植物种质资源的保存.ppt

第十章植物种质资源的离体保存,一、定义 植物种质资源（又称品种资源、遗传资源或基因资源）是指携带各种不同遗传物质的植物总称，包括栽培，野生及人工创造的各种植物的品种或品系。是生物多样性的重要组成部分，是选育优质、高产、抗病（虫）、抗逆新品种的物质基础，是生物技术研究取之不尽的基因来源。 种质是亲代通过生殖细胞或体细胞传递给子代并决定固有生物性状的遗传物质。 种质资源保存是指在天然或人工创造的适宜环境条件下，贮存植物种质，使其保持生命力与遗传性的技术。,概 述,二、种质资源保存方式,原生境保存（就地保存）：是指在原来的生态环境中，就地进行繁殖保存种质。 如：建立自然保护区或保护小区，甚至保护点等途径来保护作物及经济林木的野生近缘植物物种。,珍宝岛国家级自然保护区,内蒙古科尔沁国家级自然保护区,龙门南昆山省级自然保护区,2、非原生态保存：是指种质保存于该植物原生态生长地以外的地方。 包括： 异地保存（种质圃或植物园保存） 种质库（种子）保存 离体（试管）保存等。,华南植物园,西双版纳植物园,三、保存方式的利弊,1、 原生境保存和异地保存 弊：需耗费巨大的人力、物力和土地，在实际中很难实施，而且易受自然灾害、虫害和病害的侵袭，造成植物资源的丧失。 2、 种质库（种子）保存 弊：1）生活力随储存期的延长逐渐丧失；2）无性繁殖的植物（如苹果、柑橘等）难于采用种子保存；3）采用无性繁殖来保持其优良性状的植物（许多果树），用种子繁殖后代会发生变异；4）顽拗型种子植物（芒果、椰子、油棕等）因其种子不易干燥脱水和低温储藏，不宜用种子保存或保存难度很大；5）有些植株不产生种子，如脐橙、香蕉；6）易遭自然灾害袭击而使种质资源丢失。,3、离体保存 是将植物外植体在无菌环境下进行组织培养，并贮存在各类生长抑制条件下，使其缓慢生长或停止生长，以达到长期保存的目的，而在需要利用时可迅速恢复正常生长。 种质资源的离体保存打破了植物生长季节限制，具有节省贮存空间、便于运输和交流等优点。对于利用营养器官繁殖的材料，可防止多代繁殖造成种性退化及病毒感染，保证了种质的优良性和遗传稳定性。,三、保存方式的利弊,种质资源离体保存,方法包括： 常温限制生长保存 低温保存 超低温保存,第一节 植物种质资源的常温限制生长保存,一.常温限制生长保存的概念 正常条件下离体培养不适合种质资源保存，因为在这种条件下，材料生长很快，需要经常进行继代，工作量及费用增加，在继代过程中易受微生物的污染，而且会由于取样的随机性造成基因资源的丢失。因此，常温限制生长保存方法是使培养物处于无生长或缓慢生长状态下抑制植物的生长。,二、常温保存的方法和原理,1、高渗保存法 是指通过提高培养基的渗透压，减少培养物吸收养分和水分的量，减缓生理代谢过程，从而减缓生长速度，达到抑制培养物生长的种质保存方法。 高渗物质：甘露醇（46%）、蔗糖+甘露醇 高渗配合低温保存效果更明显。如： 610低温下，培养基中加4%甘露醇，可保存马铃薯1 2年，存活率最高可达90%以上。,2、生长抑制剂保存法 在培养基中加入生长抑制剂以减缓培养材料的生长，达到长期保存种质材料的保存方法。 生长调节剂： 脱落酸（ABA）、青鲜素、矮壮素（CCC）、多效唑等 使试管苗生长缓慢，生长健壮、叶色浓绿、移栽成活率高。,二、常温保存的方法和原理,3、饥饿法 从培养基中减去12种营养元素，使植株缺乏相关营养而处于最小生长量。 4、矿物油覆盖法 使培养材料与空气隔绝，延缓生长。 5、低光照培养 适当减弱光照强度，缩短光照时间，进而减缓试管苗生长。 6、低压保存 降低培养材料周围气压，达到抑制生长的目的分为低气压与低氧压两种，保存原理相似。 7、干燥保存法 降低培养物水分，其生命活动就能延缓，这与传统的种子干燥储存类似。脱水和限制糖的供应量常被看成是一个正常种子成熟经历的类似过程。,二、常温保存的方法和原理,第二节 植物种质资源的低温保存,一、低温保存的概念 植物种质资源的低温保存是指用离体培养的方式在非冻结程度的低温下（一般为19）保存种质方法。 对于植物而言，低温常常是指那些比常温稍低一些的温度。,二、低温保存的原理,在植物生长条件中，温度是个重要的因素。植物必须有适宜的温度，当温度降低以后，植物的成长速度就会受到抑制而减慢，老化程度延缓，因而延长了继代的时间间隔达到保存种质的目的。,植物对低温的耐受力不仅取决于基因型，也是与它们起源和生长的生态条件有关。 正确选择适宜低温是保存后高存活率的关键。,三、低温保存的优点,低温保存的技术操作简单，需要设备少，投资小，技术成熟，存活率高，保存时间长等特点为。可以作为植物种质资源的中长期保存方法。,1、低温保存的技术操作简单。 以魔芋为例，选取茎尖分生组织为外植体，建立试管苗无性系；选取生长健壮的、芽大小为1.5cm的材料移入保存培养基，于25，光照度1000lx，12h条件下培养一周；转入4黑暗中保存。材料每6个月继代培养一次，继代培养时，从形态、经济性状、生理生化等方面进行遗传稳定性鉴定。,三、低温保存的优点,泰坦魔芋,2、植物种质资源低温保存时间长，保存的数量多。如葡萄在植株在9条件下，通过每一年转换一次新鲜培养基，可以保存15年之久，而在常温的条件下需要1-3个月转接一次，通过这种方法，在2m2实验室面积上保存了800个葡萄品种。而在田间需要1hm2土地。,怀来葡萄,塘雅葡萄,三、低温保存的优点,一、物种资源超低保存的发展概况 二、物种资源超低温保存的原理 三、超低温保存的基本程序 四、超低温保存的实例,植物物种资源的超低温保存,第三节,1.超低温保存发展,一、物种资源超低保存的发展概况, 20世纪70年代，Nag和Street证明胡萝卜悬浮培养细胞在 液氮中保存能恢复生长。,1999年，Moukadiri等研究表明：超低温保存对水稻愈伤组织再生后代的表性特征没有影响。,2001年.刘云国等发现苹果茎尖经保存后，谱带没有发生变化。,2.结论 植物离体材料的超低温保存是长期保存种质资源的理想方法。,（一）超低温保存的原理,二、物种资源超低温保存的原理,在超低温保存过程中，植物细胞内自由水被固定化或汽化，仅剩下不能被利用的束缚水，酶促反应停止，几乎所有的细胞代谢活动、生长都停止了；当解冻后，又能恢复在生力。,注意：降温冷冻和降温过程对植物的影响 过慢：细胞脱水过度，导致“溶液效应”的毒害； 过快：细胞内结冰，形成冰晶小、数量多，对细胞造成不可逆伤害 适宜：脱水速缓慢，胞内溶液冰点将平衡降低，避免胞内结冰； 非常快：迅速通过冰晶生长危险温度区，细胞不会死亡。,在细胞冷冻保存时，由于细胞外的水首先形成冰态，引起细胞外渗透压升高，导致细胞脱水，进一步使细胞内环境发生改变，可导致蛋白质变性，酶系统失活，细胞受损。,27,液体的固化方式 低温冷冻保存细胞方式 玻璃化：是指液体转变为非晶态（玻璃态）的固化过程，与平常所见到的冻结过程不同。在玻璃态时，水分子没有重排，不产生结构和体积的变化，因而不会由于机械或溶液效应造成组织和细胞伤害，化冻后的细胞仍有活力。 细胞冷冻技术的关键是尽可能地减少细胞内水分，减少细胞内冰晶的形成，需要重点考虑保护剂使用和冷冻方法两个重要因素。,1、冷冻保护剂的特性 特点：易溶于水，对细胞无毒，容易从组织细胞中清除。 之所以能对生物组织起到一定的保护作用，原因是： 1、在溶液中产生强烈的水合作用，提高溶液的黏滞性，从而可在温度下降的同时降低冰晶形成和增长的速度。 2、增加细胞膜通透性，加速细胞内的水流到细胞外结冰，从而防止细胞内结冰造成的伤害。 3、冷冻前或冷冻期间，冷冻保护剂可以防止“溶液效应”的毒害。 4、冷冻保护剂还可能直接或间接地作用于细胞膜，减少冷冻对膜的伤害。,（二）冷冻保护剂的种类及特性,29,（二）冷冻保护剂的种类及特性,2、冷冻保护剂的种类 渗透性冷冻保护剂 易与水分子结合，易穿透细胞膜进入细胞内部，从而降低细胞冰点，提高细胞膜对水的通透性。 冻存时，保护剂可促进细胞内水分渗出细胞外，从而减少胞内冰晶的形成； 复苏时，促进细胞外水分进入细胞，缓解渗透性肿胀引起的损伤。 甘油、二甲亚砜是最常见的渗透性保护剂。,30,非渗透性冷冻保护剂 一般是些大分子物质，不能渗透到细胞内部，但能溶于水，可稀释细胞外电解质的浓度，从而减少溶质损伤； 这些大分子物质可结合水分子，降低细胞外自由水的含量，减少胞内冰晶的形成。 主要包括聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖等。,三、超低温保存的基本程序,预处理,材料的选取,降温及保存,解冻,再培养,活力检测,（一）材料的选取,分类中哪一种是最理想的离体保存材料？为什么？,愈伤组织、悬浮组织、原生质体,花粉和花粉胚,茎尖、腋芽原基、胚、幼龄植物,分类,遗传稳定性好，易于再生，且细胞体积小，液泡小，原生质浓稠、含水量较低，细胞质较浓，比含有大液泡的愈伤组织细胞更抗冻。,材料,选取,（二）材料的预处理,保存,降温,解冻,再培养,活力,检测,方法： 1.加速继代 2.提高培养基渗透压 3.添加冷冻防护剂 4.低温处理,目的： 在最短的时间内有效地提高植物组织细胞的抗寒力，从而提高冷冻后材料的成活率和再生力。,时间： 3 4周,预处理,预处理,（三）降温冷冻及超低温保存,解冻,再培养,活力,检测,1.传统的降温冷冻方法：,快速冷冻法：将保存材料从0或其他预培养温度直接投入液氮中保存。,慢速冷冻法：在冷冻保护剂存在下，以0.110 /min降温速度从0降到-70，接着浸入液氮中进行保存。,降温 保存,-140 -10是冰晶形成和增长的危险温度区,两步冷冻法：把慢速冷冻和快速冷冻结合起来的一种方法。,逐级冷冻法：准备不同的温度的水浴，材料经冷冻剂处理后，在每一级停留一定的时间，然后浸入液氮。,预处理,（三）降温冷冻及超低温保存,解冻,再培养,活力,检测,优点：与传统的方法相比，操作更简单、重演性好、保存方面有较好的应用潜力。,2.玻璃化保存法,装载,脱水,液氮冷冻,定义 ：液体转变为非晶体（玻璃态）的固化过程。,原理：将生物材料经高浓度玻璃化保护剂处理使其快速脱水后直接投入液氮，使其生物材料发生玻璃化转变，进入玻璃化状态。此间水分子没有发生重排，不形成晶体，也不发生结构体积的变化。,步骤：,降温 保存,预处理,（三）降温冷冻及超低温保存,再培养,活力,检测,将包含有样品的褐藻酸钠溶液滴向高钙溶液，因褐藻酸钙的生成而固化成球状颗粒，然后将包埋后有保存材料的褐藻钙小珠在含有高浓度的培养基上预培养，使样品获得高的抗冻力抗脱水力，结合适合的脱水和降温方式，最后保存在液氮中。,3.包埋脱水法超低温保存,定义：,优点：,与玻璃法相比，保存方面有更大的应用潜力、不需昂贵的降温设备，降温不甚严格，被保存样品体积大，易于操作等优点,降温 保存,4、包埋玻璃化法超低温保存 是包埋脱水法与玻璃化法的结合，克服了玻璃化法和包埋法各自的缺点。 基本操作程序 预培养和包埋玻璃化溶液脱水液氮保存化冻恢复培养,解冻,再培养,检测,预处理,（三）降温冷冻及超低温保存,降温 保存,预处理,（四）解冻,活力,检测,分类： 1）快速解冻法：将冷冻的材料取出，迅速放入3540温水中解冻，并小心摇动，待材料中的结晶完全融化为止。特点：融冰速度快，细胞内的水分来不及再次形成冰晶就己完全融化，因而对细胞的损伤较轻。,。,解冻的速度是解冻技术的关键,定义 ：将液氮中保存的材料取出，使其融化，以进一步恢复培养。,2）慢速解冻法：把材料置于0 或23 的低温一慢慢融化。,超低温冷冻材料解冻时，再次结冰的危险区域是-60 -50,解冻,如何选择解冻速度？,1、与材料的特性有关 2、与材料原来冷冻速度有关 一般来说： 冷冻速度超过-15/min，解冻时宜采用快速解冻，否则应采用慢速解冻； 液泡小和含水量少的细胞（如茎尖分生组织）可采用快速解冻法； 液泡大含水量高的细胞，脱水处理后的干冻材料以及木本植物的冬眠芽则宜用慢速解冻法。,活力,检测,预处理,解冻,预处理,（五）再培养,活力,检测,。,由于冷冻与解冻的伤害，冻后细胞的生理与结构上都不同于未冷冻的细胞，因此，适于两种细胞生长的培养及成分是不同的。为了提高再培养时的存活率，对冷冻保存后的材料重新培养时，需要一些特殊的条件。比如，控制光照时间、在培养基中加入一定的PVP、水解酪蛋白、赤霉素等,再培养,预处理,（六）细胞或组织活力的检测,分类： 1.形态学观察法：最简便、最直观 2.细胞学：较为复杂,可通过核型分析、原位杂交观察染色体数目和结构变异。 3.分子生物法：最理想，如PCR扩增的RFIP和RAPD等分子标记技术。,原因：,常用指标：存活率,方法：TTC还原法、荧光素二乙酸酯染色法、伊凡蓝 染色法等,超低温保存植物种质资源的目的就是要长期保持植物具有高的活力、存活率以及遗传稳定性，能通过稳定性的检测是非常重要的。,活力检测,四、超低温保存实例,怀山药种质资源的玻璃化法超低温保存,低温锻炼,预培养,玻璃化保护剂处理,材料冷冻保存,材料化冻洗涤,成活率检测,将继代培养60天的怀山药试管苗置于4冰箱中低温锻炼7天。,无菌条件下切取11.5cm的带芽茎段，转至含5%蔗糖+3%甘露醇的培养基内，置4冰箱预培养2天,预培养后茎段先用60%的PVS1（22%甘油+13%乙二醇+13%PEG+10%DMSO）在室温处理60min，再用100%的PVSO1在0 条件下处理60min,将玻璃化保护剂处理过的材料迅速放入液氮中，保存24h,将材料从液氮中取出，在37 水浴中快速化冻，用含5%蔗糖的MS培养液洗涤4次，每次停留10min,将洗涤后的材料接种到再生培养基上培养，记录成活率及恢复生长的时间,43,思考并回答： 细胞冷冻保存要注意的关键问题是什么？ 冷冻保护剂有几类？各有何特点？,