为细胞提供了一个分裂钟（粒的缩短为细胞提供了一个分裂钟（mitotic clock）。）。端粒酶可以把端粒序列加到染色体的末端，可以避端粒酶可以把端粒序列加到染色体的末端，可以避免细胞快速衰老，保持细胞分裂能力。免细胞快速衰老，保持细胞分裂能力。所有正在分裂的细胞中都有端粒酶的活性，但在终所有正在分裂的细胞中都有端粒酶的活性，但在终末分化不在分裂的细胞中则一般没有活性末分化不在分裂的细胞中则一般没有活性引物酶及引物酶及DNA pol按合成滞后链方式延伸另一链，虽按合成滞后链方式延伸另一链，虽然滞后链比模板链短，但整个然滞后链比模板链短，但整个DNA已经被加长，可已经被加长，可以缓解以缓解DNA随复制的进行逐渐变短的现象随复制的进行逐渐变短的现象思考题思考题名词解释：名词解释：DNA的半不连续复制、冈崎片段、前导链、滞后链的半不连续复制、冈崎片段、前导链、滞后链简答：简答：1.何为逆转录、有何生物学意义，逆转录酶有那些活性？何为逆转录、有何生物学意义，逆转录酶有那些活性？2.什么是什么是DNA半保留复制，它是如何被证明的？半保留复制，它是如何被证明的？3.DNA聚合酶有哪些共同特点聚合酶有哪些共同特点 4.导致导致DNA损伤的因素有那些，损伤的因素有那些，DNA如何修复？如何修复？思考题简答：1.何为逆转录、有何生物学意义，逆转录酶有那些活性？何为逆转录、有何生物学意义，逆转录酶有那些活性？逆转录（reverse transcription）是指在逆转录酶的作用下以RNA为模板合成DNA的过程。逆转录是对中心法则的重要修正和补充，表明在某些生物中，逆转录是对中心法则的重要修正和补充，表明在某些生物中，RNA同样具有遗传信息的存储、传递和表达功能。逆转录酶是RNA指导的DNA聚合酶。具有三种酶的活性，即RNA指导的DNA聚合酶、DNA指导的DNA聚合酶和 RNase H的活性。合成DNA的方向为 53。2.什么是DNA半保留复制，它是如何被证明的？DNA 在进行复制的时候，双链解旋分开，以每条链作为模板合成与之互补的链，生成两个新的DNA分子。子代DNA分子中，一条链来自亲代DNA，另一条链是新合成的，这种方式称半保留复制。半保留复制的意义在于保证亲代的遗传信息准确传递给子代，体现了遗传的高度保真性。证明：Meselson-Stahl 实验 3.DNA聚合酶有哪些共同特点(1)需要提供合成模板(2)不能起始新的DNA链，必须要有引物提供3OH(3)合成的方向都是53(4)除聚合酶功能外，还有其他功能，如3-5,5-3外切酶功能等。4.导致DNA损伤的因素有那些，DNA如何修复？多数是自发性突变，是遗传进化的基础。环境的理化因素诱导，如紫外线、化学诱导剂如亚硝酸盐等。光修复：通过光复活酶,修复嘧啶二聚体，广泛存在在于生物界,但人类缺乏切除修复：依靠特异内切核酸酶，识别损伤结构，并进行修复、合成和连接重组修复:依靠重组蛋白A,先将同源母链DNA上相应的核苷酸片段转移替补，然后再合成一段序列填充缺口SOS修复:DNA损伤广泛，难以继续复制时的一种应急修复。包括切除修复和重组修复，有多种酶和蛋白参与。特点：快而粗糙，错误率高，故而突变率高。