基因表达及功能分析基本策略课件

目目 录录第二十六章第二十六章 基因表达及功能分析的基因表达及功能分析的基本策略基本策略STRATEGIES FOR ANALYZING GENE EXPRESSION AND FUNCTION目目 录录第一节第一节 基因表达的分析策略基因表达的分析策略Strategies for Analyzing Gene Expression目目 录录一、通过检测一、通过检测mRNA揭示基因转录水平的表达特征揭示基因转录水平的表达特征根据分析方法的原理和功能特性，可将基因表达分析分为根据分析方法的原理和功能特性，可将基因表达分析分为:封闭性系统研究方法封闭性系统研究方法:例如例如DNA微阵列、微阵列、Northern印迹、实印迹、实时时RT-PCR等方法，其应用范围仅限于已测序的物种，只能等方法，其应用范围仅限于已测序的物种，只能研究已知的基因。研究已知的基因。开放性系统研究方法开放性系统研究方法:如差异显示如差异显示PCR、双向基因表达指纹、双向基因表达指纹图谱、分子索引法、随机引物图谱、分子索引法、随机引物PCR指纹分析等，可以发现指纹分析等，可以发现和分析未知的基因。和分析未知的基因。这里主要针对已知基因的常用表达分析方法做一介绍。这里主要针对已知基因的常用表达分析方法做一介绍。目目 录录（一）基于杂交原理的方法可检测（一）基于杂交原理的方法可检测mRNAmRNA表达水平表达水平1Northern印迹印迹（Northern blot）既可分析既可分析mRNA表达又可验证表达又可验证cDNA新序列新序列 是一种基于是一种基于RNA-DNA杂交原理建立的一种杂交原理建立的一种RNA分析分析技术技术目目 录录Northern印迹分析原理示意图印迹分析原理示意图目目 录录2核糖核酸酶保护实验核糖核酸酶保护实验（ribonuclease protection assay，RPA）可用于可用于mRNA定量和定量和RNA剪接分析剪接分析 是一种基于杂交原理分析是一种基于杂交原理分析mRNA的方法，既可对的方法，既可对mRNA进行定量分析又可研究其结构特征，灵敏进行定量分析又可研究其结构特征，灵敏度和特异性都很高。度和特异性都很高。目目 录录核糖核酸酶保护实验原理示意图核糖核酸酶保护实验原理示意图目目 录录可对可对mRNA进行区域定位进行区域定位 是利用杂交原理建立的组织原位是利用杂交原理建立的组织原位mRNA检测技术，可检测技术，可对细胞或组织中原位表达的对细胞或组织中原位表达的mRNA进行区域定位。同进行区域定位。同时也可作为定量分析的补充。时也可作为定量分析的补充。通过设计与目标通过设计与目标mRNA碱基序列互补的寡核苷酸序列，碱基序列互补的寡核苷酸序列，标记后作为探针；该探针能够特异性地与目标靶序列标记后作为探针；该探针能够特异性地与目标靶序列杂交，检测标记信号来确定基因在组织和细胞内表达杂交，检测标记信号来确定基因在组织和细胞内表达的区位信息。的区位信息。虽然原位杂交在功能性方面提供的信息较少，但是该虽然原位杂交在功能性方面提供的信息较少，但是该技术还是被广泛用于组织中的基因表达分析，这是因技术还是被广泛用于组织中的基因表达分析，这是因为其较高的稳定性、较广泛的靶点和组织适用性。为其较高的稳定性、较广泛的靶点和组织适用性。3原位杂交（原位杂交（in situ hybridization，ISH）目目 录录（二）两种变换的聚合酶链式反应是常用的（二）两种变换的聚合酶链式反应是常用的mRNA检测方法检测方法1反转录反转录PCR 可用于可用于mRNA的半定量分析的半定量分析 反转录反转录PCR（reverse transcription-PCR，RT-PCR）是一种简单、快捷地对是一种简单、快捷地对RNA进行定性、定量分析的方进行定性、定量分析的方法。它是以法。它是以mRNA为模板，体外扩增为模板，体外扩增cDNA，再以，再以cDNA为模板进行特定基因转录产物的为模板进行特定基因转录产物的PCR扩增。扩增。RT-PCR技术一般用于技术一般用于RNA的定性分析；如果设置阳性参的定性分析；如果设置阳性参照，则可对待测照，则可对待测RNA样品进行半定量分析。样品进行半定量分析。该方法适合对待测样品进行初步筛选，目前已广泛被该方法适合对待测样品进行初步筛选，目前已广泛被实时定量实时定量PCR替代。替代。目目 录录常用于常用于mRNA的定量分析的定量分析 实时定量实时定量PCR(Real-time Quantitative Polymerase chain Reaction,RQ-PCR)是定量分析是定量分析mRNA的最通用、最快速、的最通用、最快速、最简便的方法，该方法是对最简便的方法，该方法是对PCR反应进行实时监测，具反应进行实时监测，具有很高的灵敏度和特异性。有很高的灵敏度和特异性。2实时定量实时定量PCR目目 录录目前有目前有5种技术用于实时定量种技术用于实时定量PCR：其中最经济、简便的技术是利用荧光染料（如其中最经济、简便的技术是利用荧光染料（如SYBR Green）与双链）与双链DNA分子结合发光的特性，指示扩增产分子结合发光的特性，指示扩增产物的增加；物的增加；其他其他4种方法都是以荧光染料标记的寡核苷酸为探针种方法都是以荧光染料标记的寡核苷酸为探针与正确的扩增子杂交，包括与正确的扩增子杂交，包括5核酸酶法（即人们熟知的核酸酶法（即人们熟知的TaqManTM）、分子信标、）、分子信标、ScropionsTM和探针杂交法，和探针杂交法，它们拥有更强的特异性，可以避免对它们拥有更强的特异性，可以避免对PCR后溶解曲线的后溶解曲线的需求，以及后续的需求，以及后续的Southern杂交或对扩增子的测序鉴定，杂交或对扩增子的测序鉴定，但是成本较高。但是成本较高。目目 录录SYBR Green实时定量实时定量PCR分析原理示意图分析原理示意图 目目 录录二、通过蛋白质检测揭示基因二、通过蛋白质检测揭示基因 翻译水平的表达特征翻译水平的表达特征 Western印迹（印迹（Western blot）是一种免疫印迹技术，是一种免疫印迹技术，其基本原理与核酸分子杂交相似，只是以偶联标记物的抗其基本原理与核酸分子杂交相似，只是以偶联标记物的抗体分子作为探针，检测转移到固相支持物上的蛋白质体分子作为探针，检测转移到固相支持物上的蛋白质/多肽多肽分子。当在蛋白质水平上检测特定基因的表达活性时，最分子。当在蛋白质水平上检测特定基因的表达活性时，最常用的方法就是利用常用的方法就是利用Western印迹对细胞或组织的总蛋白质印迹对细胞或组织的总蛋白质中的特异蛋白质进行定性和半定量分析。中的特异蛋白质进行定性和半定量分析。（一）采用特异抗体经（一）采用特异抗体经Western印迹可直接印迹可直接 测定基因编码多肽测定基因编码多肽目目 录录 蛋白质样品的制备蛋白质样品的制备 SDS-PAGE分离分离 蛋白质转膜蛋白质转膜 特异抗体（即第一抗体）与膜上的蛋白质（抗原）印特异抗体（即第一抗体）与膜上的蛋白质（抗原）印迹杂交迹杂交 再经偶联了可检测标记信号的第二抗体（即抗抗体，再经偶联了可检测标记信号的第二抗体（即抗抗体，商品试剂盒中多采用偶联辣根过氧化物酶的商品试剂盒中多采用偶联辣根过氧化物酶的Ig）最后经与酶的底物反应而显影、成像，经扫描后获取最后经与酶的底物反应而显影、成像，经扫描后获取免疫印迹信息免疫印迹信息Western blot基本程序基本程序目目 录录 酶联免疫吸附分析（酶联免疫吸附分析（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）也是一种建立在抗原也是一种建立在抗原-抗体反应基础上的蛋白抗体反应基础上的蛋白质分析基本方法。质分析基本方法。该方法不需经电泳分离待检样品蛋白质，而是预先将样该方法不需经电泳分离待检样品蛋白质，而是预先将样品包被在支持体上，以后反应过程与品包被在支持体上，以后反应过程与Western印迹大致相同印迹大致相同顺序结合（即顺序结合（即“吸附吸附”）特异抗体（一抗）及与酶连接的）特异抗体（一抗）及与酶连接的第二抗体（也可预先包被抗体，第二抗体（也可预先包被抗体，“吸附吸附”抗原），再进行酶抗原），再进行酶-底物反应。反应后通过专门的酶标仪测定、记录数据。底物反应。反应后通过专门的酶标仪测定、记录数据。（二）酶联免疫吸附分析与（二）酶联免疫吸附分析与Western印迹原理印迹原理相似但形式不同相似但形式不同目目 录录特点：特点：具有特异性；具有特异性；灵敏度很高；灵敏度很高；稳定、操作简便，标本用量少，适于大规模筛查，稳定、操作简便，标本用量少，适于大规模筛查，尤其适用于检测体液中微量的特异性抗体或抗原；尤其适用于检测体液中微量的特异性抗体或抗原；既可以做定性试验也可以做定量分析。既可以做定性试验也可以做定量分析。被广泛应用于微生物学、寄生虫学、肿瘤学和被广泛应用于微生物学、寄生虫学、肿瘤学和免疫学等领域。免疫学等领域。酶联免疫吸附分析酶联免疫吸附分析目目 录录 免疫组织化学（免疫组织化学（immunohistochemistry）与与免疫免疫细胞化学（细胞化学（immunocytochemistry）原理相同，都是利）原理相同，都是利用标记的特异性抗体通过抗原用标记的特异性抗体通过抗原-抗体反应和显色反应，抗体反应和显色反应，在组织或细胞原位检测特定抗原（即目标蛋白质）的在组织或细胞原位检测特定抗原（即目标蛋白质）的方法，简称为免疫组化实验。近年来由于荧光标记抗方法，简称为免疫组化实验。近年来由于荧光标记抗体的广泛应用，这两种方法又被统称为体的广泛应用，这两种方法又被统称为免疫荧光法。免疫荧光法。（三）免疫组化实验可对组织（三）免疫组化实验可对组织/细胞细胞 表达的蛋白质进行原位检测表达的蛋白质进行原位检测目目 录录（immunofluorescence），可应用荧光（倒置）显微镜或），可应用荧光（倒置）显微镜或激光共聚焦显微镜（激光共聚焦显微镜（confocal microscopy）对靶分子进行对靶分子进行定性、定量和定位分析，激光共聚焦显微镜还可进行断层定性、定量和定位分析，激光共聚焦显微镜还可进行断层成像，是在蛋白质水平分析基因表达的直观方法。成像，是在蛋白质水平分析基因表达的直观方法。其中抗体对于蛋白质靶点的特异性、种间交叉反应、检测其中抗体对于蛋白质靶点的特异性、种间交叉反应、检测系统的灵敏性以及细胞或组织的固定类型是该方法的关键系统的灵敏性以及细胞或组织的固定类型是该方法的关键因素。因素。运用双重着色或多重着色程序同时对多个感兴趣的靶分子运用双重着色或多重着色程序同时对多个感兴趣的靶分子进行检测，是一种揭示更多有关细胞群的功能和它们之间进行检测，是一种揭示更多有关细胞群的功能和它们之间相互作用信息的有效方法。相互作用信息的有效方法。免疫组化主要是作为定性、定位的技术，若结合密度计量免疫组化主要是作为定性、定位的技术，若结合密度计量系统、图像分析系统等测量工具也可以得到定量的数据。系统、图像分析系统等测量工具也可以得到定量的数据。目目 录录 流式细胞术（流式细胞术（flow cytometry）在细胞水平分析特定在细胞水平分析特定蛋白质的基本原理也是抗原蛋白质的基本原理也是抗原-抗体反应，它利用荧光标记抗体反应，它利用荧光标记抗体与抗原的特异性结合，经过流式细胞仪分析荧光信号，抗体与抗原的特异性结合，经过流式细胞仪分析荧光信号，从而根据细胞表达特定蛋白质的水平对某种蛋白质阳性细从而根据细胞表达特定蛋白质的水平对某种蛋白质阳性细胞（即特异基因表达的细胞）作出判断。胞（即特异基因表达的细胞）作出判断。（四）流式细胞术用于分析（四）流式细胞术用于分析 表达特异蛋白质的阳性细胞表达特异蛋白质的阳性细胞目目 录录流式细胞术可以检测活细胞，也可以检测用甲醛固定的流式细胞术可以检测活细胞，也可以检测用甲醛固定的细胞。细胞。广泛应用于细胞表面和细胞内分子表达水平的定量分析，广泛应用于细胞表面和细胞内分子表达水平的定量分析，并能够根据各种蛋白质的表达模式区分细胞亚群。并能够根据各种蛋白质的表达模式区分细胞亚群。此外，流式细胞术可以使用多个荧光标记的抗体同时对此外，流式细胞术可以使用多个荧光标记的抗体同时对多个基因产物进行标记和监测，是对细胞进行快速分析、多个基因产物进行标记和监测，是对细胞进行快速分析、分选、特征鉴定的一种有效方法。分选、特征鉴定的一种有效方法。目目 录录三、高通量检测技术成为基因表达三、高通量检测技术成为基因表达研究的有力工具研究的有力工具 高通量筛选高通量筛选(High throughput screening，HTS)技术技术是在大量核酸、多肽信息累计（即资料库）基础上，采是在大量核酸、多肽信息累计（即资料库）基础上，采用微板作为分子载体，制作集成用微板作为分子载体，制作集成“芯片芯片”，以自动化操，以自动化操作系统进行分子杂交的试验过程。作系统进行分子杂交的试验过程。因为快捷、灵敏、信息量大，适合大规模操作，故因为快捷、灵敏、信息量大，适合大规模操作，故称称“高通量高通量”。高通量检测技术适合高通量检测技术适合“组学组学”（omics）研究，更）研究，更适合生命活动过程相关的基因表达谱分析。适合生命活动过程相关的基因表达谱分析。目目 录录基因芯片已成为基因表达谱分析的常用方法基因芯片已成为基因表达谱分析的常用方法 基因芯片（基因芯片（gene chip）又称）又称DNA微阵列微阵列(DNA microarray)、DNA芯片（芯片（DNA chip）,是将大量已知序列的核酸片段（包是将大量已知序列的核酸片段（包括寡核苷酸、括寡核苷酸、cDNA、基因组、基因组DNA、microRNA等等)集成在集成在同一基片上，组成密集分子排列，通过与标记样品进行杂同一基片上，组成密集分子排列，通过与标记样品进行杂交，检测、获取细胞或组织的基因信息。交，检测、获取细胞或组织的基因信息。其中其中基因表达谱（基因表达谱（expression prifile）分析）分析是目前基因芯片是目前基因芯片应用最多的一个方面，主要采用应用最多的一个方面，主要采用cDNA芯片，基因表达谱芯芯片，基因表达谱芯片便于对不同状态（如生理和病理条件）下的基因表达谱片便于对不同状态（如生理和病理条件）下的基因表达谱进行比较，揭示进行比较，揭示转录组（转录组（transcriptome）差异表达的规律，差异表达的规律，对探索发病机制、评价治疗效果、筛选药物靶标具有重要对探索发病机制、评价治疗效果、筛选药物靶标具有重要意义。意义。（一）基因芯片和高通量测序技术可在基因（一）基因芯片和高通量测序技术可在基因水平高通量地分析基因表达水平高通量地分析基因表达目目 录录2.2.高通量测序技术是新一代基因表达谱高通量测序技术是新一代基因表达谱分析方法分析方法 高通量测序技术可以一次对几十万到几百万个高通量测序技术可以一次对几十万到几百万个DNA分子片段进行序列测定，从而快速获得转录组或分子片段进行序列测定，从而快速获得转录组或基因组的全貌基因组的全貌,又被称为又被称为深度测序深度测序(deep sequencing)。目目 录录 在在DNA水平上，可以大规模地分析基因组甲基化、筛选突变基水平上，可以大规模地分析基因组甲基化、筛选突变基因、检测基因多态性；因、检测基因多态性；在在RNA水平上，可以对水平上，可以对RNA片段进行扫描、定量与鉴定，对全片段进行扫描、定量与鉴定，对全基因组进行广谱表达研究。基因组进行广谱表达研究。1）目前，高通量测序技术不仅仅在）目前，高通量测序技术不仅仅在DNA测序中起到重测序中起到重要的作用，并且已经应用于基因组分析的各个方面：要的作用，并且已经应用于基因组分析的各个方面：2）高通量测序另一个被广泛应用的领域是小分子）高通量测序另一个被广泛应用的领域是小分子RNA或非编码或非编码RNA(ncRNA)研究。测序方法能轻易地解决芯研究。测序方法能轻易地解决芯片技术在检测小分子时遇到的技术难题片技术在检测小分子时遇到的技术难题(短序列短序列,高度同高度同源源),而且小分子而且小分子RNA的短序列正好配合了高通量测序的的短序列正好配合了高通量测序的长度长度,同时测序方法还能在实验中发现新的小分子同时测序方法还能在实验中发现新的小分子RNA。目目 录录基因芯片的缺点基因芯片的缺点:在于它是一个在于它是一个“封闭系统封闭系统”,它只能检测人们已知它只能检测人们已知序列的特征序列的特征(或有限的变异或有限的变异)。高通量测序的优势高通量测序的优势:在于它是一个在于它是一个“开放系统开放系统”,它的发现能力和寻找它的发现能力和寻找新信息的能力从本质上高于芯片技术。新信息的能力从本质上高于芯片技术。目目 录录（二）蛋白质芯片和双向电泳可在蛋白质水平（二）蛋白质芯片和双向电泳可在蛋白质水平高通量地分析基因表达高通量地分析基因表达 蛋白质芯片（蛋白质芯片（protein chip）是一种对蛋白质的表达和是一种对蛋白质的表达和功能进行高通量分析的技术。功能进行高通量分析的技术。是将具有高度亲和特异性的探针分子（如单克隆抗体）是将具有高度亲和特异性的探针分子（如单克隆抗体）固定在基片上，用以识别复杂生物样品溶液中的目标多肽；固定在基片上，用以识别复杂生物样品溶液中的目标多肽；蛋白质功能芯片可用来研究蛋白质修饰、蛋白质蛋白质功能芯片可用来研究蛋白质修饰、蛋白质-蛋白质蛋白质/DNA-蛋白质蛋白质/RNA-蛋白质，以及蛋白质与脂质、蛋白质蛋白质，以及蛋白质与脂质、蛋白质与药物、酶与底物、小分子与药物、酶与底物、小分子-蛋白质等的相互作用。蛋白质等的相互作用。1 1蛋白质芯片有多种形式和用途蛋白质芯片有多种形式和用途目目 录录蛋白质检测芯片包括蛋白质检测芯片包括:抗体芯片抗体芯片 抗原芯片抗原芯片 配体芯片配体芯片 碳水化合物芯片等碳水化合物芯片等根据蛋白质芯片制作方法和用途不同，可将其分为根据蛋白质芯片制作方法和用途不同，可将其分为1.1.蛋白质检测芯片蛋白质检测芯片2.2.蛋白质功能芯片两大类蛋白质功能芯片两大类目目 录录 目前比较和鉴定蛋白质表达谱更多采用双向聚丙烯酰目前比较和鉴定蛋白质表达谱更多采用双向聚丙烯酰胺凝胶电泳结合质谱技术。双向聚丙烯酰胺凝胶电泳技术胺凝胶电泳结合质谱技术。双向聚丙烯酰胺凝胶电泳技术又称又称二维电泳（二维电泳（two-dimensional electrophoresis,简称简称2-D电泳）。电泳）。原理原理:根据蛋白质分子的两个属性根据蛋白质分子的两个属性等电点和分子等电点和分子质量质量将蛋白质混合物进行分离。电泳结果经染色后，将蛋白质混合物进行分离。电泳结果经染色后，即可对不同样品中蛋白质的表达谱进行比较；还可从凝胶即可对不同样品中蛋白质的表达谱进行比较；还可从凝胶中将特定的蛋白质点切下，经胰蛋白酶消化后得到短肽片中将特定的蛋白质点切下，经胰蛋白酶消化后得到短肽片段，利用段，利用质谱（质谱（mass spectrum）技术进行定性分析，对差）技术进行定性分析，对差异表达的蛋白质进行鉴定。异表达的蛋白质进行鉴定。可同时分离数成百上千的蛋白质。可同时分离数成百上千的蛋白质。2 2双向电泳结合质谱普遍用于蛋白质表达双向电泳结合质谱普遍用于蛋白质表达谱的分析和鉴定谱的分析和鉴定目目 录录第二节第二节 生物信息学在预测基因生物信息学在预测基因功能中的应用功能中的应用 Bioinformatics Application in Predicting Gene Function目目 录录一、利用生物信息学方法进行基因功能一、利用生物信息学方法进行基因功能注释注释(一）通过序列比对预测基因功能一）通过序列比对预测基因功能 序列比对是生物信息学最基本的分析技术之一，最常序列比对是生物信息学最基本的分析技术之一，最常用的方法是将目的用的方法是将目的DNA或蛋白质序列与已知的或蛋白质序列与已知的DNA和蛋白和蛋白质序列数据库进行比对，搜索到与目的序列高度同源的功质序列数据库进行比对，搜索到与目的序列高度同源的功能已知的基因或蛋白质，用这些基因和蛋白质预测目的基能已知的基因或蛋白质，用这些基因和蛋白质预测目的基因和蛋白质的功能。局部比对搜索工具因和蛋白质的功能。局部比对搜索工具BLAST是进行序列是进行序列比对的基本工具，它允许用户选择一条查询序列与一个数比对的基本工具，它允许用户选择一条查询序列与一个数据库进行比对，找到数据库中与输入的查询序列相匹配的据库进行比对，找到数据库中与输入的查询序列相匹配的项。项。BLAST是一个序列数据库搜索程序家族，其中包括许是一个序列数据库搜索程序家族，其中包括许多有特定用途的程序。多有特定用途的程序。目目 录录程序程序查询序列查询序列类型类型数据库类型数据库类型注注BLASTNDNADNABLASTP蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质BLASTXDNA蛋白质蛋白质将待搜索的核酸序列按将待搜索的核酸序列按6个阅读框翻译成蛋白个阅读框翻译成蛋白质序列，然后与数据库中的蛋白质序列比对质序列，然后与数据库中的蛋白质序列比对TBLASTN蛋白质蛋白质DNA将数据库中的核酸序列按将数据库中的核酸序列按6个阅读框翻译成蛋个阅读框翻译成蛋白质序列，然后与待搜索的蛋白质序列比对白质序列，然后与待搜索的蛋白质序列比对TBLASTXDNADNA无论是待搜索的核酸序列还是数据库中的核无论是待搜索的核酸序列还是数据库中的核酸序列都按酸序列都按6个阅读框翻译成蛋白质序列，然个阅读框翻译成蛋白质序列，然后比对后比对BLAST序列数据库搜索程序家族序列数据库搜索程序家族目目 录录（二）利用生物信息学方法分析基因芯片数据（二）利用生物信息学方法分析基因芯片数据最常用的方法有：最常用的方法有：差异表达分析（又称基因表达差异分析）差异表达分析（又称基因表达差异分析）聚类分析聚类分析差异表达分析的目的：差异表达分析的目的：识别两个条件下表达差异显著的基因，即一个基因识别两个条件下表达差异显著的基因，即一个基因在两个条件中的表达水平，在排除各种偏差后，其差异在两个条件中的表达水平，在排除各种偏差后，其差异具有统计学意义具有统计学意义目目 录录 倍数分析：倍数分析：计算每个基因在两个条件下的表达比值；计算每个基因在两个条件下的表达比值；统计分析中的统计分析中的t t检验和方差分析：检验和方差分析：通过计算表达差异的通过计算表达差异的置信度来分析差异是否具有统计学意义；置信度来分析差异是否具有统计学意义；1.1.建模的方法：建模的方法：通过确定两个条件下的模型参数是否相通过确定两个条件下的模型参数是否相同来判断表达差异的显著性。同来判断表达差异的显著性。差异表达分析常用的分析方法有差异表达分析常用的分析方法有3类：类：目目 录录聚类分析所依据的基本假设：聚类分析所依据的基本假设：若组内基因具有相似的表达模式，则它们可能具有若组内基因具有相似的表达模式，则它们可能具有相似的功能，例如受共同的转录因子调控的基因，或者相似的功能，例如受共同的转录因子调控的基因，或者产物构成同一个蛋白复合体的基因，或者参与相同调控产物构成同一个蛋白复合体的基因，或者参与相同调控路径的基因。路径的基因。在具体应用中可按照相似的表达谱对基因进行聚类，在具体应用中可按照相似的表达谱对基因进行聚类，从而预测组内未知基因的功能。从而预测组内未知基因的功能。目前已经有很多种聚类的方法应用到基因芯片的研目前已经有很多种聚类的方法应用到基因芯片的研究当中，如层次聚类究当中，如层次聚类(Hierarchical clustering)、K 均值聚均值聚类类(K-means clustering)、自组织映射、自组织映射(self organizing map)、PCA(principlecomponet analysis)等。等。目目 录录 在氨基酸序列整体同源性不明显的情况下，对在氨基酸序列整体同源性不明显的情况下，对蛋白质的功能域进行分析将对预测基因功能提供极蛋白质的功能域进行分析将对预测基因功能提供极其有价值的信息。目前已通过多序列比对将蛋白质其有价值的信息。目前已通过多序列比对将蛋白质的同源序列收集在一起，确定了大量蕴藏于蛋白质的同源序列收集在一起，确定了大量蕴藏于蛋白质结构中的保守区域或序列，如结构域（结构中的保守区域或序列，如结构域（domain）和）和模体（模体（motif），这些共享结构域和保守模体通常与），这些共享结构域和保守模体通常与特定的生物学活性相关，反映了蛋白质分子的一些特定的生物学活性相关，反映了蛋白质分子的一些重要功能。重要功能。（三）通过生物信息学方法分析蛋白质（三）通过生物信息学方法分析蛋白质结构来预测蛋白质功能结构来预测蛋白质功能目目 录录运用蛋白质序列模体搜索工具预测蛋白质功能的方法是：运用蛋白质序列模体搜索工具预测蛋白质功能的方法是：首先收集现有的蛋白质家族，构造模体数据库；首先收集现有的蛋白质家族，构造模体数据库；而后通过搜索该数据库确定查询序列是否具有可能的序而后通过搜索该数据库确定查询序列是否具有可能的序 列模体，判断该序列是否属于一个已知的蛋白质家族；列模体，判断该序列是否属于一个已知的蛋白质家族；然后根据该蛋白质家族的已知功能预测未知蛋白质的功然后根据该蛋白质家族的已知功能预测未知蛋白质的功能。能。常用的模体数据库有常用的模体数据库有INTERPROSCAN、PROSITE、SMART等。等。目目 录录基因组功能注释常用数据库基因组功能注释常用数据库数据库数据库网址网址描述描述AAThttp:/genome.cs.mtu.edu/aat基因组分析和注释工具基因组分析和注释工具COGhttp:/www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/直系同源体簇分析数据库直系同源体簇分析数据库EcoCychttp:/ 录录 现在人们已经越来越清楚地认识到，生物功能大多现在人们已经越来越清楚地认识到，生物功能大多不是只由一个或几个基因控制的，而是通过生物体内众不是只由一个或几个基因控制的，而是通过生物体内众多的分子（如多的分子（如DNADNA、RNARNA、蛋白质和其他小分子物质）、蛋白质和其他小分子物质）共同构成的复杂生物网络实现的。当前生物学面临的巨共同构成的复杂生物网络实现的。当前生物学面临的巨大挑战之一就是，了解生物体内复杂的相互作用网络以大挑战之一就是，了解生物体内复杂的相互作用网络以及它们的动态特征。要想全面系统地解析这些复杂的生及它们的动态特征。要想全面系统地解析这些复杂的生物网络需要大量相关数据的积累，现代基因芯片、蛋白物网络需要大量相关数据的积累，现代基因芯片、蛋白质芯片等大规模数据采集技术大大加快了这一进程。目质芯片等大规模数据采集技术大大加快了这一进程。目前人们已经利用生物技术和信息技术建立了各种生物网前人们已经利用生物技术和信息技术建立了各种生物网络数据库和网站，可为研究者提供基因调控、信号转导、络数据库和网站，可为研究者提供基因调控、信号转导、代谢途径、蛋白质相互作用等方面的信息。代谢途径、蛋白质相互作用等方面的信息。二、利用生物网络全面系统地了解二、利用生物网络全面系统地了解基因的功能基因的功能 目目 录录 生物体任何细胞的遗传信息、基因都是相同的，生物体任何细胞的遗传信息、基因都是相同的，但同一个基因在不同组织、不同细胞中的表达却不相但同一个基因在不同组织、不同细胞中的表达却不相同。一个基因的表达既影响其他的基因，又受其他基同。一个基因的表达既影响其他的基因，又受其他基因的影响，基因之间相互促进、相互抑制，构成一个因的影响，基因之间相互促进、相互抑制，构成一个复杂的基因调控网络。复杂的基因调控网络。基因调控网络研究就是：利用生物芯片等高通量基因调控网络研究就是：利用生物芯片等高通量技术所产生的大量基因表达谱数据，以及蛋白质技术所产生的大量基因表达谱数据，以及蛋白质-DNADNA间的相互作用等信息，结合实验室研究结果，用间的相互作用等信息，结合实验室研究结果，用生物信息学方法构建基因调控模型，对某一物种或组生物信息学方法构建基因调控模型，对某一物种或组织的基因表达关系进行整体性研究，从而推断基因之织的基因表达关系进行整体性研究，从而推断基因之间的调控关系，揭示支配基因表达和功能的基本规律。间的调控关系，揭示支配基因表达和功能的基本规律。（一）利用生物网络研究基因调控（一）利用生物网络研究基因调控目目 录录常用基因转录调控数据库常用基因转录调控数据库数据库数据库网址网址描述描述EPD真核生物启动子数据库真核生物启动子数据库http:/www.epd.idb-sib.ch包含已被实验证明的转录起始位点包含已被实验证明的转录起始位点和组织特异性等启动子的一般信息和组织特异性等启动子的一般信息TFD转录因子数据库转录因子数据库http:/www.ifti.org/是转录因子及其特性的专门数据库，是转录因子及其特性的专门数据库，收集有关多肽相互作用信息收集有关多肽相互作用信息TRANSFAC数据库数据库http:/www.gene- 录录 信号转导是生物系统的重要生命活动过程，机体信号转导是生物系统的重要生命活动过程，机体通过信号转导通路中分子之间的相互识别、联络和相通过信号转导通路中分子之间的相互识别、联络和相互作用互作用,实现整体功能上的协调统一。由于细胞内各种实现整体功能上的协调统一。由于细胞内各种信号通路之间存在着紧密的联系和交叉调控信号通路之间存在着紧密的联系和交叉调控,形成了非形成了非常复杂的信号转导网络。信号转导网络研究的目的是常复杂的信号转导网络。信号转导网络研究的目的是期望通过建立细胞信号传导过程的模型，找出参与此期望通过建立细胞信号传导过程的模型，找出参与此过程的各个蛋白质间的相互作用关系，阐明其在基因过程的各个蛋白质间的相互作用关系，阐明其在基因调控、疾病发生中的作用。调控、疾病发生中的作用。生物信息学方法利用已知数据和生物学知识进行生物信息学方法利用已知数据和生物学知识进行通路推断通路推断,可以帮助阐释信号分子作用机制可以帮助阐释信号分子作用机制,辅助实验辅助实验设计设计,节省大量的人力物力。有关信号转导通路的网上节省大量的人力物力。有关信号转导通路的网上数据库资源较多数据库资源较多 。（二）利用生物网络研究信号转导（二）利用生物网络研究信号转导目目 录录常用信号通路数据库常用信号通路数据库数据库数据库网址网址描述描述Biocartahttp:/信号通路图片及注释数据库信号通路图片及注释数据库Reactomehttp:/www.reactome.org 生物核心通路及反应的挖掘知识库生物核心通路及反应的挖掘知识库 PIDhttp:/pid.nci.nih.gov 从其他数据库导入及文献挖掘的人从其他数据库导入及文献挖掘的人信号通路数据库信号通路数据库 STKEhttp:/stke.sciencemag.org 参与信号转导的分子及其相互作用参与信号转导的分子及其相互作用关系的信息关系的信息 AfCShttp:/www.signaling-gateway.org 参与信号通路的蛋白质相互作用和参与信号通路的蛋白质相互作用和信号通路图信号通路图 DOQCShttp:/doqcs.ncbs.res.in 细胞信号通路的量化数据库细胞信号通路的量化数据库,提供提供反应参数及注释信息反应参数及注释信息 SigPathhttp:/sigpath.org 提供细胞信号通路的量化信息提供细胞信号通路的量化信息 目目 录录 代谢网络处于生物体的功能执行阶段，其结构组代谢网络处于生物体的功能执行阶段，其结构组成方式反映了生物体的功能构成。代谢网络把细胞内成方式反映了生物体的功能构成。代谢网络把细胞内所有生化反应表示为网络形式，反映了代谢活动中所所有生化反应表示为网络形式，反映了代谢活动中所有化合物及酶之间的相互作用。有化合物及酶之间的相互作用。通过基因组注释信息可以识别出编码催化生物体通过基因组注释信息可以识别出编码催化生物体内生化反应的酶的基因内生化反应的酶的基因,结合相关的酶反应数据库就可结合相关的酶反应数据库就可以预测物种特异的酶基因、酶以及酶催化反应，由此以预测物种特异的酶基因、酶以及酶催化反应，由此产生了许多优秀的代谢数据库产生了许多优秀的代谢数据库,可以方便地检索某一生可以方便地检索某一生物代谢网络中的代谢反应。物代谢网络中的代谢反应。（三）利用生物网络研究代谢途径（三）利用生物网络研究代谢途径目目 录录常用代谢网络数据库常用代谢网络数据库数据库数据库网址网址描述描述KEGGhttp:/www.genome.ad.jp/kegg/包括了包括了700个以上物种的代谢、信号个以上物种的代谢、信号转导、基因调控、细胞过程的通路转导、基因调控、细胞过程的通路BioCychttp:/www.biocyc.org/包括了包括了260个物种的代谢通路及基因个物种的代谢通路及基因组数据组数据PUMA2http:/compbio.mcs.anl.gov/puma2/存放了预先计算的超过存放了预先计算的超过200个物种的个物种的代谢通路信息代谢通路信息BioSilicohttp:/biosilico.kaist.ac.kr:8017/biochemdb/index.jsp整合信息的数据库，提供对多个代谢整合信息的数据库，提供对多个代谢数据库的访问数据库的访问目目 录录（四）利用生物网络研究蛋白质相互作用（四）利用生物网络研究蛋白质相互作用 从某种程度上可以说，细胞进行的生命活动，是从某种程度上可以说，细胞进行的生命活动，是蛋白质在一定条件下相互作用的结果，若蛋白质相互蛋白质在一定条件下相互作用的结果，若蛋白质相互作用网络被破坏或稳定性丢失，会引起细胞的功能性作用网络被破坏或稳定性丢失，会引起细胞的功能性障碍。阐明蛋白质相互作用的完整网络结构，有助于障碍。阐明蛋白质相互作用的完整网络结构，有助于从系统的角度加深对细胞结构和功能的认识。从系统的角度加深对细胞结构和功能的认识。近年来各种预测蛋白质相互作用的计算方法被不近年来各种预测蛋白质相互作用的计算方法被不断提出，将这些方法与实验方法结合，挖掘出了蛋白断提出，将这些方法与实验方法结合，挖掘出了蛋白质相互作用网络中更多的相互作用节点，目前已有多质相互作用网络中更多的相互作用节点，目前已有多个蛋白质相互作用的数据库应运而生，可用来研究蛋个蛋白质相互作用的数据库应运而生，可用来研究蛋白质相互作用的生物学过程白质相互作用的生物学过程 。目目 录录常用蛋白质互作网络数据库常用蛋白质互作网络数据库数据库数据库网址网址描述描述BINDhttp:/www.bind.ca 提供参与通路的分子的序列和相互作用信息提供参与通路的分子的序列和相互作用信息 DIPhttp:/dip.doe-mbi.ucla.edu专门存放实验确定的蛋白质之间相互作用的专门存放实验确定的蛋白质之间相互作用的数据数据,既包括经典实验手段也包括高通量实验既包括经典实验手段也包括高通量实验手段确定的蛋白质相互作用数据手段确定的蛋白质相互作用数据STRINGhttp:/string.embl.de存储实验确定的和预测得到的蛋白质相互作存储实验确定的和预测得到的蛋白质相互作用数据，并对各种预测方法得到的结果的准用数据，并对各种预测方法得到的结果的准确性给出了相应的权重确性给出了相应的权重MIPShttp:/mips.gsf.de包括酵母和哺乳动物的包括酵母和哺乳动物的PPI,可靠性很高可靠性很高,被作被作为准金标准使用为准金标准使用Yeast Interactomehttp:/structure.bu.edu/rakesh/myindex.html综合多种来源的由酵母双杂交技术确定的酵综合多种来源的由酵母双杂交技术确定的酵母母PPI数据集数据集,利用基因表达信息、蛋白亚细利用基因表达信息、蛋白亚细胞定位信息以及已知的各种知识对其进行验胞定位信息以及已知的各种知识对其进行验证形成高可信度的相互作用数据证形成高可信度的相互作用数据目目 录录三、复杂疾病的生物信息学研究策略三、复杂疾病的生物信息学研究策略 包括信息提取、分析和建模包括信息提取、分析和建模 癌症、糖尿病、高血压等复杂疾病对人类健康影响癌症、糖尿病、高血压等复杂疾病对人类健康影响巨大，这类疾病的发病机制一般与多种遗传或非遗传因巨大，这类疾病的发病机制一般与多种遗传或非遗传因素，以及它们之间的相互作用有关，不能通过单基因、素，以及它们之间的相互作用有关，不能通过单基因、单通路、单层次的变化解释。单通路、单层次的变化解释。以系统的观点解释复杂疾病中遗传与环境的关系、以系统的观点解释复杂疾病中遗传与环境的关系、描述复杂疾病中基因的特征、分析疾病基因型与表现型描述复杂疾病中基因的特征、分析疾病基因型与表现型之间的关系，已成为生物信息学研究复杂疾病的基本观之间的关系，已成为生物信息学研究复杂疾病的基本观点，针对复杂疾病的研究模式，也开始从传统的点，针对复杂疾病的研究模式，也开始从传统的“序列序列结构结构功能功能”向向“相互作用相互作用网络网络功能功能”转变。转变。目目 录录疾病的基因组合及相互作用信息的提取：即对复杂疾病相关疾病的基因组合及相互作用信息的提取：即对复杂疾病相关靶基因的识别，以及利用靶基因的识别，以及利用SNPsSNPs、基因、蛋白质等不同类型、基因、蛋白质等不同类型的信息，构建疾病驱使相关基因网络。的信息，构建疾病驱使相关基因网络。生物信息分析及多层次信息的融合：即从不同层次对疾病的生物信息分析及多层次信息的融合：即从不同层次对疾病的遗传复杂性进行分析，对不同遗传网络间的映射算法进行研遗传复杂性进行分析，对不同遗传网络间的映射算法进行研究，进而将究，进而将SNPsSNPs、基因、蛋白质等不同水平的信息进行融、基因、蛋白质等不同水平的信息进行融合。合。分子调控网络建模：即综合生理病理相关的基因、分子调控网络建模：即综合生理病理相关的基因、SNPsSNPs、基因表达状况，蛋白质功能状态以及临床治疗等信息，以系基因表达状况，蛋白质功能状态以及临床治疗等信息，以系统的方法将不同的测量数据、各种因素的辨识、各个层次上统的方法将不同的测量数据、各种因素的辨识、各个层次上的相互作用关系进行整合，建立数学模型，深入了解疾病过的相互作用关系进行整合，建立数学模型，深入了解疾病过程、揭示复杂疾病的发病机制。程、揭示复杂疾病的发病机制。复杂疾病的基本研究策略复杂疾病的基本研究策略目目 录录第三节第三节 基因的生物学功能鉴定技术基因的生物学功能鉴定技术Methods for Identifying Biological Functions of Genes目目 录录目前在已知的目前在已知的2.52.5万万3 3万个人类基因中，大约万个人类基因中，大约70%70%的基因我们还的基因我们还不清楚它们的功能，有不清楚它们的功能，有90%90%的基因我们不知道它们在体内的确切的基因我们不知道它们在体内的确切生理作用，因此，利用各种技术手段研究基因组中功能未知基生理作用，因此，利用各种技术手段研究基因组中功能未知基因的作用，将是因的作用，将是“后基因组时代后基因组时代”功能基因组学研究的主要内功能基因组学研究的主要内容。容。生物信息学利用已知数据和生物学知识进行合理推断生物信息学利用已知数据和生物学知识进行合理推断,可以节省可以节省大量的人力物力，但基因功能的鉴定最终仍需要通过实验来验大量的人力物力，但基因功能的鉴定最终仍需要通过实验来验证。证。通常采用基因功能获得和通常采用基因功能获得和/或基因功能缺失的策略，观察基因在或基因功能缺失的策略，观察基因在细胞或生物个体中的，细胞生物学行为或个体表型遗传性状的细胞或生物个体中的，细胞生物学行为或个体表型遗传性状的变化，来鉴定基因的功能。此外，基于正向遗传学的随机突变变化，来鉴定基因的功能。此外，基于正向遗传学的随机突变筛选技术也成为揭示基因功能的重要手段。由于基因的功能必筛选技术也成为揭示基因功能的重要手段。由于基因的功能必须在完整的生物个体及其生命过程中才能得到完整的体现，因须在完整的生物个体及其生命过程中才能得到完整的体现，因此从整体水平研究基因的功能是必然的选择。此从整体水平研究基因的功能是必然的选择。目目 录录基因功能获得策略即通过将目的基因直接导入某一基因功能获得策略即通过将目的基因直接导入某一细胞或个体中，使其获得新的或更高水平的表达，通过细胞或个体中，使其获得新的或更高水平的表达，通过细胞或个体生物性状的变化来研究基因的功能。常用的细胞或个体生物性状的变化来研究基因的功能。常用的方法有转基因和基因敲入技术等。方法有转基因和基因敲入技术等。一、采用功能获得策略鉴定基因的功能一、采用功能获得策略鉴定基因的功能目目 录录 转基因技术（转基因技术（transgenic technology）是指将外源基是指将外源基因导入受精卵或胚胎干细胞中，通过随机重组使外源基因导入受精卵或胚胎干细胞中，通过随机重组使外源基因插入细胞染色体因插入细胞染色体DNA，再将受精卵或胚胎干细胞植入，再将受精卵或胚胎干细胞植入受体动物的子宫，使得外源基因能够随细胞分裂遗传给受体动物的子宫，使得外源基因能够随细胞分裂遗传给后代。后代。（一）用转基因技术获得基因功能（一）用转基因技术获得基因功能目目 录录 转基因动物（转基因动物（transgenic animal）是指应用转基因是指应用转基因技术培育出的携带外源基因，并能稳定遗传的动物。技术培育出的携带外源基因，并能稳定遗传的动物。其基本制作过程包括：转基因表达载体的构建，外其基本制作过程包括：转基因表达载体的构建，外源基因的导入，转基因动物的获得和鉴定，转基因动物源基因的导入，转基因动物的获得和鉴定，转基因动物品系的建立以及外源基因表达的鉴定。品系的建立以及外源基因表达的鉴定。1.1.转基因动物可在整体水平研究基因的功能转基因动物可在整体水平研究基因的功能目目 录录转基因动物制作原理示意图转基因动物制作原理示意图目目 录录优点：优点：利用转基因动物模型研究外源基因，能够接近真实地利用转基因动物模型研究外源基因，能够接近真实地再现基因表达所导致的结果，及其在整体水平的调控再现基因表达所导致的结果，及其在整体水平的调控规律，把复杂的系统简单化，具有系统性和独立性，规律，把复杂的系统简单化，具有系统性和独立性，是目前层次最高的实验体系。是目前层次最高的实验体系。1.利用转基因技术建立的疾病动物模型具有遗传背景清利用转基因技术建立的疾病动物模型具有遗传背景清楚、遗传物质改变简单、更自然更接近疾病的真实症楚、遗传物质改变简单、更自然更接近疾病的真实症状等优点。状等优点。目目 录录但转基因动物模型仍存在一些亟待解决的问题：但转基因动物模型仍存在一些亟待解决的问题：外源基因插入宿主基因组是随机的，可能产生插入突变，外源基因插入宿主基因组是随机的，可能产生插入突变，破坏宿主基因组功能；破坏宿主基因组功能；外源基因在宿主染色体上整合的拷贝数不等；外源基因在宿主染色体上整合的拷贝数不等；整合的外源基因遗传丢失而导致转基因动物症状的不稳整合的外源基因遗传丢失而导致转基因动物症状的不稳定遗传等。定遗传等。虽然转基因技术本身仍存在一些问题，但其在医学研虽然转基因技术本身仍存在一些问题，但其在医学研究中的重要地位是毋庸置疑的，随着转基因技术的不断完究中的重要地位是毋庸置疑的，随着转基因技术的不断完善，其在医学及生物学领域必将有更加广泛的应用。善，其在医学及生物学领域必将有更加广泛的应用。目目 录录目前，科学家已经采取了多种方法使转基因技术更加完善：目前，科学家已经采取了多种方法使转基因技术更加完善：为了更为精确地调控转基因的表达，使其获得时空特异为了更为精确地调控转基因的表达，使其获得时空特异性的调控，在构建转基因表达载体时，性的调控，在构建转基因表达载体时，选择只在特定的细胞选择只在特定的细胞类型或特定的生命时期才启动基因表达的启动子类型或特定的生命时期才启动基因表达的启动子，即可使外，即可使外源基因获得时空特异性的表达。源基因获得时空特异性的表达。可调控的基因表达系统也是一种常用的方法：可调控的基因表达系统也是一种常用的方法：例如四环素调控系统，该表达系统可使转基因动物体内例如四环素调控系统，该表达系统可使转基因动物体内外源基因的表达受诱导剂（四环素）的调控，通过加入或去外源基因的表达受诱导剂（四环素）的调控，通过加入或去除诱导剂，就可以实现对外源基因表达时间及水平的控制。除诱导剂，就可以实现对外源基因表达时间及水平的控制。2.2.转基因技术在不断完善转基因技术在不断完善目目 录录当前转基因动物所涉及的转基因片段长度大多在几十个当前转基因动物所涉及的转基因片段长度大多在几十个kbkb以下，但是，随着科学研究需要进行以下，但是，随着科学研究需要进行大片段大片段DNADNA、多、多基因或基因簇的转基因基因或基因簇的转基因。克隆大片段克隆大片段DNADNA常应用酵母人工染色体常应用酵母人工染色体(YAC)(YAC)、细菌人、细菌人工染色体工染色体(BAC)(BAC)等，可获得等，可获得200kb200kb以上的大以上的大DNADNA片段，能片段，能携带包含完整的基因或多个基因，以及基因的所有外显携带包含完整的基因或多个基因，以及基因的所有外显子，和附近的染色体调控区，为目的基因提供与其在正子，和附近的染色体调控区，为目的基因提供与其在正常染色体上一致的环境，保证了转基因在正常细胞中的常染色体上一致的环境，保证了转基因在正常细胞中的时空表达。时空表达。目目 录录（二）基因敲入可以实现基因的定向插入（二）基因敲入可以实现基因的定向插入 基因敲入基因敲入(gene knock-in)是通过同源重组的方法，是通过同源重组的方法，用某一基因替换另一基因用某一基因替换另一基因,或将一个设计好的基因片段插或将一个设计好的基因片段插入到基因组的特定位点，使之表达并发挥作用。通过基入到基因组的特定位点，使之表达并发挥作用。通过基因敲入，可以研究特定基因在体内的功能；也可以与之因敲入，可以研究特定基因在体内的功能；也可以与之前基因的功能进行比较；或将正常基因引入基因组中置前基因的功能进行比较；或将正常基因引入基因组中置换突变基因以达到靶向基因治疗的目的。换突变基因以达到靶向基因治疗的目的。目目 录录基因敲入是基因打靶技术的一种，基因打靶技术是基因敲入是基因打靶技术的一种，基因打靶技术是2020世纪世纪8080年代后半期发展起来的，一种按预期方式年代后半期发展起来的，一种按预期方式准确改造生物遗传信息的实验手段。准确改造生物遗传信息的实验手段。该技术的巧妙之处在于把胚胎干细胞技术和该技术的巧妙之处在于把胚胎干细胞技术和DNADNA同同源重组技术源重组技术“结合结合”起来，实现对染色体上某一基起来，实现对染色体上某一基因的定向修饰和改造，从而深入地了解基因的功能。因的定向修饰和改造，从而深入地了解基因的功能。除基因敲入外，基因打靶还包括基因敲除、点突变、除基因敲入外，基因打靶还包括基因敲除、点突变、缺失突变、染色体组大片段删除等。缺失突变、染色体组大片段删除等。目目 录录基因打靶的原理和基本步骤基因打靶的原理和基本步骤 首先首先,从小鼠囊胚分离出未分化的胚胎干细胞从小鼠囊胚分离出未分化的胚胎干细胞,然后利用然后利用细胞内的染色体细胞内的染色体DNADNA可以与导入细胞的外源可以与导入细胞的外源DNADNA，在，在相同序列的区域内发生同源重组的原理，用含有正相同序列的区域内发生同源重组的原理，用含有正-负负筛选标记的打靶载体，对胚胎干细胞中的特定基因实施筛选标记的打靶载体，对胚胎干细胞中的特定基因实施“打靶打靶”；之后将之后将“中靶中靶”的胚胎干细胞移植回小鼠囊胚的胚胎干细胞移植回小鼠囊胚(受精卵受精卵分裂至分裂至8 8个细胞左右即为囊胚个细胞左右即为囊胚,此时受精卵只分裂不分此时受精卵只分裂不分化化),),移植进去的中靶胚胎干细胞钻入囊胚胚层移植进去的中靶胚胎干细胞钻入囊胚胚层,与囊胚