色谱分析 踏板理论

第六章 色谱法 色谱法：是一种物理或物理化学分离分析方法，将混合物中各组分分离后在线或离线分析的方法。是分析混合物的最有效的手段。 l 应用范围：定性鉴别、纯度检查、含量测定1. 色谱法基础一、常用术语1.色谱图和色谱峰色谱图或流出曲线：色谱响应信号（电信号强度）随时间的变化曲线 色谱峰：流出曲线上的突起部分。正常：正态分布曲线；不正常：拖尾峰和前延峰。色谱峰正常与否用拖尾因子衡量每个组分的色谱峰可用三项参数说明峰高或峰面积：用于定量。 峰宽W：用于衡量柱效4 峰位：用保留值tR表示，用于定性。2. 基线: U色谱分离过程中没有组分流出时的流出曲线，反映色谱系统（主要是检测器）的噪音水平3. 保留值 5 J8 F. Q C7 F! ? E: c; G3 i$ u0 Z J保留时间( tR )、死时间( t0 ) 、调整保留时间（tR ´）: tR ´= tR - t0 . q4 j7 J. o2 E& s6 A0 S e相对保留值（r）：即选择性因子，两组分的调整保留值之比，色谱系统的选择性指标。+ ?3 t# q6 K7 d5 * I2 k9 fr2,1= tR2´/ tR1´= k2/k1. a+ a9 s+ k& E6 i6 D- i4. 色谱峰区域宽度 越小，流出组分越集中，有利于分离 8 b8 o+ g m. d7 x- k标准差（ ）、半高峰宽( Wh/2)、峰宽（W） % S O D. N/ L c 二、基本理论 C0 c8 N* M( E 1. 分配系数与色谱分离. _. P7 j$ B$ k色谱过程是物质分子在相对运动的两相(固定相和流动相)间分配平衡的过程，混合物中，若两组分的分配系数（K ）和容量因子（k）不等，则被流动相携带的速度不等差速迁移，从而被分离。 1 c5 l% A2 ; （1）分配系数K：组分在固定相和流动相之间达到分配平衡时的浓度之比。, C9 r2 x% L J K = Cs/Cm 9 W2 V. w o. k, o0 |K：与组分自身特性、固定相、流动相的性质及温度有关5 J* M, Q- ) - & _5 d& d ! l色谱法分离依据：不同组分在固定相和流动相间K的差异 分离9 C% * N9 W（2）容量因子k （质量分配系数）：达分配平衡后，组分在固定相和流动相中的质量之比。8 |; y5 * q5 W0 N/ m k = Ws/Wm$ # _5 H# K6 g! u& w) _/ c4 G( _& k与K的关系： k = CsVs/(CmVm )= K(Vs/Vm) - y6 N6 % u; K3 S9 H% m. Fk: 与组分、固定相、流动相的性质及温度有关；还与两相体积有关。$ v# j ?+ x# e) K$ e* 不同组分之间的 k 差异是色谱分离的先决条件2 C6 E( Q; - y* f/ d（3）色谱过程方程 tR=t0(1+KVS/Vm)=t0(1+k) - 5 y& s, o4 v* l2. 塔板理论 7 X0 C4 C. ? g/ Y色谱柱踏板数大于103时，流出曲线趋于正态分布。) m8 g$ ?; x. M$ s( z理论踏板高(H)可由柱长（L）和理论踏板数 n 计算： _& P p. h3 VH = L /n n = 5.54 (tR/Wh/2)2 $ & E. W7 _0 ?, J8 V0 D7 M式中分子分母单位统一8 n3 N0 C0 1 D+ r7 N, g- ?H 和 n 都是柱效指标，可用于评价柱效高低。 塔板数越多，塔板高度越小，柱效越高 J$ 1 F* w: . _% V& E# f7 B- + z0 o. z I1 u6 g( w例：用HPLC法测得某组分的保留时间tR为1.5 min，半峰宽Wh/2为0.2 cm；记录纸速为2.0 cm/min，则柱效为：+ k. $ H/ L& k s: s6 HA. 1246 L* d9 s( n7 lB. 2492 8 L& G) D( q , W4 W2 U KC. 623 & G5 Y, 2 w5 L9 u; 9 iD. 1800 % C0 r6 # r) C; F: y3 N- fE. 3116 _: O4 E- 3 c5 1 V1 s, mn5.54(tR/ Wh/2)2 =5.54(1.52.0/0.2)2 =1246% D. u7 j5 ( G3. 速率理论 Van Deemter方程：H = A + B/u + Cu 9 _* V4 B$ k7 B/ _0 N8 P q3 nA为涡流扩散项，B为纵向扩散系数，C为传质阻抗项# F1 k( L/ y8 Q9 X2 e/ C- KHPLC中范式方程简化为： H = A + Cu $ N5 k# l* h; p# q, d影响液相色谱柱效的主要因素是涡流扩散和传质阻抗。 2 q# O5 q& z% & N2 三、分类：: . U7 o6 l/ G8 X中国药典将色谱法分为纸色谱法、薄层色谱法、柱色谱法、气相色谱法、高效液相色谱法、电泳法、毛细管电泳法及分子排阻色谱法等 w5 F+ a3 v: 7 q5 w- 1. 按分离原理分类： % C( _% f W( U0 j7 n- n C吸附色谱法：固定相为固体（吸附剂） 如GSC、LSC - o V5 Z7 s J* ?3 I- X8 y分配色谱法：固定相为液体 如GLC、LLC * f/ l( o h7 N k+ / 离子交换色谱法：固定相为离子交换树脂，适用于离子型的有机物或无机物的分离分析( X; L6 a G3 J& x分子排阻色谱法（空间排组色谱法、凝胶色谱法）：固定相为多孔性填料（凝胶）6 j; U9 u7 U2. 按操作形式分类：柱色谱法、平面色谱法、电泳法9 O9 f- h& * l- s第二节 薄层色谱法 thin layer chromatography TLC i6 : X, o: Q: v3 _薄层色谱法是将供试品溶液点样于涂布有固定相的薄层板上，经展开、检视后所得的色谱图，于适宜的对照物按同法操作所得的色谱图进行比较，主要用于药品的鉴别或杂质检查。+ h5 W5 E! z+ 1 H/ y( y2 r按分离原理主要分为：吸附、分配和分子排阻色谱法。吸附薄层色谱法最常用。! ( $ z. ; 2 W6 5 R9 V吸附薄层色谱法分离依据：难被吸附化合物移动快，易被吸附化合物移动慢， 差速迁移KAKB分离( P N7 X d# U) O一、仪器与材料6 y, 4 O, I q E: |. : y f1.常用的固定相% H/ n$ g3 t9 J7 C o8 Y3 8 v& S吸附TLC法的固定相为吸附剂，最常用硅胶，其次有硅藻土、氧化铝、微晶纤维素等。 W; v% / h& Y9 j$ c6 x1）硅胶：SiO2xH2O，具有硅氧交联结构、表面有许多硅醇基的多孔性微粒。硅醇基是活性基团。含水量，活性0 u* K& G# w4 F1 a2 E0 $ z: j2 活化：105 110加热30 min，吸附力增强 P( Q$ B- $ C6 p. Y, E+ S2 ( MTLC常用硅胶G 、硅胶GF254 、硅胶H 和硅胶HF254 。; y9 s. 6 I# I w- X2）氧化铝：有碱性、中性和酸性三种，中性使用最多。 8 i2 t ?$ a- O1 c/ v% o3）聚酰胺：表面有酰胺基，与酚、羧酸、氨基酸等形成氢键 6 F9 / h( 3 x* W5 s, a二、操作方法 + t & C% x9 x% B6 c1.薄层板的制备：涂布厚度0.20.3 mm。 ( 2 I& V5 k R2 R( F2.点样与展开6 U& M# U- D4 R点样的样点一般为圆点，点样基线距底边2.0cm；样点直径一般为24mm；展开时，薄层板浸入展开剂的深度为距薄层底边0.51.0cm。8 P. f U1 V- s& o0 V6 G例：关于薄层色谱的点样与展开，以下叙述正确的是 答案E* _0 m6 K* ! l- U& j& o$ r5 G& A点样的样点必须为圆点6 j% a3 z, j4 |3 |- w QB点样基线距底边越近越好，一般小于1.0cm9 R7 X6 S: . t% cC样点直径一般为24cm9 t _ G8 g- V5 aD每块板只能点1个样点，以防斑点间干扰* W: 0 S0 q3 & h pE展开时，薄层板浸入展开剂的深度为距薄层底边0.51.0cm8 m$ k) b, ? z% U3 z: A3.检视 通用型显色剂：碘、硫酸溶液、荧光黄溶液! G* T+ B W* b& G三、色谱系统适用性试验 8 k. L7 X, c7 w4 Y1 o1 Q& P( u目的： 使斑点的检测灵敏度、比移值(Rf)和分离效能符合规定 d! F+ X0 . 1.检测灵敏度 被测物质能被检出的最低量1 h2 ?% u. b: e2.比移值（Rf） 基本定性参数 ： Rf l / lo/ A 5 T* N H$ l/ Y& |9 nRf 最佳范围0.30.5；可用范围0.20.8。! P& w& b# m$ H3. 分离效能 分离度（R）表示 R2d /（W1W2） 3 M& p, a5 ?* L H两个相邻斑点中心距离于两斑点的平均宽度（直径）的比值。) T& I: K f. q$ |四、应用：TLC法主要用于药品的鉴别或杂质检查。: A) u- ?6 N# n2 d6 U(一)鉴别： 5 T* F3 ?9 D2 $ m+ m6 S将同浓度的供试品溶液、对照品溶液点在同一薄层板上展开显色后供试品、对照品颜色与比移值Rf均一致可认为供试品与对照品是同一物质。( u. F& w( I; w% x B（1）与对照品比较Rf值 （2）与结构相似的物质比较Rf值8 P0 N9 L+ V7 O( ; o1 y7 d4 W二) 杂质检查7 l M% w5 l7 B4 c t, 1 杂质对照品法： 杂质斑点颜色与杂质对照品斑点比较，不得更深可认为未超过规定的杂质最高限量。5 p # _1 ; l; o / c3 E! N自身稀释对照法（高低浓度对比法） 适用于得不到杂质对照品的情况 j; l) n2 P7 - i$ G供试品溶液按限度规定稀释成另一低浓度溶液或系列溶液，为对照溶液。供试品杂质斑点与相0 ?+ K4 G9 u4 r H 2011-8-14 10:44:19 上传下载附件 (4.15 KB) 7 p0 G; |$ G8 p# g应的自身稀释对照液所显主斑点比较，颜色不得更深 0 3 0 v% r6 m6 s第三节 高效液相色谱法(HPLC)% X5 O6 ?0 d$ g4 j. ?8 Vhigh performance liquid chromatography HPLC) D N3 v5 r y* n 高效液相色谱法是采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。1 z0 l3 s4 i& K4 s% 7 s# VHPLC法包括分配色谱法、吸附色谱法、离子交换色谱法和分子排阻色谱法。. s6 h: , y1 , 分配色谱法最常用。高效液相分配色谱法又可分为正相分配色谱法和反相分配色谱法。. D3 e! w- l6 U0 L正相分配色谱法：流动相极性固定相极性。% L R; P, N# w3 I+ m主要分离溶于有机溶剂的极性及中等极性的分子型物质。 ; E5 M2 _+ 9 J v2 反相分配色谱法：流动相极性固定相极性。主要用于分离非极性至中等极性物质。. X* g7 s% h) O, r# $ y, D一、HPLC仪器的基本结构% o3 r2 ?% x5 U- a/ O# g J高压输液泵、色谱柱、进样阀 （六通进样阀）、检测器和积分仪或色谱工作站。 ?! O# B) y% I1 Z4 b$ i二、检测器 5 K% s5 V9 i/ Y5 I) N（一）选择性检测器：也称浓度型检测器，包括紫外检测器、光电二极管阵列检测器DAD、荧光检测器、电化学检测器和质谱检测器。8 k/ / n. p- e0 G, l% v: d（1）紫外检测器：最常用。适于有共轭结构的化合物如芳香化合物、核酸及甾体激素等。利用末端吸收，还适用于有羰基、羧基等基团化合物的检测。) 5 u; W8 % _9 S（2）光电二极管阵列检测器 diode-array detector, DAD 4 H1 7 8 e6 q5 $ l3 B2 m可得到时间、波长和吸收强度的三维色谱图。可用于供试品的光谱鉴定和色谱峰的纯度检查。0 s5 y+ Z k: q3 s/ 9 l8 9 o（3）荧光检测器：仅适用于在流动相条件下具有荧光或经衍生转化为具有荧光的化合物 0 G! R, ( g w V9 d1 E2 P（4）电化学检测器： 仅适用于在流动相条件下可发生氧化-还原反应的化合物的检测。+ , R7 ?7 u1 d7 ?5 - d7 P$ c（5）质谱检测器：用于有机小分子、生物大分子药物的检测，以及色谱峰的纯度或原料药中的杂质检查。 H1 n+ P& l+ E$ Z3 E* W |% c（二）通用型检测器：也称质量型检测器，包括示差折光检测器和蒸发光散射检测器（ELSD）。 ) Q# g+ i0 m, J/ D( Q7 q& Y; n1. 示差折光检测器只对少数类别的物质如糖类的检测灵敏度高。7 v: r# p; x) L3 t2. ELSD 仅适用于UV检测困难的物质的分析，如糖类和脂质等，以及药物杂质的确认。# B: n q8 q( a1 u3 o如ChP用HPLC-ELSD法测定硫酸庆大霉素中C组分的含量。6 m, J3 A. x. F7 A三、固定相与流动相8 / r; |! K2 ?% ; W+ Q6 k a（一） 固定相 ?3 G6 A O: r X9 OHPLC最常用的固定相是化学健合相，分为非极性键合相和极性键合相 。$ m2 K$ w+ ( v/ L! a（1）非极性健合相：十八烷基硅烷健合硅胶（ODS，C18）、辛基硅烷健合硅胶（C8）， x! Y3 n0 u5 I7 G7 aODS在反相HPLC中最为常用。 ! h # n) Y; 1 （2）极性健合相：常用氨基和氰基硅烷键合相，即可用于正相色谱法，也可用于反相色谱法。多用于正相HPLC。7 J! L8 o6 / y: j5 Q- 8 o5 （二） 流动相8 i0 z# _( L/ v药物分析中应用最多的HPLC法为反相分配色谱法，流动相首选甲醇-水系统（末端波长检测时首选乙腈-水系统）。ODS为固定相时，流动相中有机溶剂比例常不低于5%。 5 U( t+ . % H$ b流动相pH值应控制在28间。 ; o+ M1 o0 p) |$ 9 c+ C分析强极性化合物常用离子抑制色谱法或离子对色谱法。) ) K9 y$ x: o0 ?离子抑制剂有：磷酸、醋酸、氨水或缓冲液（磷酸盐、醋酸盐）；分离碱类常用的离子对试剂为烷基磺酸（盐），如己烷磺酸钠、庚烷磺酸钠、十二烷基磺酸钠；分离酸类常用烷基季铵盐如磷酸四丁基铵等。, L$ ! E1 j8 s6 t4 - K四、色谱系统适用性试验 & N% y0 r2 3 |9 ; W6 o7 Z色谱系统适用性试验通常包括：理论踏板数、分离度、重复性和拖尾因子等四个指标。 ; 8 _% i$ E% d4 K. H: Z$ H在各品种项下规定的色谱条件下，除固定相种类、流动相组成、检测器类型不得改变外，其余如色谱柱内径、色谱柱长度、固定相牌号、载体粒度、流动相流速、混合流动相各组成的比例、柱温、进样量、检测器的灵敏度等，均可变 。3 ?1 s4 b) Y& d# S（1） 色谱柱的理论踏板数（n） n用于评价色谱柱的分离效能 应指明测定物质, q/ V: ?# 8 a, H# T0 1 |n16 (tR /W)2 或 n5.54 (tR /Wh/2)2 tR，Wh/2统一单位 : G ?5 w p& t: z如测得n低于规定，应改变柱长或载体性能、重填色谱柱等以求达到。 0 B- L) s/ D2 x/ E3 Z（2） 分离度 （R） a1 L! X( D1 & D; k5 d# m评价待测组分与相邻共存物或难分离物质间的分离程度，衡量色谱系统效能的关键指标，) X6 Q% & l( RR2(tR2tR1)/(W1W2) 或 R2(tR2tR1)/1.70(W1,h/2W2,h/2) . X9 |& g0 tR 1.5 / U% ; |+ M2 z测得两色谱峰的保留时间tR16.5min，tR28.3min，峰宽W11.0min，W21.4min，则两峰分离度R为+ R- c! W! B% k5 e3 vA、0.22 & Y& h* O1 C* n, uB、1.2 W, n/ J& l+ eC、2.5 3 z1 , m; t0 b- mD、0.75 & Z9 P4 N; x( T, v8 F+ n, z& d8 pE、1.5 N4 c: & S9 x（3）重复性： ! x$ K; F: p b+ v0 a对照品溶液连续进样5次，其峰面积测量值的 RSD 2.0% . d0 ?+ O* s* B( q1 x配制相当于80%、100%和120%的对照品溶液，加规定量的内标溶液，配成3种不同浓度的溶液，分别至少进样2次，计算平均校正因子，其RSD 2.0% 2 V% m S& + O6 m（4）拖尾因子（T）： T = W0.05h/2d1 T应在0.95 1.05之间 - Q7 g: O- J+ s L( 五、测定法( Z/ w7 e$ h K& u4 d$ z$ r中国药典用HPLC杂质检查方法有5种% K, S/ t# H2 b% U3 I8 y1）内标法 测定对照品和内标物质的峰面积或峰高，计算- * Y. Q( Q# W- v% * O校正因子( f ) =(As /Cs) / (AR/CR) 含量 (Cx) = f Ax / (AS /CS ) * k2 o8 & c$ ?可避免样品前处理及进样体积误差对结果的影响。) h5 L e) I7 x7 C) s9 G2）外标法 5 O1 O4 T X$ p6 q( A0 y7 d精密称(量)取对照品和供试品，配制成溶液，测量对照品溶液和供试品溶液中待测成分的峰面积(或峰高)，按下式计算含量：含量 (Cx) = CR (Ax / AR) $ d$ y( 3 z! I$ C3）加校正因子的主成分自身对照法：$ + _! 9 6 N3 C! $ j精密称(量)取杂质对照品和待测成分对照品，配制测定杂质校正因子的溶液，进样，计算杂质的校正因子。测定时，对照溶液为供试品溶液的稀释溶液，浓度与杂质限度相当。* j, c4 L: q6 i8 | V2 Y4）不加校正因子的主成分自身对照法 无对照品( A7 r6 e+ h$ n7 对照溶液为供试品溶液的稀释溶液，稀释程度应为：浓度与杂质限度相当。 l+ d r% L. D5）面积归一化法 误差较大，常用于粗略考查杂质含量，不宜用于微量杂质的检查。2 g1 # a& b7 T& 1 ; 六、应用 H/ U A- * n. S1 h3 P（一）鉴别 供试液主峰的保留时间与对照液一致9 S+ f. a& % V) （二）杂质检查 中国药典用HPLC杂质检查方法有5种6 Y7 R8 S( r- r) _1）内标法 丙酸倍氯米松酚雾剂的雾粒分布的检查 丙酸睾丸素为内标6 c+ V( y, K; e2）外标法 二羟丙茶碱中有关物质中的茶碱检查0 v( j- d5 x, |1 |3）加校正因子的主成分自身对照法 红霉素中红霉素B、C组分及有关物质检查( w: I) L4 1 D* |, ?2 W- t4）不加校正因子的主成分自身对照法 头孢克肟中有关物质检查( b2 V) T6 B% X* Y5）面积归一化法 胰岛素中相关蛋白质的检查& M* I& t8 p# t/ A + B2 U（三）含量测定 s! D2 m! z S: a6 内标法（甲地高辛、加校正因子内标法测布洛芬伪麻胶囊）、外标法（炔诺酮）: G( o+ v* 3 A( H% 对内标物质的要求：原供试品中不含有的组分；其保留时间与待测组分相近，但能完全分开。纯度符合要求。) % q. K& a0 m E( 第四节 气相色谱法 . Y) L4 . b& z- 气相色谱法（gas chromatography，GC） 系采用气体流动相流经装有填充剂的色谱柱进行分离测定的色谱方法；不适于难挥发和热稳定性差的物质的分析 - Q5 i; R N2 B8 B5 D7 h一、仪器的基本结构 , s+ O5 s/ n. 8 |0 _ O6 气相色谱仪由载气源、进样部分、色谱柱、柱温箱、检测器和数据处理系统等组成。0 V/ w 9 E+ G2 c2 j1. 载气源 可用氦、氮、氢作载气，常用载气为氮气。 7 E. H! m4 F: q7 p j# o2. 进样部分 进样方式可分为溶液直接进样或顶空进样 |( o( t* B F1 I顶空进样：适宜于固体和液体样品中挥发性组分的分离和测定。在恒温控制的加热室中加热至供试液中挥发性组分在非气态和气态达到平衡后，由进样器自动吸取一定体积的顶空气注入色谱柱。* A7 A1 e0 e2 0 i+ q7 N. 3. 色谱柱 填充柱或毛细管柱; h4 e3 D& ( W% h9 a填充柱常用固定液有甲基聚硅氧烷、聚乙二醇 . O8 i1 e3 l( 4 b( M毛细管柱常用固定液有甲基聚硅氧烷、不同比例组成的苯基甲基聚硅氧烷、聚乙二醇 F3 n0 + q+ G) h- t* c7 I2 S( f7 _毛细管色谱柱分为（1）开管型毛细管柱（涂壁毛细管柱WCOT、载体涂层毛细管柱SCOT）（2）填充型毛细管柱& l( s4 O) x* p4. 柱温箱 控温精度在1 , C9 X/ H6 i) N: ?3 V# 2 H5. 检测器： 火焰离子化检测器（FID）、热导检测器 （TCD）、氮磷检测器（NPD）、火焰光度检测器（FPD）、电子捕获检测器（ECD）、质谱检测器（MS）等。8 k6 t u6 D. I7 6. 数据处理系统( O. i6 l7 J F% W二、检测器- q9 m$ A: N* j# p# r! l t气相色谱检测器可分为浓度型检测器和质量型检测器。浓度型检测器有热导检测器、电子捕获检测器ECD0 P, 7 t2 s5 6 r0 1.火焰离子化检测器（FID）7 I* d, Z) G) y o+ q0 |$ C氢气为燃气，空气为助燃气。检测器温度应高于柱温，并不低于150®¾防水气凝结，（否则倒流），通常为 250 - 350 ; c) _% q& ?4 b. ! F2.电子捕获检测器（ECD） 主要用于含卤素药物 : m3 v1 L- P5 p3.质谱检测器（MS） 能给出相应的结构信息( L- d: c+ q$ c% o T5 V4.热导检测器 （TCD） 检测组分的浓度变化 0 i5 K( e) ?( q0 n三、常用固定液与载体- % b) W N& E/ |) s+ u+ H8 m基于分配机制分离的气液色谱法（GLC）是最为常用的气相色谱方法。GLC的固定相是由固定液和载体组成。3 S0 W j, r9 F2 * I/ l（一）常用的固定液：7 e! X% r) F V2 . e& l烃类：常用的角鲨烷（鲨鱼烷）是标准非极性固定液1 e* d5 m. |4 E) w. r硅氧烷类 ：应用最广的通用型固定液 ，主要有甲基硅氧烷（SE-30）和苯基硅氧烷（SE-52、OV-17、OV-25等）8 Q9 g0 P$ q5 V; V z醇类：聚乙二醇（如PEG-20M） 是药物分析最常用的固定液之一. v7 D9 n% P7 i* e（二）载体（担体） 作用：承载固定液. Q. b& g% V4 y为化学惰性的多孔性微粒，常用硅藻土型载体：分为红色载体和白色载体。7 U r! M1 p O) V1 Z8 - O, U四、色谱系统适用性试验5 X; b. k1 4 j! a! g在各品种项下规定色谱条件下，除检测器种类、固定液品种及特殊指定的色谱材料不得改变外，其余如色谱柱内径、长度、载体牌号、粒度、固定液涂布浓度、载气流速、柱温、进样量、检测器的灵敏度等，均可适当改变。( W, E+ Z) y% 7 Q, U五、测定法$ p. % B: T, v* f内标法、外标法、面积归一化法、标准溶液加入法 I& - % M6 g0 Z1 |: D( ! N标准溶液加入法：精密称（量）取杂质或者待测成分对照品适当浓度的对照品溶液精密加入到供试品溶液中，根据外标法或内标法测定杂质或待测成分含量，再扣除加入的对照品溶液含量，即得杂质或待测成分含量。! |( g4 |, k, q0 g0 2 六、应用9 k, - u0 B! B/ ?（一）鉴别 供试液主峰的保留时间与对照品溶液一致+ H+ g% d8 u A（二）杂质检查： 内标法、外标法、面积归一化法和标准溶液加入法0 D+ S4 g5 r L, r（三）含量测定： 内标法、外标法和标准溶液加入法0 C* u3 t6 k. o& C8 P0 T第五节 电泳法 & G x7 w H% * x7 a, S3 u电泳法（electrophoresis） 是指带电荷的供试品在惰性支持介质中，在电场的作用下，向其对应的电极方向按各自的速度进行泳动，使组分分离成狭窄的区带，用适宜的检测方法记录其电泳区带图谱并计算其含量（%）的方法。 / * 4 Q; L i一、基本原理7 q+ 8 o9 ?# 4 L, Y% U4 P1 HvmE5 p M8 & 0 F; R4 B双电层与电渗：电泳所用的支持物(如滤纸)在溶液中带负电，而使接近其表面的缓冲液带正电，且形成双电层。在电场的作用下，带正电的缓冲液整体向负极移动，形成电渗。* I1 Q0 i+ |% J5 V0 E0 F, M电泳分离后各组分的相对位置由组分的电泳泳动和缓冲液的电渗共同决定的。& 9 g( R 8 l4 I0 e H; n1 y影响电泳分离的因素：(1)缓冲液的pH值和离子强度 (2)电场强度 (3)样品浓度# b( E) ) V1 w# M Q! P6 P二、平板电泳法 # w / r5 S U9 s J0 V* s1 h(1) 纸电泳法* 5 w0 a* i. Y0 X. m. a(2) 醋酸纤维素薄膜电泳法6 M6 U7 ! d+ R) h: G4 D (3) 琼脂糖凝胶电泳法. ?) e2 X, o3 h( L(4) 聚丙烯酰胺凝胶电泳法3 P3 F+ m8 0 D8 z( L (5) SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法 测定蛋白质分子量/ L3 V4 a$ m5 T4 S三、毛细管电泳法（capillary electrophoresis，CE）/ X# l r$ % N0 n以弹性石英毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，依据样品中各组分淌度和（或）分配行为上的差异而实现分离。$ d O# i4 t1 N% ! g毛细管电泳的主要分离模式： b2 u( _4 Z s; j# 1.毛细管区带电泳(CZE) Y& D( _/ ) X S5 b: v Y3 g2.毛细管凝胶电泳(CGE) 3.毛细管等速电泳(CITP) 4.毛细管等电聚焦电泳(CIEF5.胶束电动毛细管色谱 (MEKC或MECC)- F- Q1 R/ ?! S b2 |8 6.毛细管电色谱(CEC)5 O: A2 a9 w, w5 r, 1 u8 n四、应用 & n3 U$ t L2 j a A1.鉴别（主成分与对照品迁移率一致）用琼脂糖凝胶电泳法对肝素钠乳膏进行鉴别: U2.分子量测定 用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法对注射用重组人促红素分子量进行测定3.纯度检查4.等电点测定 5.分子组分比的测定