荧光定量PCR原理及操作步骤ppt课件

荧光定量PCRreal time-PCR定量定量PCR反应体系反应体系 actinachialyvlgstat actinachialyvlgstat模板cDNA4ulTag mixture10ul引物10.5ul引物20.5ulH205ul1模板2模板 443.45ng/ul686.75 ng/ul 17.738 ng/ul26.47 ng/ul 常规常规PCR技术：技术：对对PCR扩增反应扩增反应的的终产物终产物进行定进行定量及定性分析量及定性分析定量定量PCR技术技术：通过对通过对PCR扩增反扩增反应中应中每一个循环产每一个循环产物物荧光荧光信号的信号的实时实时检测检测从而实现对从而实现对起起始模板始模板定量及定性定量及定性的分析的分析三个关键词：三个关键词：实时，定量，荧光实时，定量，荧光PCR分四个阶段 Ct值的定义是值的定义是PCR扩增过程中，荧光信号扩增过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的阈值所对开始由本底进入指数增长阶段的阈值所对应的应的循环次数循环次数。确定初始模板的浓度确定初始模板的浓度q初始初始 DNADNA量越多量越多,荧光荧光达到某一值（域值）时达到某一值（域值）时所需要的循环数越少所需要的循环数越少qLogLog浓度与循环数呈线浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增性关系，根据样品扩增达到域值的循环数就可达到域值的循环数就可计算出样品中所含的模计算出样品中所含的模板量板量起点定量与终点定量。SYBR Green 1 结合到双链DNA的小沟部位SYBR Green 1 染料只有和双链DNA结合后才发荧光GTTTGGCCCCCCCAAAGGGACTTGATAGCATCGTAAGTTTTTTGGGGCCCCCCCCAAAAATACCGGGGTTACGAACG GTAAT未结合SYBR Green 1 dye 起始模板浓度定量 融解曲线分析 -可区分单一产物、变异产物、多种产物和（或）引物二聚体 基因型分析PCR程序指南UNG酶使用原理金牌Tag酶活性参比荧光：管家荧光ROXROX校正效果校正效果96孔板设置举例PCR曲线标准曲线