碱性磷酸酶km值测定

酶促反应动力学研究方法介绍酶促反应动力学研究方法介绍碱性磷酸酶碱性磷酸酶kmkm值测定值测定实验目的 学习环境因素对酶促反应速度的影响；学习米氏方程及Km值得测定；测量碱性磷酸酶km值；实验原理 E的反应速度受到环境因素的影响，这些因素包括底物浓度、E浓度、PH、温度、激活剂、抑止剂等（一）米曼氏方程式（一）米曼氏方程式中间产物中间产物酶促反应模式酶促反应模式中间产物学说中间产物学说E+S k1k2k3ESE+P相关相关E学原理学原理S：底物浓度底物浓度V：不同不同S时的反应速度时的反应速度Vmax：最大反应速度最大反应速度(maximum velocity)m：米氏常数米氏常数(Michaelis constant)VmaxS Km+S KmS Km值等于酶促反应速度为最大反应速度一半值等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度，单位是时的底物浓度，单位是mol/L。2Km+S Vmax VmaxS（二）（二）Km与与Vmax的意义的意义 K Km m值值 K Km m等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度。浓度。意义：意义：a)a)K Km m是酶的特征性常数之一；是酶的特征性常数之一；b)b)K Km m可近似表示酶对底物的亲和力；可近似表示酶对底物的亲和力；c)c)同一酶对于不同底物有不同的同一酶对于不同底物有不同的KmKm值。值。Vmax定义：定义：Vm是酶完全被底物饱和时的反应速度，与酶浓是酶完全被底物饱和时的反应速度，与酶浓度成正比。度成正比。（三）（三）m m值与值与maxmax值的测定值的测定1.双倒数作图法双倒数作图法(double reciprocal plot)，又称为又称为 林林-贝氏贝氏(Lineweaver-Burk)作图作图法法-1/Km（林贝氏方程）（林贝氏方程）2.Hanes作图法作图法-Km 酶浓度对反应速度的影响酶浓度对反应速度的影响当当SE，酶可被，酶可被底物饱和的情况下，反底物饱和的情况下，反应速度与酶浓度成正比。应速度与酶浓度成正比。关系式为：关系式为：V=K3 E0 V E 当当SE时，时，Vmax=k3 E 酶浓度对反应速度的影响酶浓度对反应速度的影响 q双重影响双重影响温度升高，酶促反应速度温度升高，酶促反应速度升高；由于酶的本质是蛋白质，升高；由于酶的本质是蛋白质，温度升高，可引起酶的变性，从温度升高，可引起酶的变性，从而反应速度降低而反应速度降低 。温度对反应速度的影响温度对反应速度的影响q最适温度最适温度 (optimum temperature)：酶促反应速度最快时的酶促反应速度最快时的环境温度。环境温度。*低温的应用低温的应用酶酶活活性性0.51.02.01.50 10 20 30 40 50 60 温度温度 C 温度对淀粉酶活性的影响温度对淀粉酶活性的影响 pH对反应速度的影响对反应速度的影响q最适最适pH (optimum pH)：酶催化活性最大酶催化活性最大时的环境时的环境pH。0酶酶活活性性 pH pH对某些酶活性的影响对某些酶活性的影响 246810碱性磷酸酶碱性磷酸酶kmkm值的测定值的测定操作操作试剂试剂（mlml）1234562.5mM2.5mM磷酸苯二钠磷酸苯二钠0.20.40.60.81.01.0蒸馏水蒸馏水0.80.60.40.2碱性缓冲液碱性缓冲液1.01.01.01.01.01.0混匀后，37水浴5min碱性磷酸酶碱性磷酸酶0.10.10.10.10.1混匀后，37水浴15min(准确计时）酚试剂酚试剂1.01.01.01.01.01.0碱性磷酸酶碱性磷酸酶0.110%10%碳酸钠碳酸钠3.03.03.03.03.03.0混匀后，37水浴15min,以第6管调0与650nm比色，读取各管A值。实验数据及结果实验数据及结果管号管号A6501/A650s1/s123456以上述数据双倒数作图，求出碱性磷酸酶的以上述数据双倒数作图，求出碱性磷酸酶的Km值。值。实验讨论实验讨论 Km值的定义和意义是什么？值的定义和意义是什么？米氏方程度表达式是什么，如何求出米氏方程度表达式是什么，如何求出Vmax和和Km？现有某待测样品液5ml，将其稀释到100ml，取其稀释液1ml加入测定管按酚试剂法测其蛋白质含量，另取已知浓度的牛血清白蛋白溶液（250微克/ml）1ml加入标准管，其余操作同测定管。反应显色后测得吸光度分别为：A测=0.4，A标=0.25，求原样品液中的蛋白质含量（g/100ml）0.8