DNA的粗提取与鉴定.ppt

DNA的粗提取与鉴定,一.DNA在氯化钠溶液中的溶解度，是随着氯化钠的浓度的变化而改变的。当氯化钠的物质的量浓度为0.14 mol/L时，DNA的溶解度最低。利用这一原理，可以使溶解在氯化钠溶液中的DNA析出。,实验原理:,二.DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精溶液。利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少的DNA。,三.DNA遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。,目的要求:初步掌握DNA的粗提取和鉴定的方法，观察提取出来的DNA物质。,材料用具:鸡血细胞液（5 10 mL）。 铁架台，铁环，镊子，三角架，酒精灯，石棉网，载玻片，玻璃棒，滤纸，滴管，量筒（100 mL，1个），烧杯（100 mL，1个，50 mL、1 000 mL各2个），试管（20 mL，2个），漏斗，试管夹，纱布。 体积分数为95%的酒精溶液（实验前置于冰箱内冷却24 h），蒸馏水，质量浓度为0.1 g/mL的柠檬酸钠溶液，物质的量浓度分别为2 mol/L和0.015 mol/L的氯化钠溶液，二苯胺试剂。,方法步骤,取质量浓度为0.1 g/mL的柠檬酸钠溶液（抗凝剂）100 mL，置于500 mL烧杯中。将宰杀活鸡流出的鸡血（约180 mL）注入烧杯中，同时用玻璃棒搅拌，使血液与柠檬酸钠溶液充分混合，以免凝血。然后，将血液倒入离心管内，用1 000 r/min（转每分）的离心机离心2 min，此时血细胞沉淀于离心管底部。实验时，用吸管除去离心管上部的澄清液，就可以得到鸡血细胞液。（如果没有离心机，可以将烧杯中的血液置于冰箱内，静置一天，使血细胞自行沉淀。）,制备鸡血细胞液，制备的方法是：,思考题：1.为什么要吸去上清液取沉淀物？,2.生活在牧区的人们，采集牛、羊和马血比较方便，他们能否选用牛、羊、马血做实验材料？为什么？,答案：1.上清液是血浆不含血细胞，血细胞沉淀在试管底部细胞核含DNA。 2.不能。因为哺乳动物成熟的红细胞中无细胞核，仅靠白细胞和淋巴细胞中的少数DNA，在实验中很难提取到。,注意：盛放鸡血细胞液的容器，最好是塑料容器。 鸡血细胞破碎以后释放出的DNA，容易被玻璃容器吸附，由于细胞内DNA的含量本来就比较少，再被玻璃容器吸附去一部分，提取到的DNA就会更少。因此，实验过程中最好使用塑料的烧杯和试管，这样可以减少提取过程的DNA的损失。,1.提取鸡血细胞的细胞核物质,将制备好的鸡血细胞液5 10 mL，注入到50 mL烧杯中。向烧杯中加入蒸馏水20 mL，同时用玻璃棒沿一个方向快速搅拌5 min，使血细胞加速破裂。然后，用放有纱布的漏斗将血细胞液过滤至1 000 mL的烧杯中，取其滤液。,思考3:加入蒸馏水的目的是什么？为什么能达到此目的？,答案：加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂)，从而释放出DNA；蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂。,2.溶解细胞核内的DNA,将物质的量浓度为2 mol/L的氯化钠溶液40 mL加入到滤液中，并用玻璃棒沿一个方向搅拌 1min，使其混合均匀，这时DNA在溶液中呈溶解状态。 思考：为什么用2 mol/L的氯化钠溶液？为什么玻璃棒沿一个方向搅拌 ？ 答案：DNA在2 mol/L的氯化钠溶液中溶解度最大。防止DNA断裂。,3.析出含DNA的黏稠物,沿烧杯内壁缓缓加入蒸馏水，同时用玻璃棒沿一个方向不停地轻轻搅拌，这时烧杯中有丝状物出现，继续加入蒸馏水，溶液中出现的黏稠物会越来越多。当黏稠物不再增加时停止加入蒸馏水。（这时溶液中氯化钠的物质的量浓度相当于0.14 mol/L。）,思考题：此时加入蒸馏水的目的是什么？,答案：使氯化钠溶液浓度接近014mol/L，使DNA最大限度地析出。,5.将DNA的黏稠物再溶解,取一个50 mL烧杯，向烧杯内注入物质的量浓度为2 mol/L的氯化钠溶液20 mL。用钝头镊子将纱布上的黏稠物夹至氯化钠溶液中，用玻璃棒沿一个方向不停地搅拌3 min，使黏稠物尽可能多地溶解于溶液中。,4.滤取含DNA的黏稠物,用放有多层纱布的漏斗，过滤步骤3中的溶液至1 000 mL的烧杯中，含DNA的黏稠物被留在纱布上。,思考题：这次过滤与上次过滤的目的一样吗？为什么？,答案：不一样；这次过滤是为了去除溶于氯化钠溶液的杂质，而上次过滤是为了去除破裂的细胞膜等物质。,6.过滤含有DNA的氯化钠溶液,取一个100 mL烧杯，用放有两层纱布的漏斗过滤步骤5中的溶液。取其滤液，DNA溶于滤液中。,思考题：这一步骤的目的是什么？为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质？,答案：除去含有DNA滤液中的杂质； 用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。,7.提取含杂质较少的DNA,在上述滤过的溶液中，加入冷却的、体积分数为95%的酒精溶液50 mL，并用玻璃棒沿一个方向搅拌，溶液中会出现含杂质较少的丝状物。用玻璃棒将丝状物卷起，并用滤纸吸取上面的水分。这种丝状物的主要成分就是DNA。,思考题：这一步骤的目的是什么？为什么加入的酒精需要冷却的？,答案：去除溶于酒精的杂质； 可抑制核酸水解酶的活性，防止降解DNA；降低分子的运动，易于形成沉淀析出；低温有利于增加DNA分子柔韧性，减少断裂。因此，使用冷却的酒精，对DNA的凝集效果较佳。,8. DNA的鉴定,取两支20 mL的试管，各加入物质的量浓度为0.015 mol/L的氯化钠溶液5 mL，将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。然后，向两支试管中各加入4 mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5 min，待试管冷却后，观察并且比较两支试管中溶液颜色的变化。,思考题：为什么要设置对照组？实验中能观察到什么现象？,答案：确定二苯胺不与氯化钠发生颜色反应； 实验组试管中可看到溶液变蓝色。,【例l】 下图为“DNA的粗提取与鉴定”的实验示意图，其正确的操作顺序是 解析 DNA位于鸡血细胞的细胞核中。采用加蒸馏水并且搅拌的方法，可使鸡血细胞大量吸水胀破，细胞膜、核膜破坏，搅拌的机械作用更加速了细胞的破裂释放出的核物质其实是DNA、RNA和蛋白质的混合物。在浓度较高的氯化钠溶液中核蛋白质容易解聚，DNA的溶解度也很高，经过滤便分离出含少量杂质的DNA。根据DNA在冷却的95的酒精中凝集反应强烈的性质，进一步纯化DNA。将DNA溶解于较高浓度的氯化钠溶液中，加入冷却的95的酒精溶液，可使DNA沉淀、浓缩，形成含杂质较少的DNA丝状物。,答案:D,1次加酒精:第7步析出含杂质较少的DNA 2次加蒸馏水：第1步（血细胞胀破） 第3步（稀释氯化钠溶液） 3次过虑： 第1步（DNA存在于滤液中） 第4步（DNA留在纱布上） 第5步（DNA存在于滤液中） 4次调整氯化钠浓度：第2步2molL、第3步0.14 mol/L、第5步2molL、第8步0.015 mol/L的。 5次使用玻璃棒搅拌：第1步（血细胞胀破）、第2步第5步（加速DNA溶解）、第3步（稀释氯化钠溶液析出DNA）、第7步（提取含杂质较少的DNA）（整个实验共7次，提取核物质，鉴定),口诀：柠檬离心一水滤，二钠三水四粘滤， 五钠六滤七酒析，八胺沸浴蓝取绿。,练习1在破碎血细胞时，要先加入20 mL的蒸馏水，其作用是 ADNA溶解水中 B血细胞破裂，DNA释放 C稀释血液，防止凝固 D有利于搅拌 2用过滤的方法得到细胞中的氯化钠溶液后，还要用酒精处理，可以得到较纯化的DNA这是因为： ADNA易溶于酒精，而滤液中某些杂质不易溶于酒精 BDNA不易溶于酒精，而滤液中某些杂质易溶于酒精 CDNA和滤液中其他成分更易溶于酒精 DDNA和滤液中其他成分都不溶于酒精 3、与析出DNA粘稠物有关的叙述，不正确的是 A.操作时缓缓滴加蒸馏水，降低DNA的溶解度 B.在操作A时，用玻璃棒轻缓搅拌，以保证DNA分子完整 C.加蒸馏水可同时降低DNA和蛋白质的溶解度，两者均可析出 D.当丝状粘稠物不再增加时，此时NaCl的浓度相当于0.14mol/L 4、在向溶解DNA的NaCl溶液中，不断加入蒸馏水的目的是 A.加快溶解DNA的速度 B.加快溶解杂质的速度 C.减少DNA的溶解度，加快DNA析出 D.减小杂质的溶解度，加快杂质的析出,答案1B 2B 3、C 4、C,6在进行DNA粗提取实验时，为得到含DNA的黏稠物，某同学进行了如下操作： 在新鲜鸡血中加入适量的柠檬酸钠，经离心后，除去血浆留下血细胞备用。取510ml血细胞放入50ml的塑料烧杯中，并立即注入20ml 0.015molL的氯化钠溶液，快速搅拌5分钟后经滤纸过滤，取得其滤液。滤液中加入40ml 2molL的氯化钠溶液，并用玻璃棒沿一个方向快速搅拌1分钟。上述溶液中缓缓加入蒸馏水，同时用玻璃棒沿一个方向不停地轻轻搅拌，直到溶液中出现丝状物为止，再进行过滤而得到含DNA的黏稠物。 实验结果是：所得到的含DNA的黏稠物极少，导致下一步试验无法进行。,（1）指出并改正上述实验操作中的错误： (2) 要进一步提取DNA时需加入冷却的酒精，作用是和。,答案（1）“20ml 0.015molL的氯化钠溶液”错误，应改为“20ml蒸馏水” “经滤纸过滤”错误，应改为“经纱布过滤” “直到溶液中出现丝状物为止”错误，应改为“直到溶液中丝状物不再增加时为止”（2）凝集DNA 溶解其他细胞物质,8、DNA的粗提取与鉴定的实验(如下图)： (1) 本实验材料选用鸡血细胞液而不是用鸡的全血，主要原因是由于鸡血细胞液中含有较高含量的_。 (2) 图A中加入蒸馏水的目的是_。 (3) 通过图B所示步骤取得滤液后，再向滤液中加入2 molLNaCl溶液的目的是_。 (4) 图C所示加入蒸馏水的目的是_。 (5) 为鉴定实验所得丝状物的主要成分是DNA，可用_试剂进行检验，颜色反应为_色。,答案（1）DNA （2）使血细胞吸水涨破，释放出核物质DNA （3）使DNA溶解于NaCl溶液中 （4）使DNA的溶解度下降而析出 （5）二苯胺 蓝色,9、填写本实验完成下列实验操作时所用试剂。 提取鸡血细胞中核物质 溶解核内DNA： 析出2mol/LNaCl溶液中的DNA 提取杂质较少的DNA白色乳状丝状物 DNA的鉴定,答案蒸馏水 2mol/LNaCl溶液 蒸馏水 冷却的95%的酒精 二苯胺,