G2M检验点调控机制研究概述

G2/M检验点调控机制研究概述季宇彬1,2,高 鹏1,2，邹 翔1，,3( 1哈尔滨商业大学生命科学与环境科学研究中心，哈尔滨107；2。 国家教育部抗肿瘤天然药物工程研究中心,哈尔滨10076; 。哈尔滨商业大学药物所博士后科研工作站，哈尔滨 1507)摘 要：G2/M检验点是阻止带有DN损伤的细胞进入有丝分裂期的最后一道关卡,是目前研究的热点， Cdc2（Cdk1）ycliB复合物是G2/检验点调节的关键因子，2(d)cclinB的活性受多种因素的调控,现对G/M检验点调控机制的研究现状作一综述。关键词：G2/M检验点；cycli； c2 ; c5btat:G2M cellcycehecpos i hefinl hurdle o pevent a ll with DNAdamage fr goig intitos，an s crently naot. Themplx of d （Cdk1）ccthekefactoof G2 Mcell cycl checonts Theactivity of Cd2(Cdk1)cycliBisregulated manyfactor。 Tis oview wud explan the statuquo f molatig mehasmo G2 / cel lceckoins.Keywrds：2/Ml cycle ceckpoints;ccin ；Cd2; dc5细胞周期指连续分裂细胞从一次有丝分裂结束到下一次有丝分裂结束所经历的整个过程，通常分为Gl期、S期、G2期和M期,在这四个时相中均发生特定的生物化学反应.正常细胞中 ,在 G1/和/M 期的转换以及S期的进行都是受到严密调控的。为保证细胞的遗传物质正确复制并被精确传到下一代,长期的进化过程使细胞发展并拥有一套严格有效的周期检查点(cell cyle chekpoins）机制1.检查点又称检验点、检测点或关卡（checkpont）。DNA损伤关卡 （A ageckpoit） 是指N 损伤引发的能使细胞周期延迟或阻滞的生化调控途径。DNA损伤关卡并不是DNA损伤所激活的特有调控途径 ，而是在正常生长情况下所具有的生化反应途径 ,只不过在发生DNA损伤后这种作用被放大。多种因素可以引起DA损伤而最终导致基因产生错义突变、缺失或错误重组;DA损伤会引发多种细胞反应 ，包括DN修复、细胞周期延迟或阻滞、细胞凋亡等。其中细胞周期延迟或阻滞是通过DNA损伤检验点完成的.DNA损伤检验点主要包括 G1/检验点、S检验点和 2 M检验点.G2/期DA损伤检验点的作用是阻止带有D损伤的细胞进入有丝分裂期的最后一道关卡;根据损伤的形式不同 ，分别激活ATM-Ch2d5和ATRChk-Cc25两条通路2，抑制 Cc2(Cdk1）yclinB的活性,阻止细胞进入期.Cd2（Cdk1)cycliB复合物是G2/M检验点调节的关键因子,很多相关基因蛋白则通过直接或间接影响yliB1Cdc2活性或定位参与G2M检验点调控作用。检验点机制的异常会导致周期调控的异常进而可导致细胞的持续性增殖，使肿瘤发生。1 Cc2（Cdk)/ycli1 NA发生损伤后，ATM/ATRChl/hk2Cdc5A/B通路的成员相继被激活或者失活，最终,由Cdk-cyclin复合物感受信号,决定细胞周期的进程。在哺乳动物细胞中，存在着不同的细胞周期蛋白依赖性激酶Cdk以及不同的细胞周期蛋白cycin，对不同的细胞周期阶段进行调控，细胞周期的不同阶段起作用的Cdk-ycn复合物亦不同3.ylinB1Cdc复合物又称有丝分裂促进因子（MPF），是G2M期检验点的关键调节因子,当细胞在G期遭受A损伤时，G2/M期N损伤检验点就会抑制cycli 1-dc2复合物的活性而防止进入有丝分裂，阻滞细胞周期进展，从而使细胞有充足的时间修复损伤的DNA,以维持基因组的完整性。11 d2的表达与G2/M检验点Cdc2的表达异常,会使细胞周期进程发生紊乱,不能正常生长、分化。dc2过表达往往导致细胞细胞周期进程发生紊乱，恶性增殖,形成肿瘤。Yasui等用estenblot研究了胃癌、结肠癌中Cc的表达量，结果表明:dc2的表达量较正常细胞高，有显著性差异。在肝癌方面,i等5报道Cd在70的肝癌组织中过表达.有研究表明:Cdc2基因在人类神经胶质瘤中发挥重要作用，向下调节Cdc2基因的表达可抑制细胞增殖,引起G2/M 阻滞6。由此笔者认为，dc过表达可能使细胞越过2/M检验点。1.2 cyclin B1的表达与G2/M检验点在一些类型的肿瘤细胞系如乳腺癌、结直肠癌、肺癌、宫颈癌、黑素瘤、淋巴瘤、白血病的细胞系中都检测到了cylinB1的过表达， 过表达的ciB大多定位在细胞质，而且其RNA水平也较高,但NA水平的差别并不象蛋白水平差别那么明显，表明cclnB1的失调更大程度上是发生在转录后水平。cyclin1在癌细胞中过表达,可能与激酶Cdc2形成复合物，启动有丝分裂，越过细胞周期检查点，导致失控性的细胞增殖有关.cycln B启动子直接受cmyc和p53调节,但它们的作用相反.5能通过直接抑制yclnB1的转录和核定位,调节2期检查点。而cylin B1的过表达和相关的Cdc2激酶的活化，可越过p53介导的G阻滞89。.如果cmy过表达、5丢失则会上调cyiB1的表达，进而引起纺锤体检查点的改变 10。Sata等11报道：癌基因HRas能以53非依赖性的方式调控G2期检查点.-Ras能诱导SW480细胞和He细胞中cylin B1启动子活性,增加cclinB1的mNA和蛋白表达水平，提高cyclin B-Cdc2复合物表达水平和酶活性。另有报道：rorA和h-CE过表达时会协同刺激cycl B1和CDK1 RNA尾的多腺苷酸化，进而引起cin B和C的过表达，这有助于越过G2或纺锤体检查点，造成染色体异常，导致遗传不稳定性的积累,促使肿瘤发生123。3 Cdc2 cyclin 1的活性与G2/M检验点Cdc2的激活依赖于分裂期ycln 1的积累，clin B合成起于期，在向G2M期过渡中逐渐增加并达高峰,它与Cd2结合成MP复合物(preMPF1）。但由于M期的早期，Cd2的Tyr5和Thr14位点被Wel和Myt1激酶磷酸化,所以CylinB- Cd2 （Cdk1）复合物呈失活状态，其活化需要dc磷酸酶家族将这些位点去磷酸化1,同时需要Cdk激酶（CDK acivang inae,CAK）使 Cc2的Th61磷酸化。当We1的活性下降和Cc25使Cc2去磷酸化，Cdc2活化的障碍C去除，激活的Cd2还可以抑制它的抑制因子We1的活性,形成一个反馈环。由此看出，一旦2期细胞发生DNA损伤或者D复制受阻，2M检验点可以通过减少yclin1来降低Cdc2活性或使dcclB复合物及时失活，使周期运行暂时停滞在G期,这样细胞才能有时间对受损的DN或者复制错误进行修复和校正，避免有丝分裂灾难.然而,在一些人类细胞中，当细胞周期接近期时，yclinB1的水平并未增加,研究发现,在这些细胞中，Cclink2复合物是活化Cdc的关键调控因素，这条信号传导通路在肿瘤细胞中通常是失控的1。 d2的活性还受d的抑制蛋白(cl-dpendn inae ini-itos,C）的负向调节。I是近年来发现的参与细胞周期调控的抑制物，是一种具有抑制Ck功能的新蛋白质，能在细胞周期的特定时刻负向调控dk活性而控制细胞周期的进程。哺乳动物细胞里有2类CKI，一类是Cip/Kip家族，包括p1，2和p57;另一类是nk4家族，包括15,p16， p1和p19.在正常细胞中，p2和PCNA可与多种不同的cyli/k复合物结合成四聚体，其中包括cyclinB与d2形成的复合物,并对其活性具有抑制作用.p53可被Cc2yclinB磷酸化,刺激其对NA的结合，诱导p21基因的转录进而抑制Cdc2的活性15。研究发现:p53和p21cip1/F突变的细胞株将过早离开G/期周期阻滞，进入有丝分裂或启动DNA复制.这将引起基因组的不稳定，最终导致癌突变的积聚。有人认为：APCC 介导的p21 降解会完全地促成Cdk1 的激活16,这也可以证明在G2/M检查点p2具有重要作用。p187基因编码的蛋白质属于细胞周期抑制性调控因子，它与cdc2的关系尚不明了，但有研究表明18在2/M期受Cc2激酶的磷酸化18.1.4 Cc2yl B的定位与G2检验点cyclin1含有两个控制胞质核穿梭的结构域：核定位信号（nucar locaiainsin，l NLS）和胞质滞留信号（cytoplasi retentio sign,l CRS）。NLS通过使cc 与核运输因子importn相互作用而将cclin B-dc2复合物缓慢运往细胞核.CRS内含有核输出信号（uclar exo gna，l NES)， NS介导着核输出因子CR1依赖的核输出,以确保有丝分裂前cyclin B1-d2复合物的细胞质定位。有丝分裂的进入除了需要cyclinB-Cdc2复合物的完全活化外,还需要前期末cycin 1-Cdc2复合物的快速入核.这种快速的核输入，需要cylinB1含NE的CRS磷酸化.活化的cycinB-d2复合物转位入核后，使核内蛋白磷酸化,调节着染色质的浓缩、核膜降解、纺锤体的组装等，推动期进展,在中后期转变中yclinB1通过泛素化途径降解,使Cd2失活。 损伤后， p5的表达量和活性增加，引起p2和13表达上调, 14-3与周期素B1的结合增强，抑制clin B1入核，调节细胞周期中的2/检查点导致G2期阻滞，且13与p21有互相增强作用19.14-3也可以通过直接影响WE1酶活性控制细胞周期,有研究表明:共表达E1和4-3-3可以提高WE1激酶的活性，从而引起G2M阻滞. Pc1编码的蛋白为跨膜蛋白，能特异地与磷酸化的cyn B1 C相互作用，共定位于细胞膜,改变yclinB1正常的亚细胞分布，由此延迟了正常由活化的clin B1/Cd2复合物介导的有丝分裂事件，抑制细胞的生长增殖1。ng等22将表达Gadd5的载体显微注射入正常人成纤维细胞后，细胞被阻滞在G2M期。研究发现d45a诱导的G2/M期阻滞是以p53依赖的方式进行的,Gadd4a可在具有核转位功能的B23蛋白的协助下进入细胞核。23Gad45蛋白的中心区域可与细胞分裂周期基因2(clldsio cyl 2，Cd2)相互作用,使调控G2/M期的Cc2-Cylin1蛋白复合体解离，游离出的CyclinB1蛋白转位出核被迅速降解。新形成Gad45adc2复合体不再有细胞周期依赖性激酶作用，从而诱发细胞2/M期阻滞24.2 Cdc25家族Cdc25家族是调节dk（cclndepedetae）复合物的磷酸酯酶,通过使Cdk的抑制性磷酸化位点发生去磷酸化而达到调控细胞周期进程的目的。在人类细胞中，Cc5家族的成员主要有三个：分别是Cdc25A、Cdc5B和Cdc2，3种Cdc5同工物同其他因子一起,共同调节细胞周期运行和细胞周期检验点应答.早期的预想是Cd25磷酸酶中的3个亚型Cdc5、Cdc2B和dc25C，任何一个仅在细胞周期的某个阶段发生作用，且作用不同25。但是最新的研究显示26：dc25亚型在1/、G转变和期中都有作用，在G2/的转变中,这些dc5亚型对于不完全复制或损伤DNA的细胞表现出同样重要的作用。然而一旦细胞损伤被修复,检验点必须关闭,从而使细胞周期恢复，最近的报道显示：dcB,而不是Cd2A或Cdc25C,在细胞G2检验点诱导的周期阻滞的恢复中起作用7.最近发现:在哺乳动物细胞中延迟G2/M转化的通路除了TM和AR通路外，还有另一个检验点通路p8通路2833。尽管GM检验点包含多种机制,然而已经清楚,一旦被激活,AT， ATR和38通路的作用相同:抑制Cdk1-cyclin 和有丝分裂过程，而Cdc25磷酸酶作为各通路的介导分子起作用。多种因素调控dc25的活性使其参与2/M检验点应答。21Cdc25的表达与G/M检验点Cd25蛋白在细胞周期不同阶段中表达量的变化取决于蛋白合成和降解之间的平衡。其中，Cdc2蛋白在各个周期表达水平基本一致，但是，其他两个成员则有所不同4，c25A在1期的中期至晚期表达,有丝分裂结束通过泛素化蛋白酶解途径进行降解35。最近的研究揭示出有丝分裂结束时Cd25A的降解通过后期促进因子cycsome(PC/C)介导，而在S和G期以及在DA损伤应答中，由Skp1Cul1/o（CF)复合物起到降解作用36.也有观点认为CF在整个细胞周期中调控Cd2A的含量3。Cdc25A过表达导致有丝分裂的无序和对2期阻滞的克服38。Cdc2A的泛素化降解也可导致G2期阻滞39.Cdc5在期开始积累,也是以泛素介导的蛋白酶解方式降解。 。2 C25的磷酸化、亚细胞定位与2/M检验点基本说来,磷酸化和转运到核内是调控其活性的重要因素。Cc2家族三个成员在细胞中定位一直发生着变化,主要被433蛋白调控。当A损伤发生，A/ATR激活hkl/hk2，使Cdc5家族成员发生磷酸化，促使它们失去催化Cdk1的活性,或者促使它们的特定磷酸化位点和1-33蛋白结合，使它们滞留在细胞质中而不能入核，从而使它们失去活化Cd1ycinB1复合物的能力，随之发生G/期阻滞,4。有人报导：人型免疫缺陷病毒pr可通过抑制Cd25磷酸化来阻止c5入核而引发2M期阻滞42。另有报道:MPAP（MAK sociadprtei, MPK结合蛋白）激酶的活化,进一步结合和磷酸化c5B以及Cdc25C的特定位点43。这进一步介导Cdc25B和Cdc25C与1433的结合,促进dc5B向胞浆的转运，从而共同诱导G2延迟2832。3参与G2/检验点调控的其它转录因子除了以上提到的53调节着p21，133 的转录参与细胞周期检查点调控外,还存在其它的转录因子。其中，NF作为一种重要的核转录因子，在大多数细胞中可通过上调促细胞存活基因和凋亡抑制基因的表达，抑制促细胞凋亡因子,活化持续正性生长信号，以多种机制保护细胞免于凋亡,但有报导 NB信号转导通路，也能上调P21蛋白的表达,参与细胞2/期阻滞44.也有研究表明药物酸性黄能抑制恶性黑色素瘤细胞核因子活性而清除内源性一氧化氮，通过s途径使色素瘤细胞生长停滞于G2/M期而凋亡.E2F家族转录因子调控细胞周期相关基因的表达，通过抑制目的基因的表达加强G2期的阻滞，E2F家族成员被认为参与调节第二次持久的2/M期阻滞45。研究发现，Rb家族成员对DNA损伤引起的细胞周期检查点应答反应也有着重要作用,具体可以分为3个方面：（1)与F共同调节相关基因的转录;（)诱导细胞停滞，为DNA损伤修复赢得时间；（3）抑制D双链断裂的产生。Rb2/p130和107通过调节G2/M相关基因，如Cd2和cyclinB基因、染色体凝聚基因MC4、纺锤体形成基因Stthi等的表达,在G2M期阻滞中起着重要调节作用464结语DNA损伤检验点通过一系列复杂的信号转导通路调控细胞周期的进程，为基因组的修复提供充足的时间,同时参与修复过程，以此确保基因组的稳定和遗传物质的准确传递。大多数肿瘤细胞存在1/S检验点缺陷，这使得它们具有生存优势。然而这种缺陷也使肿瘤细胞在遭受破坏基因组稳定性的因素威胁时更加依赖于G2/M检验点的作用，而G2/M检验点缺陷的肿瘤细胞发生损伤时则会发生有丝分裂灾难。因篇幅所限，上面介绍的工作只限于G/M期检查点研究领域的一部分最新进展.可以看出,研究人员对此检查点的分子作用机制已有了很多认识.但是， 上述调控2/期检查点的因素并不是单独的发挥作用，对一些分子的确切作用机制以及各种分子之间是如何协同交叉发挥作用等仍知之甚少。参考文献：1 Huaa H，VrsisenJ，vanriessenWJ concieeview f DA damaecepits andreparn mamicellsJ。ardovasc RevascMe,6,（3)：6172.2 u B ,KimS，i DS，e al. 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