geneandhumandisease

2022-10-31第八章基因与人类疾病u1、肿瘤与癌症u2、艾滋病u3、乙肝u4、非典u5、基因诊断u6、基因治疗本章主要内容本章主要内容序：序：u人类基因病症三大类：人类基因病症三大类：u1、经典单基因病、经典单基因病u2、多基因病、多基因病u3、获得性基因病、获得性基因病1、肿瘤与癌症品病癌山一种可怕的疾病细胞无休止的分裂组织增生堆积如山 1775年，伦敦医生Percival Pott发现，早年曾干过扫烟囱活计的男人易患阴囊癌 19世纪早期，人类的平均寿命只有35岁，而癌症特别喜欢光顾老年人，所以直到19世纪癌症一直是一种相对罕见的疾病。u自20世纪50年代起，吸烟人群的肺癌是非吸烟人群的20-30倍。u20世纪初，与X射线打交道的人易患皮肤癌和白血病。为夜光表涂抹镭的女工由于常常舔刷毛而易患舌癌。u癌症的地方特征：非洲某地的肝癌18倍于英国，日本的胃癌11倍于美国，美国的结肠癌10-20倍于非洲某地。当人们从世界的一地移居于另一地时，他们的下一代呈现新居地癌症的典型特征流行病学资料u癌基因（癌基因（oncogene）一般可定义为某种基因，一般可定义为某种基因，它的异常表达或表达产物的异常直接决定细胞恶它的异常表达或表达产物的异常直接决定细胞恶性表型的产生。性表型的产生。u抑癌基因或称抗癌基因（抑癌基因或称抗癌基因（anti-oncogene）与肿瘤抑制基因与肿瘤抑制基因(tumor suppressor gene)属同属同义词，是指某种基因当其受阻抑、失活、丢失、义词，是指某种基因当其受阻抑、失活、丢失、或其表达产物丧失功能可导致细胞恶性转化；反或其表达产物丧失功能可导致细胞恶性转化；反之，在实验条件下，若导入或激活它则可抑制细之，在实验条件下，若导入或激活它则可抑制细胞的恶性表型。胞的恶性表型。（1）癌基因的发现）癌基因的发现u现已知道在肿瘤发生中，作为环境因素的病现已知道在肿瘤发生中，作为环境因素的病毒、化学致癌物和射线，它们作用于机体内的靶毒、化学致癌物和射线，它们作用于机体内的靶分子都是分子都是DNA，在研究肿瘤病毒如何使宿主细胞在研究肿瘤病毒如何使宿主细胞转化和研究肿瘤转化和研究肿瘤DNA能否使培养的经两条实验途能否使培养的经两条实验途径中，殊途同归，发现了癌基因，早在本世纪初，径中，殊途同归，发现了癌基因，早在本世纪初，Rockefeller研究所的研究所的Rous医生将鸡肉瘤组织匀医生将鸡肉瘤组织匀浆后的无细胞滤液皮下注射于正常鸡，发现可以浆后的无细胞滤液皮下注射于正常鸡，发现可以引起肿瘤，可惜当时对病毒还缺乏认识，直到五引起肿瘤，可惜当时对病毒还缺乏认识，直到五十年代才重新发现原来致瘤的因素是病毒，并以十年代才重新发现原来致瘤的因素是病毒，并以Rous医生的名字命名为罗氏肉瘤病毒（医生的名字命名为罗氏肉瘤病毒（Rous Sarcoma Virus,RSV）。）。1975年，年，Bishop从从RSV中分离到第一个病毒癌基因中分离到第一个病毒癌基因src，该基因编该基因编码分子量为码分子量为60kDa的磷蛋白质，以的磷蛋白质，以pp60src表示。表示。u1976年年Stehelin以实验证明正常鸡成纤维细胞基以实验证明正常鸡成纤维细胞基因组中存在有与病毒癌基因因组中存在有与病毒癌基因src的同源序列。此的同源序列。此后陆续发现许多禽类和鼠类病毒部基因也有类似后陆续发现许多禽类和鼠类病毒部基因也有类似情况，即宿主细胞基因组中含有病毒癌基因的同情况，即宿主细胞基因组中含有病毒癌基因的同源序列，称之为细胞癌基因（源序列，称之为细胞癌基因（c-oncogene,c-onc）。）。u那么，那么，v-onc与与c-onc的关系如何？这可从二的关系如何？这可从二者结构的比较和逆转录病毒感染宿主后的生活史者结构的比较和逆转录病毒感染宿主后的生活史或复制周期两方面加以分析。或复制周期两方面加以分析。u首先，从结构上看首先，从结构上看c-onc是间断的，这是真核基是间断的，这是真核基因的特点，即有内含子因而基因的跨度较大。然因的特点，即有内含子因而基因的跨度较大。然而而v-onc却是连续的，没有内含子，所以基因跨却是连续的，没有内含子，所以基因跨度较小，以度较小，以v-onc和和c-src为例如图。再从逆转录为例如图。再从逆转录病毒感染宿主细胞后的复制周期（图）分析。病毒感染宿主细胞后的复制周期（图）分析。逆转录病毒正常复制周期主要步骤c-src和v-src结构的比较u不难看出，不难看出，v-onc原本不是病毒的基因，而是动物细胞正原本不是病毒的基因，而是动物细胞正常基因的一个复本。当病毒在宿主细胞内复制时，由于常基因的一个复本。当病毒在宿主细胞内复制时，由于DNA重组而将宿主细胞基因中带有重组而将宿主细胞基因中带有v-onc的序列重组到病的序列重组到病毒的基因组内。所以说毒的基因组内。所以说c-onc是是v-onc原型，又称为原癌原型，又称为原癌基因（基因（proto-oncogene）。）。u病毒癌基因对病毒本身无关紧要，却可使宿主细胞病毒癌基因对病毒本身无关紧要，却可使宿主细胞转化，引起肿瘤，而细胞癌基因对细胞的生长、分化和转化，引起肿瘤，而细胞癌基因对细胞的生长、分化和功能活动却是至关紧要的。正常的细胞癌基因并不致癌，功能活动却是至关紧要的。正常的细胞癌基因并不致癌，只是当它们异常表达或其表达产物异常时才会导致细胞只是当它们异常表达或其表达产物异常时才会导致细胞的恶性转化，迄今发现的细胞癌基因都是一些有十分重的恶性转化，迄今发现的细胞癌基因都是一些有十分重要的功能要的功能“看家基因看家基因”，而且是高度保守的，例如人与，而且是高度保守的，例如人与小鼠的小鼠的K-ras基因产物基因产物K-Ras的氨基酸序列相差仅为的氨基酸序列相差仅为1%，人与大鼠的人与大鼠的H-ras基因产物基因产物H-Ras的氨基酸序列完全相同。的氨基酸序列完全相同。u实验证明，实验证明，v-onc的致癌或由于表达的失控，或的致癌或由于表达的失控，或由于基因的突变，导致产物的量的增多或质的改由于基因的突变，导致产物的量的增多或质的改变。变。u已知从自然发生的人肿瘤组织提取的已知从自然发生的人肿瘤组织提取的DNA可可以转化以转化HIH/3T3细胞，尽管只有细胞，尽管只有10%的人的肿瘤的人的肿瘤DNA具有转化此种细胞的能力，但癌基因已在所具有转化此种细胞的能力，但癌基因已在所有主要类型人肿瘤中检出，最先是从有主要类型人肿瘤中检出，最先是从T24/EJ膀胱膀胱癌细胞系检查到的，属于癌细胞系检查到的，属于ras家族成员，以后又家族成员，以后又用核酸探针检测出正常人的细胞基因组中有用核酸探针检测出正常人的细胞基因组中有ras同源序列存在，与同源序列存在，与T24细胞中的细胞中的ras不同，无转化不同，无转化能力，二者差别仅仅在于一个点突变（第能力，二者差别仅仅在于一个点突变（第12位氨位氨基酸密码子的基酸密码子的G突变为突变为T）。）。（2）细胞癌基因的激活）细胞癌基因的激活u细胞癌基因的激活是指原本不致癌细胞癌基因的激活是指原本不致癌c-onc在特定的情在特定的情况下转变成致癌性的，大体上有以下几种激活方式。况下转变成致癌性的，大体上有以下几种激活方式。uA、插入激活例如逆转录病毒插入激活例如逆转录病毒MoSV感染鼠类成纤感染鼠类成纤维细胞后，病毒基因组的维细胞后，病毒基因组的LTR整合到细胞癌基因整合到细胞癌基因c-mos邻邻近处，使近处，使c-mos处于处于LTR的强启动子和增强子作用之下而的强启动子和增强子作用之下而被激活，导致成纤维细胞转化为肉瘤细胞，又如禽类白被激活，导致成纤维细胞转化为肉瘤细胞，又如禽类白细胞增生病毒细胞增生病毒ALV的的E成分整合到鸡细胞基因组成分整合到鸡细胞基因组c-myc附附近。可使近。可使c-myc激活。因此在基因治疗中使用逆转录病毒激活。因此在基因治疗中使用逆转录病毒载体时必需考虑细胞癌基因的插入激活问题。载体时必需考虑细胞癌基因的插入激活问题。uB、突变激活典型的是各种突变激活典型的是各种ras基因的激活基因的激活uras基因的表达产物基因的表达产物Ras是一种小分子是一种小分子G蛋白，在蛋白，在信号转导中起重要作用，正常信号转导中起重要作用，正常Ras的作用因其自的作用因其自身的身的GTP酶活性而受到严格控制，而突变了的酶活性而受到严格控制，而突变了的Rad其其GTP酶活性下降或丧失，失去了原有控制，酶活性下降或丧失，失去了原有控制，致使增殖信号持续作用，细胞发生恶性转化，如致使增殖信号持续作用，细胞发生恶性转化，如图图uC、基因扩增基因扩增 已发现人类肿瘤细胞中扩增的细胞癌基因如下表已发现人类肿瘤细胞中扩增的细胞癌基因如下表u表：人类肿瘤细胞中扩增的细胞癌基因（表：人类肿瘤细胞中扩增的细胞癌基因（DM：双微体；双微体；HSR：均匀染色区）均匀染色区）c-onc肿瘤肿瘤扩增倍数扩增倍数DM/HSR*c-myc早幼粒白血病细胞系早幼粒白血病细胞系HL60小细胞肺癌细胞系小细胞肺癌细胞系205-30？N-myc原发神经母细胞瘤原发神经母细胞瘤-级及神经级及神经母细胞瘤细胞系母细胞瘤细胞系视网膜母细胞瘤视网膜母细胞瘤小细胞肺癌小细胞肺癌5-100010-20050L-myc小细胞肺癌小细胞肺癌10-20？c-myb急粒急粒AML结肠癌细胞系结肠癌细胞系5-1010？c-erbB类表皮癌细胞系，原发胶质瘤类表皮癌细胞系，原发胶质瘤30？c-K-ras原发肺癌，结肠癌，膀胱癌，直肠原发肺癌，结肠癌，膀胱癌，直肠癌癌4-20？N-ras乳癌细胞系乳癌细胞系5-10？uD、基因重排基因重排/染色体易位染色体易位u典型的如伯基特淋巴瘤细胞的染色体易位典型的如伯基特淋巴瘤细胞的染色体易位t（8：14），），致使致使c-myc激活，参看图：激活，参看图：Burkitt淋巴瘤常见的染色体易位淋巴瘤常见的染色体易位t(8:14)u不同的癌基因有不同的激活方式，一种癌基不同的癌基因有不同的激活方式，一种癌基因也可有几种激活方式。例如因也可有几种激活方式。例如c-myc的激活就有的激活就有基因扩增和基因重排两种方式，很少见基因扩增和基因重排两种方式，很少见c-myc的的突变；而突变；而ras的激活方式则主要是突变，细胞转的激活方式则主要是突变，细胞转化实验证明，各种癌基因之间存在协同作用。化实验证明，各种癌基因之间存在协同作用。Weingerg按转染细胞表型的变化将癌基因分为按转染细胞表型的变化将癌基因分为两个类，一类是核内作用的能使细胞永生化的癌两个类，一类是核内作用的能使细胞永生化的癌基因，例如基因，例如myc，fos等，另一类是引起细胞恶等，另一类是引起细胞恶性表型变化的定位于质膜和胞浆的癌基因，例如性表型变化的定位于质膜和胞浆的癌基因，例如ras、erbB、src等。事实表明肿瘤的发生是多步等。事实表明肿瘤的发生是多步骤，多因素的，不同的癌基因作用于肿瘤发生的骤，多因素的，不同的癌基因作用于肿瘤发生的不同阶段。不同阶段。（3）抑癌基因）抑癌基因u抑癌基因又称肿瘤抑制基因，它的发现较癌抑癌基因又称肿瘤抑制基因，它的发现较癌基因晚，迄今克隆到的抑癌基因的数目亦较少，基因晚，迄今克隆到的抑癌基因的数目亦较少，这并不意味着客观存在的抑癌基因就一定比癌基这并不意味着客观存在的抑癌基因就一定比癌基因少，只是由于技术上的原因，要想分离、鉴定、因少，只是由于技术上的原因，要想分离、鉴定、确认一个抑癌基因比较困难。确认一个抑癌基因比较困难。u早在六十年代，有人将癌细胞与同种正常双早在六十年代，有人将癌细胞与同种正常双倍体成纤维细胞融合，所获杂种细胞的后代只要倍体成纤维细胞融合，所获杂种细胞的后代只要保留某些正常亲本染色体时就可表现为正常表型。保留某些正常亲本染色体时就可表现为正常表型。然而，随着染色体的丢失又可重新出现恶变细胞。然而，随着染色体的丢失又可重新出现恶变细胞。这一现象表明，正常染色体内可能存在某些抑制这一现象表明，正常染色体内可能存在某些抑制肿瘤发生的基因，它们的丢失、突变或失去功能，肿瘤发生的基因，它们的丢失、突变或失去功能，好可使潜在的致癌因素如激活的癌基因发挥作用好可使潜在的致癌因素如激活的癌基因发挥作用而致癌。而致癌。癌症多步起源说癌细胞正常细胞正常细胞融合推测 正常细胞可能存在抑制肿瘤形成的基因发现肿瘤抑制基因癌症多步起源说Rb活性RbRb无活性Rb失活视网膜神经胶质瘤1986，美国眼科医生Dryla发现说明 Rb基因具有抑制肿瘤发生的作用发现肿瘤抑制基因癌症多步起源说正常细胞Rb基因体外培养的视网膜神经胶质瘤细胞注入正常细胞提取培养发现肿瘤抑制基因结论 Rb具有肿瘤 抑制作用u抑癌基因概念是在研究视网膜母细胞瘤抑癌基因概念是在研究视网膜母细胞瘤（Retinoblastoms,RB）的遗传损害时提出来的遗传损害时提出来的。的。RB有家族性和散发性两种类型，其发闰机有家族性和散发性两种类型，其发闰机制不同。前者有先天的隐性遗传损害，其种系基制不同。前者有先天的隐性遗传损害，其种系基因是有缺陷的，患因是有缺陷的，患RB的频率可高达的频率可高达80-90%，且，且往往是双侧，散发性往往是双侧，散发性RB，两次体细胞突变发生两次体细胞突变发生在同一个细胞，机率很小，患病也是单侧，在同一个细胞，机率很小，患病也是单侧，Kundson早在早在1971年就提出年就提出RB发病的发病的“两次击两次击中学说中学说”。现代分子遗传学分析手段的发展充分。现代分子遗传学分析手段的发展充分支持这一学说（图）。支持这一学说（图）。1986年年Draper统计，统计，RB携带者发生第二原发癌的机率比一般人群要高数携带者发生第二原发癌的机率比一般人群要高数百倍。百倍。u关于抑癌基因如何起作用所知甚少，总体上总对生长起着控制作用，关于抑癌基因如何起作用所知甚少，总体上总对生长起着控制作用，是一类生长控制基因或负调控基因，若功能丧失则失去负调控，细是一类生长控制基因或负调控基因，若功能丧失则失去负调控，细胞只能接受正调控信号，抑癌基因产物的功能多种多样，已确定的胞只能接受正调控信号，抑癌基因产物的功能多种多样，已确定的几中抑癌基因产物及其功能如表几中抑癌基因产物及其功能如表癌症多步起源说发现肿瘤抑制基因细说Rb抑癌基因两次灭活论RbRbRbRbRbRb第一次突变灭活第二次突变灭活Rb基因的突变失活不仅导致视网膜神经胶质瘤在多种癌症中也发现了它的踪影：骨肉瘤、前列腺癌、软组织肉瘤、小细胞肺癌、乳腺癌、食道癌表：表：已确定的几种抑癌基因已确定的几种抑癌基因（*p53的野生型是抑癌基因，而其突变型属癌基因）的野生型是抑癌基因，而其突变型属癌基因）基因基因染色体定位染色体定位相关肿瘤相关肿瘤基因产物及功能基因产物及功能RB13q14RB、成骨肉瘤、胃癌、成骨肉瘤、胃癌、SCLC、乳癌、结肠癌乳癌、结肠癌p105，控制生长控制生长WT11p13WT、横纹肌肉瘤、肺癌、膀横纹肌肉瘤、肺癌、膀胱癌、乳癌、肝母细胞瘤胱癌、乳癌、肝母细胞瘤WT-ZFP，负调负调控转录因子控转录因子NF-117p12神经纤维瘤、嗜铬细胞瘤、雪神经纤维瘤、嗜铬细胞瘤、雪旺氏细胞瘤、神经纤维肉瘤旺氏细胞瘤、神经纤维肉瘤GAP，拮抗拮抗p21rasBDCC18q21.3结肠瘤结肠瘤P192,细胞粘附细胞粘附分子分子p53817p13星状细胞瘤、胶质母细胞瘤、星状细胞瘤、胶质母细胞瘤、结肠癌、乳癌、成骨肉瘤、结肠癌、乳癌、成骨肉瘤、SCLC、胃癌、磷状细胞肺癌胃癌、磷状细胞肺癌P53 控制生长控制生长erb A17q21ANLLT3受体，含锌指受体，含锌指结构的转录因子结构的转录因子发现生长因子信号处理系统生长因子受体第二信使调节蛋白DNA复制细胞分裂癌基因的产物（癌蛋白）抑癌基因的产物（抑癌蛋白）+-癌基因与抑癌基因的搏斗肿瘤转移发现肿瘤转移基因淋巴干细胞T细胞T细胞迁移迁移骨髓胸腺脾淋巴结神经嵴细胞神经管左右鳃弓软骨颅骨软骨肾上腺髓质脊神经节迁移迁移3、乙肝4、非典（冠状病毒）5、基因诊断u基因诊断的对象基因诊断的对象u1、病原生物的侵入、病原生物的侵入:直接检测病原生物的遗传物质可以大直接检测病原生物的遗传物质可以大大提高诊断的敏感性。而肝在无法得到商业化抗体时，基大提高诊断的敏感性。而肝在无法得到商业化抗体时，基因诊断就成为检测病原微生物感染，尤其是病毒感染的唯因诊断就成为检测病原微生物感染，尤其是病毒感染的唯一手段。诊断的特异性也大为提高。一手段。诊断的特异性也大为提高。u2、先天遗传性疾患：已有多种传统的遗传性疾患的发病、先天遗传性疾患：已有多种传统的遗传性疾患的发病原因被确定为特定基因的突变。用基因诊断的方法检测这原因被确定为特定基因的突变。用基因诊断的方法检测这些位点的改变，不仅对临床诊断，而且对疾病的病因和发些位点的改变，不仅对临床诊断，而且对疾病的病因和发病机理的研究都具有重要的意义病机理的研究都具有重要的意义u3、后天基因突变引起的疾病：这方面最典型的例子就是、后天基因突变引起的疾病：这方面最典型的例子就是肿瘤。肿瘤。u4、其它：如、其它：如DNA指纹、个体识别，亲子关系识别，法医指纹、个体识别，亲子关系识别，法医物证等。物证等。基因诊断的方法基因诊断的方法u从理论上说所有检测基因水平或结构的方法都应从理论上说所有检测基因水平或结构的方法都应可用于基因诊断。可用于基因诊断。u1、核酸杂交：、核酸杂交：u酸杂交是从核酸分子混合液中检测特定大小的核酸杂交是从核酸分子混合液中检测特定大小的核酸分子的传统方法。其原理是核酸变性和复性理酸分子的传统方法。其原理是核酸变性和复性理论。即双链的核酸分子在某些理化因素作用下双论。即双链的核酸分子在某些理化因素作用下双链解开，而在条件恢复后又可依碱基配对规律形链解开，而在条件恢复后又可依碱基配对规律形成双边结构。杂交通常在一支持膜上进行，因此成双边结构。杂交通常在一支持膜上进行，因此又称为核酸印迹杂交。根据检测样品的不同又被又称为核酸印迹杂交。根据检测样品的不同又被分为分为DNA印迹交和印迹交和RNA印迹杂交。其基本过程包印迹杂交。其基本过程包括下列几个步骤。括下列几个步骤。u （1）制备样品：首先需要从待检测组织样品提取）制备样品：首先需要从待检测组织样品提取DNA或或RNA。DNA应先用限制性内切酶消化以产生特定应先用限制性内切酶消化以产生特定长度的片段，然后通过凝胶电泳将消化产物按分子大小长度的片段，然后通过凝胶电泳将消化产物按分子大小进行分离。一般来说进行分离。一般来说DNA分子有其独特的限制性内切酶分子有其独特的限制性内切酶图谱，所以经酶切消化和电泳分离后可在凝胶上形成特图谱，所以经酶切消化和电泳分离后可在凝胶上形成特定的区带。再将含有定的区带。再将含有DNA片段的凝胶进行变性处理后，片段的凝胶进行变性处理后，直接转印到支持膜上并使其牢固结合。这样等检测片段直接转印到支持膜上并使其牢固结合。这样等检测片段在凝胶上的位置就直接反映在了转印在膜上。在凝胶上的位置就直接反映在了转印在膜上。RNA样品样品则可直接在变性条件下电泳分离，然后转印并交联固定。则可直接在变性条件下电泳分离，然后转印并交联固定。u（2）制备探针：探针是指一段能和待检测核酸分子）制备探针：探针是指一段能和待检测核酸分子依碱基配对原则而结合的核酸片段。它可以是一段依碱基配对原则而结合的核酸片段。它可以是一段DNA、RNA或合成的寡核苷酸。在核酸杂交实验中，探针需要或合成的寡核苷酸。在核酸杂交实验中，探针需要被标记上可直接检测的元素或分子。这样，通过检疫与被标记上可直接检测的元素或分子。这样，通过检疫与恩印膜上的核酸分子结合上的探针分子，既可知道被检恩印膜上的核酸分子结合上的探针分子，既可知道被检测的核酸片段在膜上的位置，也就是在电泳凝胶上的位测的核酸片段在膜上的位置，也就是在电泳凝胶上的位置，也就知道了它的分子大小。置，也就知道了它的分子大小。u （3）杂交：首先要进行预杂交，即用非特）杂交：首先要进行预杂交，即用非特异的核酸溶液封闭膜上的非特异性结合位点。由异的核酸溶液封闭膜上的非特异性结合位点。由于转印在膜上的核酸分子已经是变性的分子，所于转印在膜上的核酸分子已经是变性的分子，所以杂交过程中只需变性标记好的探针，再让探针以杂交过程中只需变性标记好的探针，再让探针与膜在特定的温度下反应，然后洗去未结合的探与膜在特定的温度下反应，然后洗去未结合的探针分子即可。针分子即可。u（4）检测：检测的方法依标记探针的方法）检测：检测的方法依标记探针的方法而异。用放射性同位素标记的探针需要用放射自而异。用放射性同位素标记的探针需要用放射自显影来检测其在膜上的位置；而如果是用生物素显影来检测其在膜上的位置；而如果是用生物素等非同位素方法标记的探针则需要用相应的免疫等非同位素方法标记的探针则需要用相应的免疫组织化学的方法进行检测。组织化学的方法进行检测。2、聚合酶链反应、聚合酶链反应u用聚合酶链反应来扩增靶分子以特异性地增加靶分子量，用聚合酶链反应来扩增靶分子以特异性地增加靶分子量，达到提高敏感性的目的。达到提高敏感性的目的。u聚合酶链反应（聚合酶链反应（PCR）的反应本身是在同一试管内的反应本身是在同一试管内利用利用DNA聚合酶催化的反应反复进行同一段聚合酶催化的反应反复进行同一段DNA片段的片段的合成（图合成（图23-1）。聚合酶反应的模板是待检测核酸分子：）。聚合酶反应的模板是待检测核酸分子：DNA可直接用于反应，而可直接用于反应，而RNA则需要用反转录酶反转录则需要用反转录酶反转录成为成为cDNA，然后用作聚合酶反应的模板。反应的引物有然后用作聚合酶反应的模板。反应的引物有两条，分别位于待扩增两条，分别位于待扩增DNA片段的两端，可启动相对方片段的两端，可启动相对方向的向的DNA合成。这样从一个模板分子起始的话，经过合成。这样从一个模板分子起始的话，经过n次次聚合酶反应后就可以合成聚合酶反应后就可以合成2n个模板分子。假如进行了个模板分子。假如进行了30轮反应，则可从一个待检分子合成出轮反应，则可从一个待检分子合成出230，即约，即约109个待个待检分子。对于一段检分子。对于一段500碱基对的碱基对的DNA片段来说，这大约等片段来说，这大约等于于1ng的的DNA。所以从很小时的样品即有可能扩增出电泳所以从很小时的样品即有可能扩增出电泳后肉眼可见的产物。后肉眼可见的产物。u最初的聚合酶链反应是用最初的聚合酶链反应是用DNA聚合酶聚合酶I的的Klenow片段或片段或T4DNA聚合酶催化的。但是由于每轮反应聚合酶催化的。但是由于每轮反应都需要三个温度点，尤其是模板变性需在较高的都需要三个温度点，尤其是模板变性需在较高的温度下进行，所以最初的温度下进行，所以最初的PCR需要在每轮反应中需要在每轮反应中加入加入DNA聚合酶。这个问题在发现了耐热聚合酶。这个问题在发现了耐热DNA聚聚合酶（合酶（Taq DNA聚合酶）后才得以完满的解决。聚合酶）后才得以完满的解决。Taq DNA聚合酶分离自水栖高温菌，其最适反应聚合酶分离自水栖高温菌，其最适反应温度为温度为75-80摄氏度，且经摄氏度，且经90摄氏度以上的加温摄氏度以上的加温后仍可在温度恢复后复性。所以这种酶特别适合后仍可在温度恢复后复性。所以这种酶特别适合于在不同温度点进行循环加温与降温而不丧失酶于在不同温度点进行循环加温与降温而不丧失酶的活性。因此被广泛应用于各种的活性。因此被广泛应用于各种PCR。以爱滋病的临床检测为例，简要说明一下以爱滋病的临床检测为例，简要说明一下PCR在病毒感染的基在病毒感染的基因诊断中的应用。因诊断中的应用。u组织中总组织中总RNA的提取的提取 u利用反转录酶合成利用反转录酶合成cDNA uPCR反应：反应：u反应液组织：反应缓冲液反应液组织：反应缓冲液 模板（上述合成的模板（上述合成的cDNA）底物（底物（dATP,dGTP,dCTP,dTTP）引物（爱滋病病毒特异性引物）引物（爱滋病病毒特异性引物）TaqDNA聚合酶聚合酶50lu循环：循环：95，30sec（变性）变性）55，1min（退火）退火）30循环循环 72，1min（聚合）聚合）u检测：电泳或核酸杂交检测：电泳或核酸杂交6、基因治疗、基因治疗u序：许多疾病如遗传性疾病、肿瘤等与人体的基因异常序：许多疾病如遗传性疾病、肿瘤等与人体的基因异常有密切的因果关系。早在有密切的因果关系。早在DNA重组技术之前就有人提出重组技术之前就有人提出将正常基因顺序导入病人体内进行基因水平治疗的设想。将正常基因顺序导入病人体内进行基因水平治疗的设想。Edward Tatum 和和Joshua Lederberg 在在60年低曾提出年低曾提出可利用病毒作为基因转移的载体。但直到可利用病毒作为基因转移的载体。但直到1990年才成功年才成功地实现了用基因治疗手段尝试治疗腺苷酸脱氨酶缺乏症地实现了用基因治疗手段尝试治疗腺苷酸脱氨酶缺乏症（adenosine deaminase deficiency）。）。到目前为止，到目前为止，已报道的基因治疗方案已超过百种。有已报道的基因治疗方案已超过百种。有300多病人接受了多病人接受了这种新的治疗方式。基因治疗的对象不再局限于遗传病，这种新的治疗方式。基因治疗的对象不再局限于遗传病，而被扩展到肿瘤和传染病等多种疾病。其发展相当迅速，而被扩展到肿瘤和传染病等多种疾病。其发展相当迅速，前景十分看好，我国学者也在用基因治疗方式治疗血友前景十分看好，我国学者也在用基因治疗方式治疗血友病方面做了一定工作。目前已积累了一定的经验和教训，病方面做了一定工作。目前已积累了一定的经验和教训，有了一些可遵循的操作程序及可供选择的治疗方式。但有了一些可遵循的操作程序及可供选择的治疗方式。但这种新的治疗方式仍有许多环节需要不断改进和提高。这种新的治疗方式仍有许多环节需要不断改进和提高。（一）基因治疗的概念和策略（一）基因治疗的概念和策略u基因治疗基因治疗(gene therapy)就是用正常或野生型就是用正常或野生型(wild type)基因较正或置换致病基因的一种治疗方法。在这种治疗基因较正或置换致病基因的一种治疗方法。在这种治疗方法中，目的基因被导入到靶细胞（方法中，目的基因被导入到靶细胞（target cells）内，内，他们或与宿主细胞（他们或与宿主细胞（host cell）染色体整合成为宿主遗染色体整合成为宿主遗传物质的一部分，或不与染色体整合而位于染色体外，传物质的一部分，或不与染色体整合而位于染色体外，但都能在细胞中得到表达，起到治疗疾病的作用。但都能在细胞中得到表达，起到治疗疾病的作用。u目前基因治疗的概念了较大的扩展，凡是采用分子目前基因治疗的概念了较大的扩展，凡是采用分子生物学的方法和原理，在核酸水平上开展的疾病治疗方生物学的方法和原理，在核酸水平上开展的疾病治疗方法都可称为基因治疗。随着对疾病本质的深入了解和新法都可称为基因治疗。随着对疾病本质的深入了解和新的分子生物学方法的不断涌现，基因治疗方法有了较大的分子生物学方法的不断涌现，基因治疗方法有了较大的发展。根据所采用的方法不同，基因治疗的策略大致的发展。根据所采用的方法不同，基因治疗的策略大致可分为以下几种：可分为以下几种：u基因置换（基因置换（gene replacement）：）：基因置换就是用基因置换就是用正常的基因原位替换病变细胞内的致病基因，使细胞内正常的基因原位替换病变细胞内的致病基因，使细胞内的的DNA完全恢复正常状态。这种治疗方法最为理想，但完全恢复正常状态。这种治疗方法最为理想，但目前由于技术原因尚难达到。目前由于技术原因尚难达到。u基因修复（基因修复（gene correction）：）：基因修复是指将致基因修复是指将致病基因的突变碱基序列纠正，而正常部分予以保留。这病基因的突变碱基序列纠正，而正常部分予以保留。这种基因治疗方式最后也能使致病基因得到完全恢复，操种基因治疗方式最后也能使致病基因得到完全恢复，操作上要求高，实践中有一定难度。作上要求高，实践中有一定难度。u基因修饰（基因修饰（gene augmentation）又称基因增补，又称基因增补，将目的基因导入病变细胞或其它细胞，目的基因的表达将目的基因导入病变细胞或其它细胞，目的基因的表达产物能修饰缺陷细胞的功能或使原有的某些功能得以加产物能修饰缺陷细胞的功能或使原有的某些功能得以加强。在这种治疗方法中，缺陷基因仍然存在于细胞内，强。在这种治疗方法中，缺陷基因仍然存在于细胞内，目前基因治疗多采用这种方式。如将组织型纤溶酶原激目前基因治疗多采用这种方式。如将组织型纤溶酶原激活剂的基因导入血管内皮细胞并得以表达后，防止经皮活剂的基因导入血管内皮细胞并得以表达后，防止经皮冠状动脉成形术诱发的血检形成。冠状动脉成形术诱发的血检形成。u基因失活（基因失活（gene inactivation）：）：利用反义技术能特利用反义技术能特异地封闭基因表达特性，抑制一些有害基因的表达，已异地封闭基因表达特性，抑制一些有害基因的表达，已达到治疗疾病的目的。如利用反义达到治疗疾病的目的。如利用反义RNA、核酶或肽核酸核酶或肽核酸等抑制一些癌基因的表达，抑制肿瘤细胞的增殖，诱导等抑制一些癌基因的表达，抑制肿瘤细胞的增殖，诱导肿瘤细胞的分化。用此技术还可封闭肿瘤细胞的耐药基肿瘤细胞的分化。用此技术还可封闭肿瘤细胞的耐药基因的表达，增加化疗效果。因的表达，增加化疗效果。u免疫调节（免疫调节（immune adjustment）：）：将抗体、抗原将抗体、抗原或细胞因子的基因导入疾人体内，改变病人免疫状态，或细胞因子的基因导入疾人体内，改变病人免疫状态，达到预防和治疗疾病的目的。如将白细胞介素达到预防和治疗疾病的目的。如将白细胞介素-2导入肿瘤导入肿瘤病人体内，提高病人病人体内，提高病人IL-2的水平，激活体内免疫系统的抗的水平，激活体内免疫系统的抗肿瘤活性，达到防治肿瘤复发的目的。肿瘤活性，达到防治肿瘤复发的目的。u其它：增加肿瘤细胞对放疗或化疗的敏感性：采用其它：增加肿瘤细胞对放疗或化疗的敏感性：采用给予前体药物的方法减少化疗药物对正常细胞的损用力。给予前体药物的方法减少化疗药物对正常细胞的损用力。如向肿瘤细胞中导入单纯疱疹病毒胸苷激酶基因，然后如向肿瘤细胞中导入单纯疱疹病毒胸苷激酶基因，然后给予病人无毒性给予病人无毒性GCV药物，由于只有含药物，由于只有含HSV-TK基因的细基因的细胞才能将胞才能将CGV转化成有毒的药物。因而肿瘤细胞被杀死，转化成有毒的药物。因而肿瘤细胞被杀死，而对正常细胞无影响。而对正常细胞无影响。一些常见疾病的治疗策略：一些常见疾病的治疗策略：u-隐性遗传病隐性遗传病-用正常基因置换致病基因而达到完全校正用正常基因置换致病基因而达到完全校正u-导入正常基因序列以达到暂时性校正导入正常基因序列以达到暂时性校正u-显性遗传病显性遗传病-用正常基因置换致病基因而达到完全校正用正常基因置换致病基因而达到完全校正u-使有害基因失活而达到暂时性校正使有害基因失活而达到暂时性校正 -在某些情况下可导入正常基因加以校正在某些情况下可导入正常基因加以校正u-肿瘤肿瘤 -杀伤肿瘤细胞（如利用自杀基因，激活免疫系统及杀伤肿瘤细胞（如利用自杀基因，激活免疫系统及 u 保护正常细胞免受化疗药物的损伤等）保护正常细胞免受化疗药物的损伤等）-使癌基因使癌基因u 失活（反义技术、核酶）或增加抑癌基因的表达失活（反义技术、核酶）或增加抑癌基因的表达u-传染病传染病 -杀伤传染源（免疫法、自杀基因）杀伤传染源（免疫法、自杀基因）u -使传染源失活（反义技术、核酶、核酸陷井）使传染源失活（反义技术、核酶、核酸陷井）u其它疾病其它疾病 -导入药物基因（药物释放）如激素、细胞因子导入药物基因（药物释放）如激素、细胞因子 u -失活有害基因产物（反义技术、核酶、核酸陷井）失活有害基因产物（反义技术、核酶、核酸陷井）u -杀伤策略如减少特异细胞群杀伤策略如减少特异细胞群(二二)基因治疗的基本程序基因治疗的基本程序u（1）目的基因的选择和制备：）目的基因的选择和制备：u可用于基因治疗的基因需满足以下几点：在可用于基因治疗的基因需满足以下几点：在体内仅有少量的表达就可显著改善症状；该基因体内仅有少量的表达就可显著改善症状；该基因的过高表达不会对机体造成危害。的过高表达不会对机体造成危害。u在确定欲选目的基因后，就要制备目的基因。在确定欲选目的基因后，就要制备目的基因。正向表达的基因可以是正向表达的基因可以是cDNA，也可是基因组也可是基因组DNA片段。可用传统的方法获取，也可采用多聚片段。可用传统的方法获取，也可采用多聚酶链式反应酶链式反应(PCR)等新技术进行体外扩增。部分等新技术进行体外扩增。部分反义基因也可采用此法获得，但多数情况下采用反义基因也可采用此法获得，但多数情况下采用人工合成的方式制备人工合成的方式制备u（2）基因的转运）基因的转运u目前已有多种基因转运的方式，其基本原则是将外目前已有多种基因转运的方式，其基本原则是将外源基因运到细胞内。已使用的有病毒载体和非病毒载体源基因运到细胞内。已使用的有病毒载体和非病毒载体两大类。两大类。u病毒载体：病毒具有一些独特的性质如多数病毒可病毒载体：病毒具有一些独特的性质如多数病毒可感染特异的细胞，在细胞内不易降解；感染特异的细胞，在细胞内不易降解；RNA病毒能整合病毒能整合到染色体以及基因水平较高等。因此病毒载体是良好的到染色体以及基因水平较高等。因此病毒载体是良好的基因转运载体。目前已被用作载体的病毒有逆转录病毒、基因转运载体。目前已被用作载体的病毒有逆转录病毒、腺病毒、腺相关的病毒。疱疹病毒和肝炎病毒等。逆转腺病毒、腺相关的病毒。疱疹病毒和肝炎病毒等。逆转录病毒用作载体时需进行几步改造：录病毒用作载体时需进行几步改造：uA：将天然的野生型将天然的野生型RNA前病毒转变成前病毒转变成DNA载体，载体，并插入欲转移的相关外源基因。其基本原则是用标记基并插入欲转移的相关外源基因。其基本原则是用标记基因和外源基因替代病毒的编码基因，如图所示。因和外源基因替代病毒的编码基因，如图所示。uB：制备辅助细胞为载体制备辅助细胞为载体DNA提供其丧失的功能，提供其丧失的功能，如图所示。如图所示。uC：将载体将载体DNA导入辅助以产生病毒载体。如图导入辅助以产生病毒载体。如图uD：病毒载体感染靶细胞，外源基因在细胞内得病毒载体感染靶细胞，外源基因在细胞内得以表达，如图。以表达，如图。非病毒载体：这类载体的发展较快，目前主要是脂质体，一些具有受体功能的载体也呈现出诱人的前景u（3）靶细胞的选择）靶细胞的选择u理论上讲，无论何种细胞均具有接受外源理论上讲，无论何种细胞均具有接受外源DNA的能力，目前基因治疗中禁止使用生殖细胞的能力，目前基因治疗中禁止使用生殖细胞作为靶细胞，而只能使用体细胞，用于转基因的作为靶细胞，而只能使用体细胞，用于转基因的体细胞必须取材方便，含量丰富，容易培养，寿体细胞必须取材方便，含量丰富，容易培养，寿命较长。可选择的细胞有淋巴细胞、造血细胞、命较长。可选择的细胞有淋巴细胞、造血细胞、上皮细胞、角质细胞、内皮细胞、成纤维细胞、上皮细胞、角质细胞、内皮细胞、成纤维细胞、肝细胞、肌肉细胞和肿瘤细胞等。在实际上应用肝细胞、肌肉细胞和肿瘤细胞等。在实际上应用中应具体根据目的条件选择。中应具体根据目的条件选择。u（4）细胞转染（）细胞转染（tansfection）u将目的基因导入靶细胞的方法很多，大致可将目的基因导入靶细胞的方法很多，大致可分为物理学方法、化学方法、融合法和病毒感染分为物理学方法、化学方法、融合法和病毒感染法四类。病毒法已在本节的法四类。病毒法已在本节的“基因的转运基因的转运”中有中有基因介绍。目前较多使用的是脂质体法。基因介绍。目前较多使用的是脂质体法。u（5）外源基因的表达及检测）外源基因的表达及检测u在筛选出转化分子后还需要鉴定转导细胞中在筛选出转化分子后还需要鉴定转导细胞中外源基因的表达状况。其中包括对目的基因和标外源基因的表达状况。其中包括对目的基因和标记基因表达的鉴定。常用方法有原位杂交，记基因表达的鉴定。常用方法有原位杂交，Northrn杂交，杂交，NRA打点杂交，免疫组织化学染打点杂交，免疫组织化学染色等，前几项是检测外源基因转录出的色等，前几项是检测外源基因转录出的mRNA，后者则是检测外源基因翻译出的蛋白质。流式细后者则是检测外源基因翻译出的蛋白质。流式细胞仪是一种较为客观准确的仪器，可定量分析外胞仪是一种较为客观准确的仪器，可定量分析外源基因的表达状况。源基因的表达状况。