免疫细胞检测技术

免疫细胞是泛指所有参与免疫应答或与免疫应答有关的细胞及其前身，包 括造血干细胞、淋巴细胞、单核巨噬细胞及其他抗原提呈细胞、粒细胞、红细胞、 肥大细胞等。各种免疫细胞的分离、纯化及其功能测定对于了解其在免疫应答中 的作用及相互关系有着重要意义。免疫细胞的检测即是用体外试验对机体各种参 与免疫应答或与免疫应答有关的细胞进行分离、纯化鉴定、计数和功能测定，藉 以了解机体的免疫状态，并对某些临床疾病的诊断、疗效观察及预后判断等也有 一定意义。本综述将就免疫细胞的分离、免疫细胞功能的检测和细胞凋亡的检测 三个方面主要方法的基本原理作简要介绍。一免疫细胞的分离免疫细胞包括多种细胞成分，例如淋巴细胞、单核细胞、粒细胞、红细胞等。 它们具有不同的形态和功能特性，这不仅是我们认识各种免疫细胞的依据，也是 分离各种免疫细胞的基础。细胞的形态特征反映在其物理性质上，如各种细胞的 大小、比重、表面电荷和粘附能力等存在差异;而细胞的功能特征往往由该细胞 膜表面的蛋白质（表面标记）来体现，例如各种免疫细胞执行特定功能必须表达的 受体等。根据不同形态和功能特征，可以将各种免疫细胞从混合细胞群体中分离 出来。免疫细胞分离原理基本上可以归纳为基于细胞物理性状的分离方法和基于 细胞表面标记的分离方法。基于细胞物理性状的分离方法（一）根据各种细胞比重的差异1. 自然沉降法2. 密度梯度离心法人外周血单个核细胞（PBMC）包括淋巴细胞和单核细胞，其体积、形状和比 重与其他细胞不同，红细胞和多核白细胞比重较大，为 1.00 左右，而淋巴细胞 和单个核细胞比重为 1.075 左右。利用密度在 l.077 万0.001 之间近于等渗的 Ficoll-Hypque 混合溶液（称为淋巴细胞分层液）作密度梯度离心时，各种血液成分 将按密度梯度重新分布聚集。血浆和血小板由于密度较低，故悬浮于分层被的上 部;红细胞与粒细胞由于密度较大，故沉于分层液的底部;PBMC密度稍低于分层 液，故位于分层被界面上，这样就可获得PBMC o （如图1-1所示）图 1-1 淋巴细胞分离示意图3. 改变细胞密度法巨噬细胞能够吞噬铁粉，增加其比重，通过密度梯度离心或磁场将其分离;T 细胞能够与绵羊红细胞形成花环，形成的花环复合物比重大，借助密度梯度离心 将 T 细胞分离。（二）根据细胞吸附特性 巨噬细胞能够非特异性粘附于玻璃或塑料表面，根据这种特性可以将巨噬 细胞从混合细胞群体中分离 ;B 细胞能够粘附于尼龙棉上 .通过尼龙棉柱时被阻 滞，从而将其与其他细胞分开。（三根据细胞对渗透压变化的敏感度 倒如红细胞对低渗敏感.通过低渗处理能够裂解红细胞。基于细胞表面标记的分离方法（一）补体细胞毒分离法 采用特异性抗细胞表面标记的抗体，结合具有该表面标记的细胞，在补体的 作用下，使具有该表面标记的细胞发生溶解，将其从混合细胞群体中去除。二免疫磁珠分离法磁性微珠是上世纪80年代初以高分子材料和金属离于（如Fe3O4）为原料聚合 而成的一种以金属离子为核心、外层均匀地包裹高分子聚合体的固相微粒，即磁 性微珠。在班液相中，受外加磁场的吸引作用，磁性微珠可快速沉降。以磁性微 珠为载体，包被上针对某种细胞表面抗原的特异性抗体即可制成免疫磁性微珠。 免疫磁性微珠主要用于细胞的分离和纯化，其基本原理及步骤是:首先将抗特异 细胞表面抗原的抗体致敏到磁珠上，待它与混合体系中的细胞反应后，利用磁力 的作用，便与致敏磁珠结合的细胞与其他物质分离，达到纯化、分离的目的。通 常有二种分离方式：阳性分离和阴性分离。阳性分离是直接从细胞混合液中分离 出靶细胞，阴性分离是利用磁珠去除无关细胞，使靶细胞得以分离。免疫磁珠分离细胞方法简便，快速，无需特殊的设备，且分离纯度高，产率 大，近年来已被广泛应用于人类各种细胞的分离，如T、B淋巴细胞、内皮细胞、 造血祖细胞、单核/巨噬细胞及胰岛细胞、多种肿瘤细胞等。近年来，人们又开发出与生物素结合的单抗亲和素/链霉亲和素-生物素结 合的磁性微珠的实验方法，这种方法旨在利用生物素-亲和素间的高亲和力和生 物放大作用来增强磁性微珠与细胞的结合力，从而提高细胞的分离效率。为了对 细胞分离效果迅速进行分析，可将荧光素（如FITC）标记在亲和素/链毒亲合素表 面，使所分离的细胞在流式细胞仪（FCM）上立即得到测定分析，从而省去了免疫 荧光染色的时间。三流式细胞术流式细胞仪由激光光源系统，气控单细胞层流系统，光检测及信息处理系 统和细胞分离纯化系统组成。（其基本构成框架见下页图 1-2）其工作原理及特点为经过荧光抗体染色的单细胞悬液和鞘液在氮气压力下 同时进行流室，形式鞘液包裹细胞悬液的稳定层流，由喷嘴高速射下（1000-5000 个细胞/s）与垂直而来的激光束交汇。在混合细胞中，由于细胞大小、胞内颗拉多 少及DNA含量等不同，使激光产生不同的散射，分别由散射光检测器接受;细胞 上着染的荧光染料在激发光激发下，发射出荧光，由荧光检测器接受，所有信号 自动传入电子计算机分析处理，迅速藐测得细胞类群及其数量的信息。由高颇超 声振荡器和极向偏转板等构成的细胞分离纯化系统，在分析鉴别不同的细胞类群 的基础上，使带有不同电荷的细胞滴通过电磁场时发生偏离，最后将细胞分别收 集于不同容器内。图 1-2 流式细胞仪组成示意图流式细胞术（FCM）是一种对处在液流中的单个细胞或其他生物微粒（如细菌） 等进行快速定量分析和分选的技术，它将免疫荧光与细胞生物学、流体力学、光 学和电子计算机等多种学科的高新技术融为一体，进行细胞和分子水平的基础理 论与临床应用研究。将荧光标记的单克隆抗体加人 PBMC 悬液内，使二者特异性结合，通过流式 细胞仪自动检测，既可很快得到T、B细胞及其亚群百分率和绝对值的有关数据, 又能以每非高达 5000 个细胞的速度分离和收集无菌的淋巴细胞，纯度可达 90%-99%，细胞活性亦不受影响，可用于淋巴细胞的各种免疫生物学功能测定。免疫细胞功能的检测第一节 免疫细胞数量的检测一、通过检测表面标志（CD分子）检测各类免疫细胞的数量免疫细胞在各自正常分化成熟的不同阶段以及及活化过程中，其细胞膜表面 均表达可供鉴别的特殊结构，即表面标志。其中CD分于常作为各类免疫细胞的 表面标志用于免疫细胞的鉴定和分离以及用于检测在不同状态下某类免疫细胞 含量的变化，能够反映机体免疫功能状态，有助于研究某种疾病的发病机制，为 疾病的诊断和治疗提供依据。一免疫荧光染色技术利用荧光素标记抗人T细胞亚群的单克隆抗体（McAb）直接与人淋巴细胞反 应；或用际记有荧光素的羊（或兔）抗鼠IgG作为第二抗体，再借助McAb的介导 与人淋巴细胞结合。在荧光显微镜下，结合有荧光素标记抗体的细胞在黑暗背景 下发出黄光，凡是呈现特异性黄光的细胞即为阳性细胞，计数阳性细胞，从而确 定 T 细胞各亚群的百分率。上述方法分别称为直接免疫荧光法和间接免疫荧光 法。二）微量细胞毒试验在补体存在的情况下，针对淋巴细胞CD分于的McAb与相应的CD分子结 合，可将细胞杀死，其细胞膜失去屏障作用而使伊红染料透入细胞内，使之染呈 红色。而无相应CD分于的细胞则不受损伤，因而不着色。计数死亡细胞数，即 可判断待检细胞是否具有相应的CD分子，从而确定T细胞的亚群。该方法简便 易行，准确性较高。（三）红细胞花环法采用戊二醛交联技术将McAb或兔抗鼠IgG与羊红细胞（SRBC）结合，制成致敏 的SRBC o抗体致敏的SRBC可与T淋巴细胞直接或间接结合，在T淋巴细胞 周围形成花环。通过计数花环形成率，从而确定 T 淋巴细胞各亚群。该方法可 分为直接红细胞花环法和间接红细胞花环法。四免疫酶染色技术（ABC法）抗体与相应抗原结合后，形成抗原抗体复合物，然而这种复合物在显微镜下 是不可见的，如将特异性抗体与酶结合，再通过适当的底物显色，就可使免疫复 合物由不可见而成为可见，从而确定组织细胞是否存在某种抗原。免疫酶染色技 术正是根据此原理用酶（如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等 ）标记已知抗体（或抗 原），然后与组织细胞在一定条件下反应，如果组织细胞中有相应抗原或抗体存 在，抗原抗体就相互结合形成复合物，其中的酶分于遇到底物时，能催化底物水 解、还原或氧化，产生颜色反应，从而可识别出标本中的抗原。该方法具有敏感 性高，标本可长期保存，而且使用一般光学显微镜就观察等优点。但有时也存在 非特异性染色影响。其基本的方法是将亲和素与酶标生物素反应形成复合物 （ABC），再与生物素化的第二抗体反应，借助与T细胞反应的抗人T细胞亚群的 McAb（第一抗体）介导和酶催化底物的作用，从而使阳性组织或细胞着色。（五）流式细胞术前面已经有所介绍，流式细胞术（FCM ）是一种高速度、高灵敏性、高精 度和高分辨率的自动分析细胞的高新技术。主要用于定量分析单细胞表面、细胞 内抗原和对分子水平的核酸含量的测定。二、抗原特异性T细胞数量的检测一 MHC/多肽四聚体法T细胞通过其表面TCR特异性识别抗原呈递细胞表面的MHC/抗原肽复合 物后，被活化和发生增殖，进而分化成效应细胞。因此，可以用 MHC 抗原肽/ 复合物检测T细胞表面的特异性TCR，来反映抗原特异性T细胞数量的变化。Altman等首次发明MHC/多肽四聚体方法并应用于检测可识别HIV抗原肽 的特异性CTLs,获得成功。后经Walter等改进，成为检测和研究抗原特异性T 细胞数量和功能的新技术。可溶性MHC/多肽四聚体方法敏感性高，克服了传统 方法的局限性，可用于各种抗原特异性 T 细胞表型分析、分离和克隆化，也可 用于检测抗原特异性细胞毒性 T 淋巴细胞数量，为研究与细胞免疫反应有关的 一系列工作提供了高效、快速、敏感的研究手段。其基本方法是将体外表达的 MHC 重、轻链分子及短肽共孵育，使其折叠成 正确的构象，形成MHC/多肽复合体，再经过纯化，并借助于半胱氨酸的巯基与 生物素结合，然后将一个标记荧光的链章含亲和素与 4 个生物素标记的 MHC- 肽复合体结合形成四聚体。这种 MHC 多肽四聚体与抗原特异性 T 细胞上的 TCR 结合后，即可通过灵敏度很高的流式细胞仪(FACS)进行检测。第二节 T、B 淋巴细胞功能测定淋巴细胞功能测定可分为体内试验和体外试验。体内主要是进行迟发型超敏 反应.借此间接了解淋巴细胞对抗原、半抗原或有丝分裂原的反应；体外试验方 法包括淋巴细胞对抗原或有丝分裂原的增殖试验、细胞毒试验以及其分泌产物功 能的测定。淋巴细胞功能测定不仅能够了解机体免疫功能状态 .而且是免疫缺陷 诊断断的主要依据，也有助于探讨某些疾病的发病机理、疗效判断、推断转归。 一、T、B淋巴细胞增殖反应测定淋巴细胞体外增殖反应是检测细胞免疫功能的常用方法。剌激淋巴细 胞增殖的物质可分为二大类:非特异性剌激物:如植物血凝素(PHA)、刀豆蛋白 A(ConA)、美洲商陆(PWM)、佛波酶(PMA)等有丝分裂原;能产生A蛋白的葡萄 球菌(SAC)、EB病毒、链球菌溶血毒素S、细菌脂多糖(LPS)等微生物及其代谢 产物;胃蛋白酶、膜蛋白酶等蛋白物质;抗 CD3、 CD2、 IgM 等细胞表面标志的抗 体以及某些淋巴因子等;特异性剌激物:主要是特异性抗原物质，包括各种可溶 性抗原和细胞表面抗原。不同的剌激因子可剌激不同的淋巴细胞分化增殖，因而 可反映不同淋巴细胞群体的免疫功能。体外测定淋巴细胞增殖反应常采用同位素 掺入法和 MTT 比色法。(一)3H-TdR掺入试验 淋巴细胞受特异性抗原或有丝分裂原剌激后，在转化为淋巴母细胞的过程 中.DNA的合成明显增加。且其转化程度与DNA的合成呈正相关，此时若将合 成DNA的前体物质胸腺嘧啶核苷用放射性同位素(3H-TdR)标记，加入到培养体 系中，即被转化的淋巴细胞摄取而掺人DNA分子内。培养终止后，测定淋巴细 胞内掺入的3H-TdR的放射量，就能判断淋巴细胞的转化程度。此方法较客观、 精确。二MTT比色法MTT 法是 Mosmann1983 年报道的，以后此方法得到了迅速发展并广泛应用 于临床与科研研究。其原理是活细胞内线粒体脱氢酶能将四氮唑化合物 (MTT) 由黄色还原为蓝黑色的甲肷，甲肷的生成量与细胞的增殖程度呈正相关。后者溶 于有机溶剂(如二甲亚枫或酸化异丙醇等).并可在 560nm 波长下进行检测。三)XTT比色法XTT比色法有Scudiero等首次采用，用于检测细胞增殖。XTT是异种与MTT 类似的四唑氮衍生物，可被活细胞线粒体脱氢酶还原成水溶性的棕色甲肷产物， 当XTT与电子耦合剂共同使用时，甲肷的生成量与细胞的增殖程度呈正相关。 二、混合淋巴细胞培养混合淋巴细胞培养(MLC)或称混合淋巴细胞反应(MLR)是来源于两个个体的 淋巴细胞在体外混合培养时，由于细胞表面HLA-II类抗原型别不同，可相互刺 激对方淋巴细胞转化(称为双向MLC)，井产生多种淋巴因子，促进NK、CTL、 LAK等杀伤细胞活性。若将刺激的一方淋巴细胞先用丝裂霉素C或放射线照射 处理，使该细胞失去增殖能力，但仍保留刺激对方淋巴细胞增殖的试验称为单向 MLC。MLC反应可通过3H-TdR掺人法或MTT法等方法检测。MLC 主要用于移植前组织配型，以测定供、受者间组织相容性抗原的相容 程度。也是免疫调节研究中的实验模型。三、细胞毒性T细胞胞毒功能测定细胞毒性T细胞(CTL)是特异性细胞免疫的主要效应细胞之一，它可通过与 靶细胞的直接接触，特异而高效地杀伤靶细胞。其主要生物学作用为参与抗病毒 免疫、抗肿瘤免疫和移植排斥反应。(一)抗CD3McAb诱导的细胞毒性T细胞功能的检测二）特异性抗原诱导的细胞毒性 T 细胞功能检测本方法先借助长期混合淋巴细胞培养法获得抗原特异性CTL,然后再进行 细胞毒试验。其原理为:外周血淋巴细胞包含针对不同抗原的特异性 CTL 克隆， 在体外经某一特定（或同种异体细胞）抗原刺激后,能识别该抗原的 T 细胞克隆被 选择性激活、增殖,而其他 T 细胞克隆则逐渐死亡;经过 3-4 次刺撒后,存活的 均为识别特异性 MHC 抗原肽复合物的细胞,即抗原特异性 CTL。三细胞毒性 T 细胞功能的检测一颗粒酶的胞泌作用分析细胞毒性 T 细胞对靶细胞杀伤的主要机制是通过释放的穿孔素-颗粒酶系统 介导的溶靶细胞作用或通过 fas/fasL 系统介导的细胞凋亡作用。因此,对 CTL 颗粒酶的胞泌作用分析可反映细胞毒性 T 细胞功能。该方捷操作简便且无需靶 细胞作为指示细胞。1.抗 TCR 介导的 CTL 活性酯酶分析法应用直接针对 TCR 的单克隆抗体,模拟特异性靶细胞的作用,诱导 CTL 细胞内颗粒丝氨酸脂酶等的释放。抗TCR可与CTL细胞表面TCR的a和卩链 及 CD3 复合物特异性结合。该法基本过程是,先用单克隆抗体包被微孔板,然 后加入CTL或T淋巴细胞，经一定时间作用后,CTL被活化，收集培养上清液， 如人含DTNB的缓冲液（底物为BLT）.采用分光光度计检测酶的活性，并计算抗 TCR 诱导的酯酶释放百分率。2. 佛波酯和钙离子载体诱导的 CTL 颗粒酶释放分析法用佛波酯和钙离子载体处理CTL.通过一种TCR复合物非依赖性机制，刺激 CTL 细胞颗粒酶的胞泌作用。3. 靶细胞诱导的 CTL 细胞颗粒酶胞泌作用该法通过抗原（靶细胞）刺激CTL的TCR，从而活化CTL。其特点是，可 定量测定CTL-靶细胞特异性的相互作用，这种靶细胞诱导的CTL细胞颗粒酶胞 泌作用，也可通过测定效应细胞或靶细胞的表面分子作为辅助指标。四. B细胞功能的制定B 细胞在抗原或多克隆丝裂原的诱导下分化为浆细胞，产生抗体。因此，实 验室多采用检测多克隆抗体的产生来测定 B 细胞产生和分泌抗体的能力。测定多克隆抗体产生的方法主要有细胞浆（内）Ig的检测和细胞外分泌抗体的 检测，包括反向空班形成法、酶联免疫斑点及ELISA等。其中ELISA法是一种 简便、特异、敏感的非放射性试验方法，广在用于血清组织标本及细胞培养上清 液中 Ig 含量的检测。一反向空斑形成试验(RHPA)反向空斑形成试验(RHPA)是一种体外检测人类Ig分泌细胞的方法。该法将 待检人的PBMC或组织来源的淋巴细胞(如扁桃体、脾细胞等)、SPA致敏的羊红 细胞(SPA-SRBC)、抗人Ig抗体及补体4种成分混合，注入由两张玻片制成的小 室内，密封小室，37C温育3-5h。此时抗人联抗体的Fc段与SPA-SRBC结合， 抗体形成细胞分泌的IgG与抗人IgG结合后，活化补体，介导SPA-SRBC的溶 解。在分泌 Ig 的细胞周围形成圆形的溶血区，称为溶血空斑。每一个溶血空斑 即代表一个Ig分泌细胞。BA-Spot-ELISA法检测抗体形成细胞三细胞凋亡的检测方法1972年Kerr首次提出细胞凋亡的概念。细胞凋亡又称细胞程序性死亡(PCD), 是指在一定的生理、病理情况下，机体为维护内环境的稳定，通过基因调控，高 度有序的，在一系列酶参与下，使生物体内一些无用的、老化的细胞自动死亡的 过程。细胞凋亡是生物体内一种普遍存在的现象，贯穿于机体的整个生命过程， 从胚胎的形成、新旧细胞的变替、前 T 淋巴细胞的清除、某些组织的正常退化、 萎缩与增生及肿瘤细胞的抑制等，都与细胞拥亡有密切的关系。细胞凋亡有别于细胞坏死(Nec),具有自身的形态学特点和生化特性:形态上， 保持完整的膜结构，特征性的细胞浆大泡、细胞核固缩、染色质浓集、核破裂后 被细胞膜包裹形成凋亡小体等。在调亡过程中,可发生特异性级联生化反应,依 赖Ca+。Mg+的核酸内切酶被激活，优先作用于连接DN A的核小体间区域，将 DNA 链切割成 180-200bp 或其倍数的片段。因凋亡细胞在组织中散在分布,胞 膜完整，不会引起局部炎症反应和损伤。而细胞坏死因呈团分布，细胞膜受损， 细胞内容物外溢，引起局部炎症和损伤，同时DNA随机降解，电泳不呈梯状条 带。细胞凋亡检测主要是利用细胞凋亡形态学特点和生化特征来进行的。细胞凋 亡的典型形态学特点是细胞体积缩小，核固缩，核破碎，细胞膜皱缩，有凋亡小 体产生等。通常是对组织或细胞进行各种染色后，通过光学显微镜、荧光显微镜 和电子显微镜来现事上述现象。但在体内细胞拥亡过程发展非常迅速，细胞数小 时内完成凋亡而销亡，不留痕迹，故难山在形态学上现察到典型的细胞凋亡形态。 利用细胞凋亡时染色质或DNA断裂的生化特征，例如运用电泳技术检测核染色 体 DNA 片段化的“梯状”电泳条带、用末端脱氧核糖核苷酸转移酶对 DNA 断片 进行检测等，应用流式细胞分析术检测细胞拥亡目前已建立了多种方法，井能从 多方面证实凋亡和坏死的区别，同时还可检测同一群体不同亚群细胞中的细胞凋 亡。以下介绍几种常用方法。、形态学观察方法 1、HE 染色、光镜观察：凋亡细胞呈圆形，胞核深染，胞质浓缩，染色质成团块状，细胞表面有“出芽”现象。2、丫啶橙（A0）染色， 荧光显微镜观察：活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光。凋亡细胞核染色质 呈黄绿色浓聚在核膜内侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。 3、台盼蓝染 色：如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。如 果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。此方法对反映 细胞膜的完整性，区别坏死细胞有一定的帮助。 4、透射电镜观察：可见凋亡 细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集，常呈新月形，核膜皱褶，胞质紧实， 细胞器集中，胞膜起泡或出 “芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现 象。二、 DNA 凝胶电泳 （一）、检测原理 细胞发生凋亡或坏死，其细胞 DNA 均发生断裂，细胞内小分子量 DNA 片断增加，高分子 DNA 减少，胞质内出现 DNA片断。但凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发生在核小体之间，出现180 200bpDNA 片断，而坏死细胞的 DNA 断裂点为无特征的杂乱片断，利用此特征 可以确定群体细胞的死亡，并可与坏死细胞区别。（二）结果判断 正常活细 胞DNA电泳出现阶梯状（LADDER）条带；坏死细胞DNA电泳类似血抹片时的 连续性条带。三、酶联免疫吸附法（ELISA）核小体测定凋亡细胞的DNA断裂使细胞质内出现核小体。核小体由组蛋白及其伴随的 DNA 片断组成，可由 ELISA 法检测。（一）检测步骤 1、将凋亡细胞裂解后高速离心，其上清液中含 有核小体；2、在微定量板上吸附组蛋白体 3、加上清液使抗组蛋白抗体与核小体上的组蛋白结合 4、加辣过氧化物酶标记的抗 DNA 抗体使之与核小体 上的 DNA 结合 5、加酶的底物，测光吸收值。（二）用途 该法敏感性高， 可检测 5*100/ml 个凋亡细胞。可用于人、大鼠、小鼠的凋亡检测。该法不需要 特殊仪器，适合基层工作，但是不能精确测定凋亡细胞发生的绝多对量。四、流 式细胞仪定量分析。 （一）检测原理 细胞发生凋亡时，其细胞膜的通透性 也增加，但是其程度介于正常细胞与坏死细胞之间。利用这一特点，被检测细胞 悬液用荧光素染色，利用流式细胞仪测量细胞悬液中细胞荧光强度来区分正常细胞、坏死细胞核凋亡细胞。 （二）应用价值 流式细胞仪检测具有以下特点： 1）、检测的细胞数量大，因此其反映群体细胞的凋亡状态比较准确 2）、可以做 许多相关性分析 3）、结合被检测细胞的 DNA 含量的分析，可确定凋亡的细胞 所处的细胞周期检测形态学及细胞膜完整性的Hoechs-PI双染色法细胞发生凋亡时，其细胞膜的通透性液增加，但其程度介于正常细胞和坏死细胞之间，利 用这一特点，被检测细胞悬液用荧光素染色，利用流式细胞仪检测细胞悬液中细 胞荧光强度来区分正常细胞、坏死细胞和凋亡细胞。利用Hoechs-PI染色法, 正常细胞对染料有抗拒性，荧光染色很浅，凋亡细胞主要摄取 Hoecha 染料，呈 现强蓝色荧光，而坏死细胞主要摄取碘化丙啶（PI）而呈强的红色荧光。DNA 片断原位标记法凋亡细胞DNA片断原位末端检测技术是指在细胞（或组织）结构保持不变的情况下，用荧光素、地高辛或生物素标记的脱氧尿三磷酸（deoxyuridinetriphate，DUTP）和末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）相反应与凋亡细 胞裂解后3的羟基（一0H）端结合，经显色反应后检测DNA裂解点的技术。 DNA片段原位标记法有二种：1、原位缺口转移（in situ nick-translation,ISNT） 技术，它是利用DNA多聚酶I将标记的核苷酸连接到断裂DNA的3一0H端2、 原位缺口末端标记技术（in situ end labelling technique,ISEL），即 TUNEL 法，它 是利用TdT将标记的DUPT接到3-0H端。研究证明，TUNEL法的敏感性远高 于ISNT，尤其对早期凋亡的检测，TUNEL更为合适。检测细胞膜成分变化 的 Annexin V 联合 PI 法 1、原理：在细胞凋亡早期位于细胞膜内侧的磷脂酰 丝氨酸（PS）迁移至细胞膜外测。磷脂结合蛋白V （Annexin V）是一种钙依赖性 的磷脂结合蛋白，它于PS具有高度的结合力。因此，Annexin V可以作为探针 检测暴露在细胞外测的磷脂酰丝氨酸。故利用对 PS 有高度亲和力的 Annexin V， 将Annexin V标记上荧光素（如异硫氰酸荧光素FITC）,同时结合使用PI拒染 法（因坏死细胞PS亦暴露于细胞膜外测，且对PI高染）进行凋亡细胞双染法后 用流式细胞仪即可检测凋亡细胞。2、结果判断：正常活细胞Annexin V、PI均低染；凋亡细胞Annexin V高染、PI低染；坏死细胞Annexin V/PI均高染。 3、应用价值:细胞发生凋亡时，膜上的PS外露早于DNA断裂发生，因此Annexin V联合PI染色法检测早期细胞凋亡较TUNEL法更为灵敏。又Annexin V联合 PI染色不需固定细胞，可避免PI染色因固定造成的细胞碎片过多及TUNEL法 因固定出现的DNA片段丢失。因此，Annexin V联合PI法更加省时，结果更为可靠，是目前最为理想的检测细胞凋亡的方法。主要参考文献1. 鲍建芳，沈建根.免疫学实验技术.浙江大学出版社.20062. 张秋萍,王瑾,刘胜武.医学免疫学实验技术.武汉大学出版社.20023. 裘法祖.现代免疫学实验技术.湖北科学技术出版社.19984. 柳忠辉.医学免疫学实验技术.人民卫生出版社.20045. 鲜尽红.免疫检验技术.人民卫生出版社.20086. 王云双,赵英剑,刘永杰.临床免疫学检验.军事医学科学出版社.20077. 王兰兰.临床免疫学和免疫检验.科技文献出版社.20048. 朱立平,陈学清.免疫学常用实验方法.人民军医出版社.2000