新型食品发酵重点

1.1.2 发酵的定义（1）狭义 “发酵”的定义在生物化学或生理学上发酵是指微生物在无氧条件下，分解各种有机物质产生能量 的一种方式，或者更严格地说，发酵是以有机物作为电子受体的氧化还原产能反应。如葡萄糖在无氧条件下被微生物利用产生酒精并放出二氧化碳。同时获得能量，丙 酮酸被还原为乳酸而获得能量等等。（2）广义 “发酵”的定义工业上所称的发酵是泛指利用生物细胞制造某些产品或净化环境的过程，它包括厌 氧培养的生产过程，如酒精、丙酮丁醇、乳酸等，以及通气（有氧）培养的生产过 程，如抗生素、氨基酸、酶制剂等的生产。产品即有细胞代谢产物，也包括菌体细 胞、酶等。1.1.3 发酵工程（Fermentation Engineering）的定义发酵工程，是利用“生物细胞”的特定功能，通过现代工程技术手段（主要是发酵罐 或生物反应器的自动化、高效化、功能多样化和大型化）生产各种特定的有用物质， 或者把微生物直接用于某些工业化生产的一种生物技术体系。这里的“生物细胞”包 括微生物细胞和动物、植物细胞及其固定化细胞。因此，发酵工程使渗透有工程学 的微生物学，是发酵技术的工程化。 发酵工程是化学工程与生物工程技术相结合的产物，它将微生物学、生物化学、化 学工程学等的基本原理和技术有机地结合在一起，利用微生物进行规模化生产，是 生产加工与生物制造实现产业化的核心技术。 发酵工程技术主要包括提供高性能生产菌种的菌种技术、实现低成本大规模生产产 品的发酵技术和最终获得合格产品的分离纯化技术。进行发酵工程的关键技术（菌 种技术、发酵技术和分离技术）及重大产品的研究开发，将发挥中国丰富的生物资 源优势，提高发酵工程的技术水平，促进生物化工、生物医药、食品加工等相关行 业的产品竞争力和可持续发展。 具体说来，发酵工艺过程的主要内容包括：发酵原料的选择及预处理，微生物菌种的选育及 扩大培养，发酵设备选择及工艺条件控制，发酵产物的分离提取，废弃物的回收和利用等。发酵工程的产品可分为以下六大类： （ 1 ）微生物菌体细胞 如酵母菌、食用菌、微生物农药的生产。 （ 2 ）微生物酶类 如各种酶种、酶制剂和各种曲类的生产。 （ 3 ）微生物代谢产物 如初级代谢产物氨基酸、有机酸、有机溶剂、核苷酸、蛋白 质、核酸和维生素等，次级代谢产物抗生素、生物碱和植物激素的生产等。 （ 4 ）微生物的转化产物 利用微生物代谢过程中的某一种酶或酶系将一种化合物转 化成含有特殊功能基团产物的生物化学反应。如将甘油转化为二羟基丙酮，将葡萄 糖转化为葡萄糖酸，将山梨醇转化为L-山梨糖等。特别是甾体激素的转化受到了广 泛的重视。 （ 5 ）工程菌发酵产物 20 世纪 70 年代兴起的基因工程和细胞工程，取得了飞跃的 发展。通过基因工程和细胞工程创造出许许多多的具有特殊功能的“工程菌”，用发 酵技术可以生产出更多更好的产品，发挥更大的经济效益。 （ 6）动物、植物细胞大规模培养的产物 如利用木瓜细胞大规模培养生产木瓜蛋白 酶，利用植物细胞培养技术生产天然食用色素等。1.3 发酵的类型根据发酵的特点和微生物对氧的不同需要，可以将发酵分成若干类型： （1）按发酵原料来区分：糖类物质发酵、石油发酵及废水发酵等类型。 （2）按发酵产物来区分：如氨基酸发酵、有机酸发酵、抗生素发酵、酒精发酵、维 生素发酵等。 （3）按发酵形式来区分，则有：固态发酵和深层液体发酵。 （4）按发酵工艺流程区分则有：分批发酵、连续发酵和流加发酵。 （5）按发酵过程中对氧的不同需求来分，一般可分为：厌氧发酵和需氧发酵（通风 发酵）两大类型。1.4 发酵工程的特点 （1）发酵工程使用的原料来源广泛，多为农副产品，其中以碳源为主，只加入少量 有机和无机氮源，不含有毒物质。 （2）发酵工程的反应过程比较温和，通常在常温、常压下进行。而且，反应过程是 以生物体的自身调节方式进行，多个反应就像是一个反应一样，可在单一设备中进 行，因此一种设备可有多种用途。 （3）容易进行复杂的高分子化合物的生产，如酶、化学活性体等。 （4）能够高度选择性地进行复制化合物在特定部位的反应，如甾体化合物的氧化、 还原等。 （5）生产产品的微生物菌体本身也可作为发酵产物。例如，富含蛋白质、酶、维生 素的单细胞蛋白等。 （6）发酵过程是纯种培养过程。生产中使用的设备、管道、截门和培养基都必须严 格灭菌，通入的空气也应该是无菌空气。在操作中应特别注意严格防止污染，尤其 要防止噬菌体的侵入，否则，会引起重大的损失。 （7）在不增加任何设备投资的情况下，通过菌种选育，改良菌种的生产性能来提高 生产能力，可以达到事半功倍的效果。 （8）在发酵生产中，还可以通过改进工艺技术和设备来提高产品的产量和质量。 基于以上特点，工业发酵日益引起人们重视。和传统的发酵工艺相比，现代发酵工 程除了上述的发酵特征之外更有其优越性。除了使用微生物外，还可以用动植物细 胞和酶，也可以用人工构建的“工程菌来进行反应；反应设备也不只是常规的发酵 罐，而是以各种各样的生物反应器而代之，自动化连续化程度高，使发酵水平在原 有基础上有所提高和和创新。发酵工程也有一些问题需要引起重视： （1）底物不可能完全转化为目的产物，而且会有很多副产物产生。如四环素发酵液 中除了有四环素外，还会有金霉素、差向四环素、脱水四环素等副产物。这些副产 物的存在，给提取和精制带来了一定的困难。 （2）由于发酵工程采用的是活细胞，其产物的生产率一方面受外界环境的影响，另 一方面受细胞自身的影响，所以工艺控制比较困难，生产波动比较大。 （3）发酵工程需要的辅助设备多，如空气压缩机、空气净化系统、冷却水系统、灭 菌用蒸汽系统等。因此，动力费用比较高。 （4）发酵中，因为底物浓度不能过高，导致需要使用大体积的反应器。 （5）发酵废液中具有较高的COD和BOD，排放前，必须经过处理。1.5发酵工程的应用范围 （1）发酵工程在食品工业上的应用 食品工业是世界上最大的工业之一，也是微生物技术最先开发应用的领域。例如以 糖类物质为主要原料酿造葡萄酒、白酒、黄酒和啤酒，以牛奶为原料生产奶酒、奶 酪、酸奶等发酵乳制品，以淀粉类物质为主要原料生产谷氨酸、赖氨酸等，以豆类 和谷物为原料生产酱油、醋、腐乳和泡菜等，以及用各种原料生产单细胞蛋白等。近年来，发酵工程应用于食品生产和开发，促进了食品工业的飞速发展，主要体现 在四个方面：一是对食品资源的改造与改良；二是将农副原材料加工成商品，如酒 类、调味品等发酵产品；三是对产品进行二次开发，形成新的产品，如许多食品添 加剂等；四是对传统食品加工工艺进行改造，降低能耗，提高产率，改善食品品质 等。1.6 发酵工程的发展史 1.6.1 天然发酵阶段 从几千年前一直到19 世纪，人们利用自然发酵现象，从事酿酒、酱、醋、奶酪 等生产，并积累了有关发酵的经验。但对这种“发酵”的本质的了解，直到19世纪末 仍然是一知半解。因此，当时完全是凭经验而进行家庭作坊式生产，时常被杂菌污 染所困扰。可见 19 世纪末以前的很长时间，发酵工程处于天然发酵阶段，主要产品 有各种饮料酒、酒精、酱、酱油、醋、干酪、酸乳及酵母等。多数产品为嫌气发酵 非纯种培养，凭经验传授技术，产品质量不稳定是这个阶段的特点。 1.6.2 微生物纯培养技术的建立 人类历史上第一个真正看到并描述微生物的人，是荷兰商人、博物学家安东-列文虎 克（Antonie van Leeuwenhoek），他利用自己发明制造的显微镜发现了微生物世界（当 时被称为微小动物）。但此后的 200 年间，微生物学的研究基本上停留在形态描述和 分门别类的阶段。直到19世纪中叶，巴斯德通过著名的Pasteur实验，证明了发酵 原理，指出发酵现象是微小生命体进行的化学反应。其后，他连续对当时的乳酸发 酵、酒精发酵、葡萄酒酿造、食醋制造等各种发酵现象进行研究，明确了这些不同 类型的发酵是由形态上可以区分的各种特定的微生物所引起的。他指出， “酒精发酵 是由于酵母的作用，葡萄酒的酸败是由于酵母以外的另一种更小的微生物（醋酸菌） 的第二次发酵作用所引起的。 ”随之发明了著名的巴氏消毒法，使法国葡萄酒酿造业 免受酸败之苦。巴斯德也因此被人们誉为“发酵之父”。 其后不久，布雷菲尔德（Brefeld）创建了霉菌的纯粹培养法（1872年）；汉逊（Hansen） 建立了啤酒酵母的纯粹培养发酵（1878年）；柯赫（Koch R）完成了细菌纯粹培养 技术（1872 年），从而确立了单种微生物的分离和纯粹培养技术，使发酵技术从天 然发酵转变为纯粹培养发酵。为此，人们设计了便于灭除其他杂菌的密闭式发酵罐 以及其他灭菌设备，开始了乙醇、甘油、丙酮、丁醇、乳酸、柠檬酸、淀粉酶和蛋 白酶等的微生物纯种发酵生产，与巴斯德以前的自然发酵是两个迥然不同的概念。 此阶段称为发酵工程的第一个里程碑以微生物的纯种培养技术为主要特征。 1.6.3 微生物液态深层发酵技术的建立 1929年，弗莱明（Fleming A）发现了青霉菌能抑制其菌落周围的细菌生长的现象， 并证明了青霉素的存在。但由于当时青霉素的产量非常低，并未受到广泛重视。其 后在1940年，钱恩（Chain E B）和弗洛里（Florey H）两位博士精制出青霉素，并 确认青霉素对伤口感染症比当时的磺胺药剂更具疗效，加上第二次世界大战爆发， 青霉素作为医治战伤感染的药物而大力推进了青霉素的工业化生产和研究，成功创 立了液态深层发酵技术。采用液态深层发酵技术，再配以离心、溶剂萃取和冷冻干 燥等技术，使青霉素的生产水平有了很大提高，其中发酵水平从液体浅盘发酵的 40UmL-1效价提高到200UmL-1 （1943年）。随后，链霉素、金霉素等抗生素相继 问世，抗生素工业迅速崛起。此阶段称为发酵工程的第二个里程碑以微生物液 态深层发酵技术为主要特征。 164微生物酶转化及代谢调控技术的应用 1950年一I960年，随着基础生物科学如生物化学、酶化学、微生物遗传学等学科的 飞速发展，再加上新型分析方法和分离方法的发展，发酵工程领域有了两个显著进 步。其一是采用微生物进行甾体化合物的转化技术，其二是以谷氨酸等发酵生产成 功为代表的代谢控制发酵技术的出现。前者以美国为中心，采用微生物的生化反应， 将载体转化成副肾上腺皮质激素、性激素等技术，进行了非常广泛研究，结果几个 甾体化合物系列的激素投入工业化生产。后者是1956年由日本的木下祝郎弄清楚了 生物素对细胞膜通透性的影响，在培养基中限量提供生物素影响了膜磷脂的合成， 从而使细胞膜的通透性增加，谷氨酸得以排出细胞外并大量积累。1957 年，日本将 这一技术应用到谷氨酸发酵生产中，从而首先实现了 L-谷氨酸的工业化生产。谷氨 酸工业化发酵生产的成功促进了代谢调控理论的研究，采用营养缺陷型及类似物抗 性突变株实现了 L-赖氨酸、L-苏氨酸等的工业化生产。此阶段称为发酵工程的第三 个里程碑一一以微生物酶转化及代谢调控技术为主要特征。 165 微生物发酵原料的拓宽 1960年1970年这段时期，微生物代谢调控技术在发酵工程中得到了广泛的应用， 几乎所有的氨基酸和核苷酸物质都可以采用发酵法生产。同时，石油微生物的发现， 发酵原料多样化开发研究的开展，促进了单细胞蛋白发酵工业的兴起，使发酵原料 由过去单一性碳水化合物向非碳水化合物过渡。从过去仅仅依靠农产品的状况，过 渡到从工厂、矿业资源中寻找原料，开辟了非粮食（如甲醇、甲烷、氢气等）发酵 技术，拓宽了原料来源的途径。此时期称为发酵工程的第四个里程碑一一以发酵原 料的转变或拓宽为主要特征。 166 微生物基因工程育种 1953年，Watson J D与Crick F H C提出了 DNA的双螺旋结构，为基因重组奠定了 基础。20世纪70年代成功地实现了基因的重组和转移。随着重组DNA技术的发展， 人们可以按预定方案把外源目的基因克隆到容易大规模培养的微生物（如大肠杆菌、 酵母菌）细胞中，通过微生物的大规模发酵生产，即可得到原先只有动物或植物才 能生产的物质，如胰岛素、干扰素、白细胞介素和多种细胞生长因子等。从过去繁 琐的随机选育生产菌株朝着定向育种转变，这给发酵工程带来了划时代的变革，被 称为发酵工程的第五个里程碑一一以引入基因工程，达到微生物定向育种为主要特 征。思考题1. 什么是发酵？发酵工程是指什么？2. 发酵工程经历了几个主要的发展阶段？3. 发酵工程的内容及特点是什么？第 2 章 发酵工业菌种选育工业发酵生产水平的高低取决于生产菌种、发酵工艺和后提取工艺三个因素，其中 拥有良好生产菌种是前提，菌种质量好坏直接影响了发酵产品的产量、质量及其成 本。例如，青霉素的发酵生产，在投产之初只有40UmL-1，得到黄色晶体，青霉素纯度 很低，价比黄金；而现在采用新型菌种可以达到60000UmL-1以上，得到晶体为纯 白色，青霉素纯度高达95%以上，成本不到0.1元。青霉素发酵生产的这种质的飞跃，生产所用菌种在其中起了关键作用。菌种选育有何意义？菌种选育的意义：提供产量A提咼产品质量改善加工工艺和开发新产品。在科学研究中，通过菌种选育还可以了解菌种的遗传学性质代谢作用是生物体维持生命活动过程中的一切生化反应的总称，是生命活动的最基本 特征，与生命的存在、发展紧密相联。根据代谢产物的生理作用不同，将代谢分为初级代谢和次级代谢两种类型。初级代谢主要是指把营养物质转化为机体结构和生理活性物质以及提供能量的代谢 作用。微生物通过初级代谢途径，产生微生物自身生长繁殖所必需的代谢产物，这些产物 称为初级代谢产物。初级代谢产物包括分解或合成过程中的各种中间代谢物、前提物、高分子物质以及 能量代谢和代谢调控中起作用的各种物质，如氨基酸、核苷酸、蛋白质、多糖和核 酸等。次级代谢是微生物在一定的生理阶段出现的一种特殊代谢类型，是某些微生物为了 避免在代谢过程中某些代谢产物的积累造成的不利作用，而产生的一类有利于生存 的代谢类型。次级代谢产物通常是在生长后期合成。次级代谢产物是通过次级代谢合成的产物，女口抗生素、生物碱、色素、激素和毒素 等，这些产物是对微生物本身无明显生理作用或对自身生长是非必需的，但对产生 菌的生存可能有一定价值。2.1.2 工业发酵对生产菌种的一般要求 (1)菌种不能是病源菌，不能产生任何有害的生物活性物质或毒素，以保证产品的 安全性。(2)有在较短的发酵周期内产生大量发酵产物的能力。(3)在发酵过程中不或少产生与目标产物性质相近的副产物及其他产物，可提高营养物质的转化率，减少分离纯化的难度，降低成本，提高产品的质量。(4)生长繁殖能力强，生长、反应速度快，发酵周期短，产抱菌应具有较强的产抱子能力。(5)原料来源广，价格低廉，菌种能高效地将原料转化为产品。(6)对需要添加的前体物质有耐受能力，并不能将前体作为一般碳源利用。(7)菌种纯，遗传特性稳定，抗噬菌体能力强，以保证发酵生产和产品的稳定性。213工业发酵生产菌种来源(1) 从自然界分离筛选。 自然界是新菌种和优良菌种的宝库。但一般从自然界直接分离到的菌种，大多数不能立即适应实际生产需要。因为在正 常生理条件下，微生物的主要特性是快速生长和繁殖，但是，发酵工业的目的主要 是积累大量的代谢产物。因此从自然界分离到的菌种往往要通过菌种改良即菌种选 育，才能得到符合工艺要求的菌种。 (2)从菌种保藏机构获得。这些菌种离生产工艺要求已基本接近或接近，稍加选育即容易获得优良菌种，可节省人力和时间。 （3）从生产过程中已有菌种中筛选发生正突变的优良菌种。无论菌种来源如何，为满足发酵工艺对菌种的要求，一般都需要对获得的菌种进行改良和纯 化。选择和培育适合的优良菌种是重要的环节。菌种选育就是按照生产的要求，根据微生物遗传和变异的理论，用自然或人工的 方法造成菌种变异，再经过筛选而达到菌种改良的目的。菌种选育方法主要包括自然选育、诱变育种、杂交育种和基因工程育种。2.2.1 自然选育概念：口 在生产过程中，不经过人工诱变处理，利用菌种的自然突变（Spontaneons Mutatiton） 而进行菌种筛选的过程，称为自然选育或自然分离。口 自然突变就是指某些微生物在没有人工参与下所发生的那些突变。称它为自然突变 绝不意味着这种突变是没有原因的。口 一般认为引起自然突变有两个原因：即多因素低剂量的诱变效应和互变异构效应。口 所谓多因素低剂量的诱变效应，是指自然突变实质上是由一些原因不详的低剂量诱 变因素引起的长期综合效应，例如充满宇宙空间的各种短波辐射、自然界中普遍存 在的一些低浓度诱变物质以及微生物自身代谢活动中所产生的一些诱变物质（如过 氧化氢）的作用等。口所谓互变异构效应是指四种碱基的第六位上的酮基和氨基，胸腺嘧啶（T）和鸟嘌 吟（G）可以酮式或烯醇式出现，胞嘧啶（C ）和腺嘌吟（A）可以氨基式或亚氨基 式出现。平衡一般倾向于酮式和氨基式，因此，在DNA双链结构中以AT和GC碱 基对为主。口可是在偶然情况下，T也会以稀有的烯醇式形式出现，因而在DNA复制到达这一位 置的一瞬间，通过DNA多聚酶的作用，在它的相对位置上就不出现A而出现Go 同样，如果C以稀有的亚氨基形式出现，在新合成的DNA单链的相对位置上就将 是A而不是Go这或许就是发生相应的自然突变的原因。由于在任何一瞬间，某一 碱基是处于酮式或烯醇式还是氨基式或亚氨基式状态目前还无法预测，所以要预言 在某一时间、某一基因将会发生自然突变是难以做到的。但是，人们对这些偶然事 件作了大量统计分析后，还是可以发现并掌握其中规律的。例如，据统计，碱基对 发生自然突变的几率约为10-810-9。口 自然突变有两种情况，一种是生产上所不希望有的，表现为菌种的衰退和生产质量 的下降；另一种是对生产有益的。为此，为了确保生产水平不致下降，生产菌株经 过一定时期的使用后须纯化，淘汰衰退的；保存优良的菌种。这就是通常所指的菌 株的自然分离。口 自然选育是一种简单易行的选育方法，它可以达到纯化菌种、防止菌种衰退、稳定 生产、提高产量的目的。但是自然选育的最大缺点是效率低、进展慢，很难使生产 水平大幅度的提高。因此，经常把自然选育和诱变育种交替使用，这样可以收到良 好的效果。口 自然选育（自然分离）的一般程序，是把菌种制备成单孢子悬浮液，经过适当的稀 释以后，在固体平板上进行分离，挑取部分单菌落进行生产能力的测定，经反复筛 选，以确定生产能力更高的菌株代替原来的菌株。口 自然选育的菌种来源于自然界、菌种保藏机构或生产过程，从自然界中选育菌种的 过程较为复杂，而从生产过程或菌种保藏机构得到菌种的自然选育过程较为简单。因此，下面以从自然界中选育菌种的过程为例，阐述菌种自然选育的主要步骤。口其具体做法一般分为四个步骤：样品采集、增殖培养、纯种分离和筛选等。如果产 物与食品制造有关，还要对菌种进行毒性鉴定，见图 2-2。土壤往往是首选的采集目标 微生物的营养需求和代谢类型与其生长环境有很大关系。富集培养 由于采集样品中各种微生物数量有很大差异，若估计到要分离的菌种数量不多时，就要 人为增加分离的概率，增加该菌种的数量，称为富集培养。如果采集样品中需要的菌种 本来就多，就不需要再作富集培养，直接进行分离即可；如果一次增殖数量不够，可以 继续进行富集培养，直至达到分离要求。口 为了所需菌种增殖后在数量上占优势，一般人为地加入一定的限制因素。该种限制 因素需根据具体情况而定。口 常用的有两种方法，一是控制一定的养分，二是控制一定的培养条件。口 控制培养基的养分是根据目的菌种的营养特性，在增殖培养基中加入相应的底物作 为唯一碳源或氮源，样品中能够分解利用底物的菌株因营养充足而迅速繁殖，而其 他微生物则由于不能分解利用底物致生长受到抑制。富集培养基的选择性只是相对 的，能在该种培养基上生长的微生物并非单一菌株，而是营养类型相同的微生物群。富集培养还可以通过控制一定培养条件以达到有效分离的目的。可采用高温、高压、加入抗生素等方法抑制非目的菌株的生长，以使目的菌株的比例增加。 口 所以增殖培养在菌种选育过程中是很关键的一步。常用的纯种分离方法有三种，即划线分离法、稀释分离法和组织分离法。 要在平板上得到纯的菌落，关键步骤是制备单孢子或菌体悬浮液。在以上三种分离方法中，划线分离和稀释分离两种方法的依据是相同的。划线法简单，较快， 稀释法在培养基上分离的菌落单一均匀，获得纯种的概率大，特别适用于分离具有蔓延性的 微生物，如霉菌。组织分离法适用于分离高等真菌。在具体应用中采用哪种方法，应视实际 情况而定。培养条件的控制： 营养成分控制 控制培养基的酸碱度 添加抑制剂 热处理 控制培养温度 通气条件的控制 初筛可分为两种情况进行a. 平板筛选b. 摇瓶发酵筛选（6）微生物选择性分离的原理和方法口 在菌种的分离筛选过程中，为了提高筛选的效率，通常要根据菌种的特性，设计具 有选择性的分离筛选方案，通过控制营养和培养条件以有利于待分离菌株的生长和 抑制非目的微生物的生长，或通过添加显色剂、指示剂以方便待分离菌株的挑选。 在常见选择性分离方法中，除了控制培养基营养成分和控制培养条件外，还有根据 目的微生物的生理特性或利用某些代谢产物生化反应来设计选择培养基，通过观察 微生物在选择培养基上生长状况或生化反应进行分离的方法。口这种利用平板的生化反应进行分离的方法有以下几种：变色圈法 ; 透明圈法 ; 生长圈法 ; 抑菌圈法 . 采用抑菌圈法，不仅能筛选抗生素，还能筛选某些酶类。2.2.2 诱变育种2.2.2.1.诱变育种的基本原理口 诱变育种的理论基础是基因突变。口 所谓基因突变是指由于染色体和基因本身的变化而产生的遗传性状的变异。口 突变主要包括染色体畸变和基因突变两大类。口 染色体畸变是指染色体或 DNA 片段的缺失、易位、逆位、重复等，而基因突变是指 DNA 分子结构中的某一部位发生变化（又称点突变）。口 根据突变发生的原因又可分为自然突变和诱发突变。口 所谓自然突变是指在自然条件下出现的基因突变，而诱发突变是指用各种物理、化 学因素人工诱发的基因突变。诱变因素的种类很多，有物理的、化学的和生物的三 大类，见表 2-6。口经诱变处理后，微生物的遗传物质，DNA和RNA的化学结构发生改变，从而引起 微生物的遗传变异。由于引进了诱变剂的处理，故诱变育种使菌种发生突变的频率 和变异的幅度得到了提高，从而使筛选获得优良特性的变异菌株的几率得到了提高。2.2.2.2 诱变育种的一般步骤口 利用各种诱变剂处理微生物细胞，提高基因的随机突变频率，扩大变异幅度，通过 一定的筛选方法，获取所需要优良菌株的过程，称为诱变育种。口 诱变育种包括诱变和筛选两个部分。口 诱变部分包括由出发菌株开始，制出新鲜孢子悬浮液（或细菌悬液）作诱变处理， 然后以一定稀释度涂平皿，至平皿上长出单菌落等各步骤。因诱发突变是使用诱变 剂促使菌种发生突变，所以诱发所形成的突变与菌种本身的遗传背景、诱变剂种类 及其剂量的选择和合理使用方法均有密切关系，亦可说这三者是诱变部分的关键所 在。口 筛选部分包括经单孢子分离长出单菌落后随机挑至斜面，经初筛和复筛进行生产能 力测定和菌种保存（即将筛选出来的高产菌种保藏好）。口 因此，可以认为，诱变育种的整个过程主要是诱变和筛选的不断重复，直到获得比 较理想的高产菌株。最后经考察其稳定性、菌种特性、最适培养条件等后，再进一 步进行中试、放大。2.2.2.3 诱变育种应注意的问题口 诱变成功的关键包括出发菌株的选择、诱变剂种类和剂量的选择，以及合理的使用 方法等。（1）出发菌株的选择口出发菌株是指用于育种的起始菌株（parent strain）。作为出发菌株，一般应具备特定 生产性状的能力或潜力、对诱变剂的敏感性大、变异幅度广等条件。口 出发菌株通常有三种：一是从自然界分离得到的野生型菌株；二是通过生产选育， 即由自发突变经筛选而得到的高产菌株；三是已经诱变过的菌株，这类菌株作为出 发菌株较为复杂，一般认为已经诱变获得的高产菌株，再诱变易产生负突变，再度 提高产量比较困难，但有些高产突变往往需要经过逐步累积的过程，进行多步诱变 可以获得高产菌株。（2）诱变因素的选择口在微生物诱变育种中，诱变处理主要采用物理诱变剂和化学诱变剂。目前常用的诱 变剂主要有紫外线、Y射线、硫酸二乙酯、亚硝基胍和亚硝基甲基脲等。后两种因 有突出的诱变效果，被誉为“超诱变剂”。口 诱变的方法有单一诱变剂处理和复合诱变剂处理。选择诱变剂时应考虑使用的方便 性和有效性，若经过诱变，正突变株出现率较高，所用的诱变剂则为有效诱变剂。对于野生菌株，使用单一诱变因素有可能取得较好的效果；但是，对于已经诱变过 的菌株，单一诱变因素重复使用的效果不佳，这时可利用两种以上诱变因素交替使 用，以提高诱变效果。（3）诱变剂剂量的选择口各种诱变剂有不同的剂量表示方法，例如，紫外线的强度是尔格（lerg=10-7J）, X 射线的单位是伦琴（R）或拉德（rad）等，化学诱变剂的剂量则以在一定温度下诱变剂 的浓度和处理时间来表示。但是，仅采用诱变剂的理化指标控制诱变剂的用量常会 造成偏差，不利于重复操作。口 诱变剂的剂量与致死率有关，而致死率又与诱变率有一定关系，因此，可用致死率作为各种诱变剂的相对剂量，用以选择各种诱变剂的剂量。对不同的微生物使用的 剂量不同，通常情况下，高剂量诱变剂处理后获得的负突变率较高，而在偏低的剂 量处理中获得的正突变率较高，目前诱变剂处理剂量一般选择死亡率为70%80%时 的剂量。但是，在多核细胞中，仍然采用高剂量，因为在高剂量诱变时，除个别核 发生突变外，其他核均被致死，可形成较纯的变异菌株，同时也造成遗传物质的巨 大损伤，可减少回复突变。（4）单孢子（或单细胞）悬液的制备口 诱变育种要求所处理的细胞必须是处于对数生长期同步生长的细胞，并且是均匀状 态的单细胞悬液。细胞的生理状态对诱变处理会产生很大的影响，细菌一般在对数 生长期的诱变处理效果较好，而霉菌和放线菌的分生孢子在稍加萌发时进行诱变处 理可提高诱变效率。分散状态的细胞可以均匀地接触诱变剂，避免长出不纯的菌落。口 由于在许多微生物的细胞内同时含有几个核，即使使用单细胞悬液进行诱变处理， 还是容易出现不纯的菌落。因此，获得单细胞悬液的方法必须具有针对性，对产孢 子或芽孢的微生物最好采用其孢子或芽孢。例如，诱变霉菌或放线菌时，应处理它 们的孢子；诱变芽孢杆菌时，应处理它们的芽孢。2.2.2.4 常用的物理诱变剂处理方法（1）紫外线诱变（2）Y射线诱变（3）太空育种2.2.2.5 常用的化学诱变剂处理方法（1） 亚硝酸诱变亚硝基胍（NTG）诱变2.2.3 杂交育种口 杂交育种一般指两个基因型不同的菌株通过结合或原生质体融合使遗传物质重新组 合， 从中分离和筛选出具有新性状的菌株。口 杂交育种是选用已知性状的供体菌株和受体菌株作为亲本，把不同菌株的优良性状 集中于组合体中。因此，杂交育种具有定向育种的性质。原生质体融合就是用酶法将细胞膜外的细胞壁除掉，制备成无细胞壁的球状细胞体原生 质体，将两种来源于微生物细胞A和B的原生质体，在融合诱导剂（或促进剂）例如聚乙 二醇和Ca2+等溶液中等量混合起来，使原生质体表面形成电极性，相互之间易于吸引、脱 水黏合而形成聚合物，进而使原生质体收缩变形，紧密接触处的膜先形成原生质桥，而后逐 渐增大而实现原生质体融合。原生质体融合技术有以下优点：(1)去除了细胞壁的障碍，亲株基因组直接融合，交换，实现重组，不需要有已知的遗传系统。即使是相同接合型的真菌细胞也能发生原生质体的相互融合，并可对 原生质体进行转化和转染。A (2)原生质体融合后两亲株的基因组之间有机会发生多次交换，产生各种各样的基 因组合而得到多种类型的重组子。参与融合的亲株数并不限于一个，可以多至三个、 四个，这是一般常规杂交所达不到的。A (3)重组频率特别高，因为有聚乙二醇等作助溶剂。A (4)可以和其他育种方法相结合，把由其他方法得到的优良性状通过原生质体融合 再组合到一个单株中。A (5)可以用温度、药物、紫外线等处理、钝化亲株的一方或双方，然后使之融合， 再在再生菌落中筛选重组子。这样往往可以提高筛选效率。1. 菌种保藏的原理口菌种退化：是指优良菌种的群体中出现某些生理特征和形态特征逐渐减退或丧失， 而表现为目的代谢产物合成能力下降的现象。在形态上，常有分生孢子减少或菌落 颜色的改变，如放线菌和霉菌在斜面上经过多次传代后产生了“光秃型”。在生理上， 有的是菌种的发酵力(如糖、氮的消耗能力)下降，有的是繁殖力(如孢子的产生 能力)下降，有的是发酵产品得率下降，有的是抗不良环境能力减弱，所有这些都 给发酵生产带来不利影响。口 菌种退化不是突然发生的，而是从量变到质变的逐步演变过程，个别细胞突变不会 使群体表型发生明显改变，但经过连续传代，负变细胞达到一定数量后，群体表型 就出现退化。菌种退化的原因主要有：A菌种的自发突变或回复突变，引起菌体本身的自我调节和DNA的修复，有的因 为完整的修复而恢复为低产菌株原型，有的因为错误的修复而产生新的突变菌株。A细胞质中控制产量的质粒脱落或核内DNA和质粒复制不一致，若核内DNA复制 的速率超过质粒，经过多次传代繁殖，细胞中将出现不具有对产量起决定作用的质 粒，造成菌种退化。A基因突变是引起菌种退化的根本原因，而移接代数越多，发生突变的概率越高。A不良的培养和保藏条件，容易诱发菌种基因或表型的改变，或导致质粒脱落，导 致菌种退化。A 菌种保藏的基本原理是根据微生物的生理、生化特性，人为地创造条件，使微生物 的代谢处于不活泼、生长繁殖受到抑制的休眠状态。以减少菌种的变异。保藏时， 一般利用菌种的休眠体(孢子、芽孢等)并创造有利于休眠状态的环境条件，如降 低培养基营养成分、低温、干燥、缺氧和添加保护剂等，使菌种的代谢活性处于最 低状态，已达到防治菌种退化、死亡的目的。2. 常用菌种保藏方法菌种保藏的具体方法很多，因菌种生理生化特性不同而异，一般首先考虑能够较 长期的保存原有菌种的优良特性，同时也要考虑保藏方法的经济性与简便性。常见的保藏方 法有以下几种：( 1)斜面低温保藏法（2）液体石蜡覆盖保藏法（3）载体吸附保藏法（4）真空冷冻干燥保藏法（5）液氮超低温保藏法3. 防止菌种衰退的措施（1）尽量减少传代次数口基因的变化往往发生在复制和繁殖过程中，传代次数越多，基因发生变化的几率也 就越高。因此，应尽量避免不必要的接种和传代，把传代次数控制在最低水平，以 降低突变几率。（2）选择合适的培养条件口 培养条件对菌种衰退有一定的影响，选择一个适合原种生长的条件可以防止菌种衰 退，另外，生产上应避免使用陈旧的斜面菌种。（3）利用不同类型的细胞进行传代口 在放线菌和霉菌中，由于它们的菌丝细胞常含有许多核，甚至是异核体，因此用菌 丝接种时就会出现衰退和不纯的子代。而孢子一般是单核的，利用孢子来接种，可 以达到防止衰退的目的。但是这也必须注意到微生物细胞本身的特点。对曲霉来说， 利用它的分生孢子传代易发生衰退，而用它的子囊孢子传代则不易退化。（4）选择合适的保藏方法口 不同的菌种采用不同的保藏方法，至于具体采用什么方法，要根据具体菌种和具体 情况来决定。思考题1. 工业发酵所用生产菌种有哪些类型，代谢产物有哪些？2. 初级代谢产物与次级代谢产物有何联系？3. 发酵工业对菌种的要求有哪些，菌种的来源有哪些？4. 常见的菌种选育方法有哪些？5. 自然选育的一般程序是怎样的？6. 简要说明诱变育种的一般步骤，诱变育种应注意哪些问题？7. 分别阐述紫外线诱变和亚硝基胍诱变的操作步骤。8. 菌种保藏的基本原理是什么，菌种保藏主要有哪些方法，各有什么优缺点？口 富集方法口 原理：在分离培养基中添加若干抗生素、复杂底物及生长因子的前体物质来激活细 菌某一特殊基因组，建立富集技术。如：口 土样中细菌的富集：适度稀释后，取 0.1m1 涂布已添加及未添加富集底物（纤维素等 ） 的土浸出汁平板。