甲壳质套管联合骨髓间充质干细胞对脊髓损伤修复的作用

甲壳质套管联合骨髓间充质干细胞对脊髓损伤修复的作用 阿丽娅，宋有鑫，姜保国阿丽娅，宋有鑫，姜保国 北京大学人民医院创伤骨科北京大学人民医院创伤骨科 基金支持：国家基金支持：国家973重大基础研究项目重大基础研究项目(2003CB515306)背景介绍背景介绍中枢神经系统损伤危害中枢神经系统损伤危害传统脊髓损伤的治疗策略传统脊髓损伤的治疗策略组织工程再生医学概念组织工程再生医学概念支架材料支架材料 +种子细胞（生长因子种子细胞（生长因子）支架材料的研究趋势支架材料的研究趋势 天然支架材料天然支架材料 人工合成不可降解支架材料人工合成不可降解支架材料 人工合成生物可降解支架材料人工合成生物可降解支架材料甲壳质套管甲壳质套管 中空圆柱形套管中空圆柱形套管(北京大学人民医院与中国纺织科学院共同发明，专北京大学人民医院与中国纺织科学院共同发明，专利号利号:01136314.2),:01136314.2),套管尺寸套管尺寸:壁厚壁厚0.1mm,0.1mm,内径内径 1.5mm1.5mm。是一种天然高分子聚合物是一种天然高分子聚合物,学名为学名为(1,4)-2-(1,4)-2-乙酰氨基乙酰氨基-2-2-脱氧脱氧-D-D-葡萄糖葡萄糖。甲壳质来源于天然海洋生物生物体结构物质。甲壳质来源于天然海洋生物生物体结构物质,可被体内的酶分可被体内的酶分解而吸收解而吸收,具有良好的吸湿性、纺丝性和成膜性。具有良好的吸湿性、纺丝性和成膜性。生物学特性生物学特性 对生物体无毒性和炎症反应对生物体无毒性和炎症反应 易于在体内降解吸收易于在体内降解吸收 降解吸收周期适宜，可人为调控降解吸收周期适宜，可人为调控 前期实验已证实前期实验已证实“甲壳质套管能够促进损伤甲壳质套管能够促进损伤 后的周围神经再生后的周围神经再生”种子细胞种子细胞 骨髓间充质干细胞骨髓间充质干细胞 神经干细胞神经干细胞 雪旺氏细胞雪旺氏细胞 嗅鞘细胞嗅鞘细胞 目的：初步探讨对脊髓损伤修复是否有影响目的：初步探讨对脊髓损伤修复是否有影响 甲壳质套管甲壳质套管+骨髓间充质干细胞骨髓间充质干细胞 一一、材料和方法材料和方法-材料准备材料准备1.甲壳质套管：无菌甲壳质套管：无菌 3-4mm2.骨髓间充质干细胞（骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cell,MSCs)体外培养体外培养 品系：雄性小鼠品系：雄性小鼠C57BL，表达绿色荧光蛋白，表达绿色荧光蛋白 体重：体重：20g20g2 2 取材：股骨、胫骨、髂骨取材：股骨、胫骨、髂骨 换液培养，取传代后第换液培养，取传代后第3 3代细胞移植（代细胞移植（异种移植异种移植）defabc第三代第三代三种形态三种形态a-c MSCs传代后的第传代后的第3代；代；d-f MSCs的三种形态；的三种形态；a,d MSCs自发荧光；自发荧光；b,e 透透射光照射图像；射光照射图像；c,f 前两图的叠加效果前两图的叠加效果.蓝红黄箭头：多角形，扁平不规则形，蓝红黄箭头：多角形，扁平不规则形，纺锤形纺锤形3.实验动物实验动物 70只雄性只雄性SD大鼠，体重约大鼠，体重约30025g 动物模型为脊髓右侧半横断伤，随机分动物模型为脊髓右侧半横断伤，随机分4组组,每组每组20只（除正常组）只（除正常组）正常组正常组：10只只对照组：单纯半切损伤模型，不予任何治疗；对照组：单纯半切损伤模型，不予任何治疗；甲壳质套管治疗组：半切损伤后套管植入治疗；甲壳质套管治疗组：半切损伤后套管植入治疗；甲壳质套管联合甲壳质套管联合 MSCs组组:半切损伤后套管植入半切损伤后套管植入,移植细胞；移植细胞；取材时间点取材时间点:2w,4w,8w,14w,长期组（长期组（组）组）1d,5d,7d,4w,8w（组）组）脊髓半切损伤动物模型制作流程脊髓半切损伤动物模型制作流程-方法和评估指标方法和评估指标1 1 套管内套管内脊髓损伤位点脊髓损伤位点组织学观察组织学观察1.1 脊髓空洞脊髓空洞（免疫组化（免疫组化-HE染色）染色）8w时组织固定、脱水、浸蜡、包埋、切片，时组织固定、脱水、浸蜡、包埋、切片，HE染色染色1.2 胶质瘢痕胶质瘢痕（免疫荧光（免疫荧光-检测星形胶质细胞，检测星形胶质细胞，GFAP染色）染色）2w/8w组织固定组织固定-再后固定，包埋，冰冻切片，丙酮固再后固定，包埋，冰冻切片，丙酮固 定后洗片封闭，分别加入抗大鼠定后洗片封闭，分别加入抗大鼠GFAP蛋白一抗和相应二抗蛋白一抗和相应二抗 1.3 轴突轴突（透射电镜（透射电镜-2W和和14W时检测超微结构）时检测超微结构）戊二醛固定，后固定，脱水包埋，切片，复染后观察戊二醛固定，后固定，脱水包埋，切片，复染后观察 2.2.检测检测神经纤维是否穿越损伤位点神经纤维是否穿越损伤位点2.1 神经逆行性示踪：神经逆行性示踪：对照组、套管组分别在2周、14周于损伤位点远端注 射10%BDA,多点注射，10天后取大脑和脊髓，脊髓分为近段、远段和损伤段，染色显影，阳性细胞计数2.2 功能学评价功能学评价：BBB功能评分；知觉功能评分，分别在术后1w，2w，4w，6w，8w，10w，12w,14w检测3.3.检测检测MSCsMSCs在套管内的生长情况在套管内的生长情况：激光共聚焦显微镜激光共聚焦显微镜观察是否增殖、迁移，分别在1d，5d，7d，4w，8w检测二、实验结果二、实验结果1 1 脊髓损伤位点组织学观察脊髓损伤位点组织学观察 AB套管组术中和术后大体形态观察套管组术中和术后大体形态观察A:建立脊髓半横断模型后套管缝合建立脊髓半横断模型后套管缝合(4x)；B：6个月后损伤脊髓套管缝合的外观（个月后损伤脊髓套管缝合的外观（4x）1.1 1.1 脊髓空洞（脊髓空洞（8W8W）CAB脊髓损伤位点免疫组化染色脊髓损伤位点免疫组化染色A：套管组：套管组(100 x)，B：MSCs移植组移植组(100 x)；C：对照组（：对照组（100 x），均为），均为8W 1.2 1.2 胶质瘢痕（胶质瘢痕（2W2W）脊髓半横断后星形胶质细胞形态的变化脊髓半横断后星形胶质细胞形态的变化A，B套管联合干细胞组脊髓损伤近远端的星形胶质细胞形态；套管联合干细胞组脊髓损伤近远端的星形胶质细胞形态；C，D对照组脊髓损对照组脊髓损伤近远端星形胶质细胞的形态，均为伤近远端星形胶质细胞的形态，均为400 xABCD套管联合干细胞套管联合干细胞组组 对照组对照组 套管联合干细胞组套管联合干细胞组 对照组对照组 近端近端远端远端1.3 1.3 脊髓内部超微结构脊髓内部超微结构-轴突轴突 ABCDE髓鞘在不同时间点形态（髓鞘在不同时间点形态（10000 x）A：正常轴突；：正常轴突；B：2W时套管干细胞组轴突；时套管干细胞组轴突；C：2W时对照组轴突时对照组轴突;D:14W时套管干细胞组轴突时套管干细胞组轴突;E:14W时对照组轴突时对照组轴突2 2 检测神经纤维穿越损伤位点检测神经纤维穿越损伤位点 ABC神经逆行示踪阳性细胞及神经纤维神经逆行示踪阳性细胞及神经纤维A A：正常大鼠大脑，：正常大鼠大脑，400 x;B400 x;B：14w14w时套管干细胞组大脑，时套管干细胞组大脑，400 x;C:14w 400 x;C:14w 时时套管干细胞组脊髓神经纤维，套管干细胞组脊髓神经纤维，100 x100 x 2.1 逆行示踪结果逆行示踪结果阳性细胞计数阳性细胞计数*2.2 2.2 功能学评价功能学评价-BBB-BBB评分评分0 02 24 46 68 810101212141416161 12 24 46 68 8101012121414Time(Weeks)Time(Weeks)BBB ScoreBBB ScoreT T组组T+MT+M组组CONCON组组粉线代表粉线代表MSCs移植组；蓝线代表套管组，黑线代表对照组移植组；蓝线代表套管组，黑线代表对照组-知觉功能评分知觉功能评分00.511.522.533.51 12 24 46 68 8101012121414Time(Weeks)Time(Weeks)Sensory ScoreSensory ScoreT T组组T+MT+M组组CONCON组组粉线代表粉线代表MSCs移植组；蓝线代表套管组，黑线代表对照组；移植组；蓝线代表套管组，黑线代表对照组；0代表没有任何代表没有任何知觉，知觉，4代表知觉完全正常代表知觉完全正常3 3 检测检测MSCsMSCs在套管内的生长情况在套管内的生长情况 abca-c,MSCs移植1天后的分布,脊髓远端；d-f,MSCs移植4W后的分布，脊髓远端；g-i，MSCs移植8W后的分布，脊髓近端；a,d,g为荧光照射；b,e,h为透射光照射；c,f,i为前两图叠加效果一天 远端 3.1 MSCs 在脊髓中迁移和分布在脊髓中迁移和分布 defghi四周 远端八周 近端3.2 MSCs3.2 MSCs在脊髓中增殖在脊髓中增殖 abcdefu 八八 周周u 五天五天MSCs在大鼠脊髓中生长状态在大鼠脊髓中生长状态 a-c,MSCs移植移植5天时的状态；天时的状态；d-f,MSCs移植移植8W时的状态，可见细胞生长状态良好，且大时的状态，可见细胞生长状态良好，且大量的增殖量的增殖.a,d为荧光照射；为荧光照射；b,e为透射光照射；为透射光照射；c,f为前两图叠加为前两图叠加 三、小结与讨论三、小结与讨论小小 结结 从组织学、功能学角度评价脊髓半横断损伤后再生状况 （1 1）长期观察发现本实验用到的甲壳质套管在脊髓中有）长期观察发现本实验用到的甲壳质套管在脊髓中有固形作用固形作用 （2 2）应用甲壳质套管或复合）应用甲壳质套管或复合MSCsMSCs，脊髓空洞、胶质瘢痕均相对减少，髓鞘再脊髓空洞、胶质瘢痕均相对减少，髓鞘再生状态良好生状态良好；但套管组和套管联合干细胞组之间比较差异不明显；但套管组和套管联合干细胞组之间比较差异不明显 （3 3）应用甲壳质套管或复合）应用甲壳质套管或复合MSCsMSCs，发现大鼠，发现大鼠运动功能和知觉功能均得到明显运动功能和知觉功能均得到明显的改善的改善，功能恢复均显著优于单纯脊髓半切，逆行示踪结果也表明神经再生，功能恢复均显著优于单纯脊髓半切，逆行示踪结果也表明神经再生过程中，过程中，部分神经纤维跨过损伤位点生长部分神经纤维跨过损伤位点生长；但套管组和套管联合干细胞组之；但套管组和套管联合干细胞组之间比较差异不明显。间比较差异不明显。MSCs移植脊髓损伤位点后，发现：（1 1）MSCsMSCs在脊髓中能够从损伤位点远端向近端迁移，从脊髓边缘向中央迁移在脊髓中能够从损伤位点远端向近端迁移，从脊髓边缘向中央迁移（2 2）8 8周时干细胞大量增殖周时干细胞大量增殖讨讨 论论 本实验首次将改造后的甲壳质套管用于修复大鼠脊髓半切损伤本实验首次将改造后的甲壳质套管用于修复大鼠脊髓半切损伤 脊髓组织中甲壳质套管能固形脊髓组织中甲壳质套管能固形、支持，有良好的生物相容性支持，有良好的生物相容性 体内甲壳质套管能为体内甲壳质套管能为MSCsMSCs提供适宜的生长环境提供适宜的生长环境 组织学组织学、功能学等结果证实甲壳质套管联合骨髓间充质干细胞能够功能学等结果证实甲壳质套管联合骨髓间充质干细胞能够改善脊髓改善脊髓损伤损伤位点位点微环境微环境 探讨改善微环境的可能原因：综合因素探讨改善微环境的可能原因：综合因素谢谢谢谢！