限制酶的多种切割方法

限制酶的多种切割方法一、错位切割含目的基因的DNA片段和运载体形成黏性末端1. 单酶切（1）同一种限制酶分别切割含目的基因DNA片段与运载体。这 是最简单的一种方法，含目的基因的DNA片段与运载体在同种限制酶 作用下形成相同的黏性末端，这两个黏性末端间能通过碱基间的配对 而连接，进而形成重组DNA分子。（2）用同裂酶去切割含目的基因DNA片段与运载体。有一些来 源不同的限制酶识别核苷酸顺序和切割位置都相同，这类酶称为同裂 酶（同切酶或异源同工酶）。同裂酶产生同样的切割，形成相同的黏 性末端。2009年江苏生物高考第34题就出现了同裂酶（BamH I与Bst I）,其中的差别只在于当识别顺序中有甲基化的核苷酸时，一种限 制性内切酶可以切割，另一种则不能。（3）用同尾酶切割含目的基因DNA片段与运载体。有一些来源 不同、识别的核苷酸顺序和切割位置各不相同,但能产生相同的黏性 末端，这类酶被称为同尾酶。常用的限制酶BamH I、Bglll、Bell 和Sau3A就是一组同尾酶，它们切割DNA之后都形成由GATC四个核 苷酸组成的黏性末端。显而易见，由同尾酶所产生的DNA片段，是能 够通过其黏性末端之间的碱基互补作用而彼此连接起来。【例1】（2005年天津理综）：限制性内切酶I的识别序列和 切点是G ； GATCC,限制性内切酶II的识别序列和切点是一（GATC 。在质粒上有酶I的一个切点，在目的基因的两侧各有1个酶II的 切点。 请画出质粒被限制酶I切割后所形成的黏性末端。 请画出目的基因两侧被限制酶II切割后所形成的黏性末端。 在 DNA 连接酶的作用下，上述两种不同限制酶切割后形成的黏 性末端能否连接？为什么？解析：这两种酶属于同尾酶，能产生相同的黏性末端，因此能够 连接起来。由于两者产生的黏性末端相同（都是GATC），黏性末端之间 能发生碱基互补配对而连接。（4）单酶切的优点与缺点。单酶切优点就是操作简单。它的缺 点主要有两个:酶切后的质粒与目的基因在DNA连接酶作用下易自 身环化：用单酶切切割后的目的基因和质粒的两侧各有一个黏性末 端，而且是相同的末端，因此这两个末端会发生碱基互补配对而使目 的基因和质粒分别发生首尾相连，都形成环状DNA分子，其中质粒又 恢复成没有切割前的样子。目的基因与质粒的任意连接：因为目的 基因的插入是要有正确的方向才能正确表达，如果载体和目的基因的 酶切是使用同一种限制酶，那么目的基因的插入就有两种可能了。一 种可能是目的基因的最前端刚好插在启动子邻接下游，这样可以正确 表达；另一种刚好相反，目的基因的末端插在启动子的邻接下游（也 就是将目的基因翻转180度之后插入进去的），目的基因则没有办法 表达。这样就容易形成两种重组DNA分子，其中一种重组DNA分子是 我们所需要的，这样就加大了筛选工作量。由此可见，将同一种限制 酶切割目的基因与质粒可以获得两种重组质粒，不能使质粒与目的基 因发生定向连接。2. 多酶切（1）用两种或两种以上的限制酶去切割含目的基因的DNA片段 和运载体。较常见的是用同一组两种限制酶去切割含目的基因的DNA 片段和运载体，两者都会产生具有两种不同的黏性末端的DNA片段 （两个末端分别用A与B表示），然后混合起来，那么载体分子的A 端与目的基因的A端连接，载体分子的B端与目的基因的B端连接， 这就形成了重组DNA分子。另外，还可以用不同组限制酶同时去切割 含目的基因的DNA片段和运载体，此时要用同尾酶或同裂酶去切割。例2】 （ 2009年福建理综） ：转基因抗病香蕉的培育过程如 下图所示。质粒上有Pst I、Sma I、EcoR I、Apa I等四种限制酶切割位点。请回答：构建含抗病基因的表达载体A时，应选用限制酶，对进行切割。解析：题中抗病基因的两侧分别是Pst I和EcoR I的酶切位点， 因此只能用这两种酶去切割。目的基因两侧的黏性末端是P和E,为 了让目的基因与运载体结合，运载体两侧的黏性末端也只能是P和E, 因此也只能用Pst I和EcoR I酶去切割质粒。不能单独使用Sma I酶 去同时切割目的基因与质粒的原因是Sma I的酶切位点正好在目的基 因的中间，如果单独用此酶切割会破坏目的基因的结构。因此，答案 是选用限制酶Pst I和EcoR I对含抗病基因的DNA片段与质粒进行切 割。（2）多酶切的优缺点。多酶切的优点是可以克服单酶切的两大 缺点，一是可防止目的基因与质粒的自身环化：多酶切后目的基因与 运载体的两侧的黏性末端不相同，因此不能发生自身首尾相连成环状 DNA 分子。二是可实现目的基因与质粒的定向连接。比如说紧靠启动 子下游的是Pst I的酶切位点，而EcoR I位点在后面，目的基因的前 端是Pst I位点，末端是EcoR I位点，酶切之后插进去，就可以保证 目的基因的前端刚好插到紧靠着启动子的下游，只产生一种重组质 粒，目的基因实现定向插入，这样就可以顺利表达。 2010年江苏生 物高考第27题的第4 小题就考查了多酶切的优点。多酶切的缺点是 要用多种酶切割，由于每种限制酶的作用的条件不同，或是说最适 pH 和温度的不同，一般不能将一组的两种酶放在同一操作环境中使 用，而是要进行两次操作，更换操作液，以保证酶的高效性。因此， 使用多酶切的方法在实际操作中较复杂。二、平位切割含目的基因的DNA片段和运载体一一形成平末端（1）用相同或不同的限制酶切割含目的基因的DNA片段和运载 体。如果限制酶切割方式是平切，产生的末端是平末端，则可用相同 或不同的限制酶分别切割含目的基因的DNA片段和运载体，因为两个 不同的平末端在DNA连接酶的作用下可以任意连接，具体的原因是 DNA连接酶连接的仅仅是DNA双螺旋结构外侧的骨架，即磷酸与脱氧 核糖之间的磷酸二酯键和碱基无关。在 2008 年江苏生物高考第32 题 的第5 小题中就有考查关于平末端任意连接的知识点。（2）平位切割的优缺点。由于两个不同的平末端在DNA连接酶 的作用下可以任意连接,这样就不需要含目的基因的DNA片段和运载 体具有相同的限制酶识别序列，减少了对运载体的挑选和改造的工作 量。而且对于非互补的黏性末端，可以采用绿豆核酸酶等将其单链削 平或补齐，使它变成平末端，然后进行连接。在实践中，极少用平末 端，因为平末端的连接效率比较低，只有在找不到合适切成黏性末端 的酶切位点而有平末端切口的情况下才使用。总之，以上几种酶切方法在近几年的生物高考题中都有所体现，都有各自的优缺点，在解题时要根据题目中的要求进行酶切方法的选择，要学会灵活运用知识，这样才能在高考中拿到高分。