基因转移技术和基因打靶技术

第十章第十章 基因转移技术和基因打靶技术基因转移技术和基因打靶技术第一节第一节 概概 述述 转基因动物转基因动物(transgenic animal)(transgenic animal)是指用重组是指用重组DNADNA技术将外源基因导入基因组内，使之能在动物体内表达技术将外源基因导入基因组内，使之能在动物体内表达并稳定传代的一类动物。并稳定传代的一类动物。整合到动物染色体基因组上的外源基因称整合到动物染色体基因组上的外源基因称转基因转基因。只有部分组织细胞整合有外源基因的动物称只有部分组织细胞整合有外源基因的动物称嵌合体嵌合体动物动物。基因剔除动物基因剔除动物是指运用基因剔除技术将特定是指运用基因剔除技术将特定的内源基因剔除后的动物。的内源基因剔除后的动物。基因剔除基因剔除是指外源是指外源DNA与受体细胞基因组中序列相与受体细胞基因组中序列相同或相近的基因发生同源重组而整合到受体细胞的基因同或相近的基因发生同源重组而整合到受体细胞的基因组中，是特定的内源基因被踢除。组中，是特定的内源基因被踢除。基因替换动物基因替换动物是指运用基因锲入技术，使外源基因是指运用基因锲入技术，使外源基因编码区取代与某种生理现象相关的基因编码区后获得的编码区取代与某种生理现象相关的基因编码区后获得的动物。动物。基因锲入技术（基因置换技术）基因锲入技术（基因置换技术）是指使双链是指使双链DNA的断裂点发生在同源序列的边缘或者同源序列之外，是的断裂点发生在同源序列的边缘或者同源序列之外，是外源外源DNA取代内源靶序列的新技术。取代内源靶序列的新技术。19821982年美国华盛顿大学年美国华盛顿大学PalmiterPalmiter等将大鼠等将大鼠生长激素基因导入小白鼠的受精卵里，再将这生长激素基因导入小白鼠的受精卵里，再将这一受精卵植入借腹怀孕的母鼠体内，生下一个一受精卵植入借腹怀孕的母鼠体内，生下一个比正常体格大一倍的比正常体格大一倍的“超级小鼠超级小鼠”。按照转基因小鼠的思路，人们已经成功的按照转基因小鼠的思路，人们已经成功的获得了转基因大鼠、鸡、山羊、绵羊、猪、兔、获得了转基因大鼠、鸡、山羊、绵羊、猪、兔、牛、蛙、鱼等。牛、蛙、鱼等。转基因动物制作的关键技术包括：转基因动物制作的关键技术包括：1.1.外源目的基因的分离外源目的基因的分离2.2.转基因与包含启动子、增强子、报告基因等转基因与包含启动子、增强子、报告基因等元件的载体拼接重组元件的载体拼接重组3.3.重组的转基因导入生殖细胞或胚胎干细胞重组的转基因导入生殖细胞或胚胎干细胞4.4.转基因胚胎的培养和移植转基因胚胎的培养和移植5.5.转基因胚胎发育生长的转基因胚胎发育生长的鉴定及转基因动物品鉴定及转基因动物品系的筛选系的筛选6.6.外源目的基因整合率及表达效率的检测外源目的基因整合率及表达效率的检测第二节第二节 动物转基因技术的基本原理与方法动物转基因技术的基本原理与方法基本原理：基本原理：制备目的基因，构建重组转基因载体，制备目的基因，构建重组转基因载体，导入导入 生殖细胞或着床前胚胎细胞生殖细胞或着床前胚胎细胞 ，将转基，将转基因受精卵或着床前胚胎细胞植入子宫或输卵因受精卵或着床前胚胎细胞植入子宫或输卵管管，发育成转基因动物。，发育成转基因动物。一、目的基因的制备和转基因载体的构建一、目的基因的制备和转基因载体的构建（一）目的基因的制备（一）目的基因的制备1 1、cDNAcDNA法扩增目的基因法扩增目的基因2 2、双链、双链DNADNA与载体连接构建重组体与载体连接构建重组体3 3、将重组体转入受体菌、将重组体转入受体菌4 4、筛选和鉴定重组体、筛选和鉴定重组体5 5、扩增获得大量重组体、扩增获得大量重组体（二）转基因载体的构建（二）转基因载体的构建 载体通常由结构基因及其调控序列组成。常常在载体通常由结构基因及其调控序列组成。常常在载体中附加半乳糖苷酶或绿色荧光蛋白等报告基因。载体中附加半乳糖苷酶或绿色荧光蛋白等报告基因。根据不同目的选择相应调控序列：如观察外源根据不同目的选择相应调控序列：如观察外源基因表达的生物学效应，即选择表达效率高而无组织基因表达的生物学效应，即选择表达效率高而无组织特异性的强启动子如特异性的强启动子如CMVCMV、pGKpGK等。如观察外源基因再等。如观察外源基因再特定靶器官的功能，即选择组织特异的启动子。特定靶器官的功能，即选择组织特异的启动子。线性线性DNADNA分子比环形分子比环形DNADNA分子更容易整合到染色体分子更容易整合到染色体上。上。（一）显微注射法（一）显微注射法1.目的基因的制备目的基因的制备2.小鼠的准备和要求小鼠的准备和要求3.受精卵的分离受精卵的分离4.显微注射显微注射5.受精卵的移植受精卵的移植6.转基因小鼠的鉴定转基因小鼠的鉴定二、转基因方法二、转基因方法（二）反转录病毒法（二）反转录病毒法 原理：原理：反转录病毒的核酸为一条单链反转录病毒的核酸为一条单链RNARNA分子，其基因由分子，其基因由两部分组成，一是顺式作用序列，为病毒复制和整合两部分组成，一是顺式作用序列，为病毒复制和整合所必需；二是反式作用序列，编码病毒的包装蛋白。所必需；二是反式作用序列，编码病毒的包装蛋白。将外源基因取代反式作用序列构建成重组载将外源基因取代反式作用序列构建成重组载DNADNA。另外将包装蛋白基因导入专门的细胞并使之另外将包装蛋白基因导入专门的细胞并使之整合到染色体上，形成包装细胞。整合到染色体上，形成包装细胞。如果重组病毒如果重组病毒DNADNA导入这种包装细胞中，病毒导入这种包装细胞中，病毒包装蛋白能将包装蛋白能将DNADNA包装成具有感染力的重组蛋白颗粒，包装成具有感染力的重组蛋白颗粒，能浸染动物细胞而将重组能浸染动物细胞而将重组DNADNA引入宿主细胞。引入宿主细胞。步骤：步骤：1.1.反转录病毒载体的构建反转录病毒载体的构建2.2.选择和培养包装细胞系选择和培养包装细胞系3.3.重组病毒重组病毒DNADNA导入包装细胞导入包装细胞4.4.收集重组病毒颗粒收集重组病毒颗粒5.5.感染胚细胞，使细胞转化感染胚细胞，使细胞转化 此法是目前制备转基因此法是目前制备转基因鸡最有效和最成功的方法。鸡最有效和最成功的方法。（三）精子载体法（三）精子载体法 精子载体法是精子精子载体法是精子和外源和外源DNADNA混合培养混合培养时，外源时，外源DNADNA可直接可直接进入精子的头部，通进入精子的头部，通过受精将外源基因引过受精将外源基因引入动物细胞中。入动物细胞中。外源外源DNADNA导入精细导入精细胞的方法有胞的方法有DNADNA与精与精子共育法、电穿孔导子共育法、电穿孔导入法、脂质体转染法。入法、脂质体转染法。（四）电穿孔法（四）电穿孔法利用高压电脉冲击穿细胞膜，使外源基因通过膜孔进利用高压电脉冲击穿细胞膜，使外源基因通过膜孔进入细胞。入细胞。原理是原理是高压电脉高压电脉外源基因通外源基因通过膜孔进入细胞，从而改变受体细胞的遗传物质组成。过膜孔进入细胞，从而改变受体细胞的遗传物质组成。瞬间瞬间细胞细胞 细胞膜核膜通透性增加细胞膜核膜通透性增加 高压脉冲高压脉冲 DNADNA渗入细胞渗入细胞（五）体细胞核移植法（五）体细胞核移植法 1997年，英国科学家年，英国科学家Schnieke和和Wilmut等通过等通过体细胞核移植技术成功克隆了体细胞核移植技术成功克隆了“多莉多莉”。原理：原理：将外源目的基因导入能传代培养的动物体细胞，将外源目的基因导入能传代培养的动物体细胞，从阳性转基因细胞中分离细胞核，通过显微注射或从阳性转基因细胞中分离细胞核，通过显微注射或电穿孔将这种导入细胞核去核的成熟卵母细胞中。电穿孔将这种导入细胞核去核的成熟卵母细胞中。将重组胚移植到代孕受体，进而获得带有外源目的将重组胚移植到代孕受体，进而获得带有外源目的基因的转基因动物。基因的转基因动物。（六）受体介导法（六）受体介导法 是将外源是将外源DNA与受与受体分子连接后与胚胎细胞体分子连接后与胚胎细胞共培养，受体可以介导外共培养，受体可以介导外源源DNA进入受体细胞，进入受体细胞，从而实现基因转移。从而实现基因转移。1999年，年，Ivanava用受用受体介导法制作了转基因鼠。体介导法制作了转基因鼠。（七）磷酸钙沉淀法：（七）磷酸钙沉淀法：目的基因与磷酸钙等物质混合，形成沉淀目的基因与磷酸钙等物质混合，形成沉淀的的DNADNA微细颗粒，易通过细胞膜进入细胞内，微细颗粒，易通过细胞膜进入细胞内，并整合到受体细胞基因组中，在适当条件下并整合到受体细胞基因组中，在适当条件下得以表达。得以表达。（八）脂质体载体法（八）脂质体载体法l应用人工制备的类似细胞膜的膜性结构应用人工制备的类似细胞膜的膜性结构脂质体，脂质体，包装外源基因，再与靶细胞融合，外源包装外源基因，再与靶细胞融合，外源DNA导入靶导入靶细胞，使其表达。细胞，使其表达。DNA 细胞融合细胞融合 转化细胞转化细胞 PEG 仙苔病毒仙苔病毒DNA脂膜脂膜（九）嵌合体动物法（九）嵌合体动物法 嵌合体是由基因型不同的细胞构成的复合体个体。嵌合体是由基因型不同的细胞构成的复合体个体。动物嵌合体技术有卵裂聚合法和囊胚注射法。动物嵌合体技术有卵裂聚合法和囊胚注射法。胚胎嵌合体的制造方法主要有卵裂聚合法和囊胚注胚胎嵌合体的制造方法主要有卵裂聚合法和囊胚注射法。卵裂聚合法是把遗传性能不同而发育阶段相或相射法。卵裂聚合法是把遗传性能不同而发育阶段相或相近的胚胎卵裂球聚合在一起，通过发育形成嵌合体动物。近的胚胎卵裂球聚合在一起，通过发育形成嵌合体动物。囊胚注射法是把一种或多种胚胎的卵裂球、内细胞团、囊胚注射法是把一种或多种胚胎的卵裂球、内细胞团、胚胎干细胞等直接注射到一个囊胚的空隙中，从而获得胚胎干细胞等直接注射到一个囊胚的空隙中，从而获得嵌合体动物。嵌合体动物。三、转基因动物的检测三、转基因动物的检测 利用利用PCR或者或者Southern印迹杂交。印迹杂交。第三节第三节 动物基因打靶技术的基本原理与方法动物基因打靶技术的基本原理与方法 基因打靶基因打靶把已知序列的把已知序列的DNA片段与受体片段与受体细胞基因组中序列相同或非常相近的基因发细胞基因组中序列相同或非常相近的基因发生同源重组，整合到受体细胞基因组中，并生同源重组，整合到受体细胞基因组中，并得以表达的一种改变生物活体遗传信息的外得以表达的一种改变生物活体遗传信息的外源源DNA导入技术。导入技术。基因打靶的技术基础：基因打靶的技术基础：l胚胎干细胞胚胎干细胞(ES细胞细胞)技术技术l能在体外培养，保留发育的全能性能在体外培养，保留发育的全能性l同源重组技术同源重组技术l打靶载体打靶载体Neo（新霉素）阳性筛选标志（新霉素）阳性筛选标志HSV-tk阴性筛选标志：单纯疱疹病毒阴性筛选标志：单纯疱疹病毒(herpes simplex virus)胸腺嘧啶激酶胸腺嘧啶激酶(thymidine kinase)一、胚胎干细胞系的建立一、胚胎干细胞系的建立（一）胚胎的收集与胚泡的培养（一）胚胎的收集与胚泡的培养 分离胚胎，体外培养胚胎形成胚泡。分离胚胎，体外培养胚胎形成胚泡。（二）内细胞团（二）内细胞团（ICM）的离散）的离散（三）干细胞克隆的识别（三）干细胞克隆的识别（四）干细胞的收集与传代培养（四）干细胞的收集与传代培养（五）干细胞的冻存与复苏（五）干细胞的冻存与复苏（六）（六）ES细胞系的特征细胞系的特征二、基因打靶二、基因打靶基因打靶就是基因打靶就是按照预定计划通过外部打靶按照预定计划通过外部打靶DNA与与内源性靶基因之间的同源重组对胚胎干细胞进行内源性靶基因之间的同源重组对胚胎干细胞进行遗传修饰。遗传修饰。基因敲除的基本程序基因敲除的基本程序l打靶载体的构建打靶载体的构建l打靶载体导入打靶载体导入ES细胞：重组置换细胞：重组置换l基因敲除基因敲除ES细胞注射入胚泡细胞注射入胚泡l胚泡植入假孕小鼠的子宫中胚泡植入假孕小鼠的子宫中l嵌合体的杂交育种嵌合体的杂交育种基因打靶在医学中的应用基因打靶在医学中的应用l基因打靶与遗传病基因打靶与遗传病l基因打靶与肿瘤的研究基因打靶与肿瘤的研究l基因打靶与生物制药基因打靶与生物制药