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,1.1 DNA重组技术的基本工具,限制性核酸内切酶“分子手术刀” DNA连接酶“分子缝合针” 运载体“分子运输车”,分子手术刀限制性核酸内切酶(限制酶),1.来源:,主要从原核生物中分离纯化,想一想: 这类酶在原核生物中起什么作用? 为什么细菌中限制酶不剪切细菌本身的DNA？,2.作用:,4.识别序列:,1、识别特定核苷酸序列； 2、切开特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键。,3.切割后产生的DNA片段末端的形式：,黏性末端 或,平末端,一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列,EcoRI限制酶,被同一种限制酶切断的几个DNA是否具有相同的黏性末端？,黏性末端,是,一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切点上切割DNA分子。,下列黏性末端属于同种内切酶切割而成的是 A、 B、 C、 D、,T C G A G C T T A A,A G G T T C C A,A G C T T C A G,A A T T C G,A,DNA连接酶,“分子缝合针”DNA连接酶,分类,E.coliDNA连接酶,T4DNA连接酶,想一想:DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗?为什么?,寻根问底,DNA连接酶与DNA聚合酶是一回事吗?为什么?,1)只能将单个核苷酸连接到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯键,形成磷酸二酯键,1)在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键,2)以一条DNA链为模板，将单个核苷酸通过磷酸二酯键连接成一条互补的DNA链,2)将DNA双链上的两个缺口同时连接起来，不需要模板,作为载体的必要条件：,1、能自我复制或整合到受体染色体DNA上 随染色体DNA的复制而同步复制； 2、有一或多个限制酶的切割位点； 3、必须带有标记基因； 4、必须是安全的，不会对受体细胞有害； 5、大小应合适，以便提取和体外操作。,基因的运输工具运载体,基因的运输工具运载体,质粒存在于许多细菌和酵母菌等生物中,是细胞染色体外能够自主复制的很小的环状DNA分子。,常用的运载体：,质粒、噬菌体的衍生物和动植物病毒等。,限制性核酸内切酶的识别序列和切点是GGATCC，限制性核酸内切酶的识别序列和切点是GATC。在质粒上有酶的一个切点，在目的基因的两侧各有一个酶的切点。 1、请画出质粒被限制性核酸内切酶切割 后所形成的黏性末端。 2、请画出目的基因两侧被限制性核酸内切 酶切割后所形成的黏性末端。,1、下列不属于基因工程的运载体的是（ ） A、质粒 B、噬菌体 C、细菌 D、病毒,C,2、判断： A、限制酶的切口一定是GAATTC碱基序列 B、质粒是基因工程中唯一的运载体 C、重组技术所用的工具酶是限制酶、连接酶、 运载体,3、在基因工程中，切割运载体和含有目的 基因的DNA片段，需使用（ ） A、同种限制酶 B、两种限制酶 C、同种连接酶 D、两种连接酶,原核生物容易受到自然界外源DNA的入侵，但是，生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，以防止外来病原物的侵害。限制酶就是细菌的一种防御性工具，当外源DNA侵入时，会利用限制酶将外源DNA切割掉，以保证自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，从而达到保护自身的目的。 含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。,限制酶在原核生物中的作用,T,磷酸二酯键,A,EcoR,黏性末端,黏性末端,EcoR,黏性末端,黏性末端,Sma,平末端平末端,限制酶所识别的序列，无论是6个碱基还是4个碱基，都可以找到一条中轴线，中轴线两侧的双链DNA上的碱基是反向对称、重复排列的。,想一想限制酶所识别的序列有什么特点？,