红曲黄酒综合实验设计方案

红曲黄酒综合实验设计方案感官评价一、实验目的对自酿红曲黄酒进行风味、质地、外观的描述性感官评价，熟悉掌握描述性感官评价的方法。二、实验原理通过品尝自酿红曲黄酒，对其风味、质地、外观进行描述性感官评价，每位评价员根据品尝结果在事先给出描述词汇中进行选择，并给样品的每种特性强度打分，统计每位评价员的实验结果，进行T检验，描绘出雷达图，判定其评价结果是否合理，从而得出小组结论。三、实验要求要求在光线明亮、无异味存在的环境中，进行实验，每位评价员在实验过程中相互隔离，独立完成实验，品尝事先给定的样品，对其风味、质地、外观进行描述性感官评价，并根据品尝结果在事先给出描述词汇中进行选择，并给样品的每种特性强度打分，将自己得到的结果写在记录上，统计每位评价员的实验结果，进行T检验，判定其评价结果是否合理，从而得出小组结论。实验后提交实验报告。四、实验准备1） 材料及样品制备（1） 材料：自酿红曲黄酒120mL（2） 样品制备：将酒分成8杯（3） 样品储藏：样品的温度应保持一致（4） 品评托盘：按实验人数、轮次数准备2） 品评表设计（1） 方法选择：描述性检验法（2） 样品编码：利用随机数表或计算机品评系统进行编码（3） 主控表：包括品评员编号、提供样品编号、品评表编号等（4） 品评表设计表1 感官评价记录表品评员 品评日期 感觉顺序强度 （1-5分）样品1样品2色泽澄清度香气酒度稠厚度酸味甜味苦味余味滞留度综合印象五、实验步骤样品品评打分汇总统计报告（1） 观察样品的颜色（2） 用直接嗅觉法评价样品的香气香气的评价方法：通过直接嗅觉法。评价员应闭上嘴巴，用鼻子吸嗅挥发气味，不规定吸嗅的方法，只要在适当的时间间隔内用同样的方式即可。（3） 品评口味将分成的红曲黄酒样品放入口中品尝，在口中停留足够再咽下。每次品尝后，用水漱口。以上各步骤进行结束后，立即在品评表中适当描述词处划钩。（4） 品评表汇总（5） 统计分析：采用统计学T检验方法进行数据处理，并根据计算数据绘制雷达图。（6） 结果报告：撰写实验报告数据汇总表品评员色泽香气口味澄清度酒度苦酸甜滞留度12345678910平均值标准方差最大值最小值T1T2六、注意事项注意样品的储藏，由于所用的样品是酒，可能有些风味感觉太强，所以要用心品评。理化检验红曲黄酒总糖的测定（铁氰化钾滴定法）一、实验原理 费林溶液与还原糖共沸，在碱性溶液中将铜离子还原成亚铜离子，并与溶液中亚铁氰化钾络合而呈黄色。以次甲基蓝为指示液，达到终点时，稍微过量的还原糖将次甲基蓝还原成无色为终点，依据试样水解液的消耗体积，计算总糖含量。二、实验试剂与仪器试剂：盐酸，约1.14 g/mL 盐酸溶液，6mol/L 量取50 mL盐酸，加水稀释至100 mL。氢氧化钠溶液，200g/L 费林甲液：称取15.0 g硫酸铜(CuSO4 5H2O)及0.05g次甲基蓝,加水溶解并定容至1000mL，摇匀备用。费林乙液：称取50g酒石酸钾钠、54g氢氧化钠及4g亚铁氰化钾，加水溶解并定容至1000mL,摇匀备用。葡葡糖标准溶液，1g/L 称取1.0000g经103105烘干至恒重的无水葡葡糖 (精确至0.1mg)，加水溶解，并加5ml盐酸，再用水定容至1000mL，摇匀备用。甲基红指示液，1g/L 称取0.10g甲基红，溶于乙醇并稀释至100 mL 。仪器感量为0.1mg的分析天平感量为0.01g的分析天平电热干燥箱电炉：300W500W 三、操作步骤1、空白试验 准确吸取费林甲、乙液各5.00mL于100mL锥形瓶中,加入9 mL葡萄糖标准溶液（1g/L），混匀后置于电炉上加热，在2min内沸腾，然后以45s一滴的速度继续滴入葡萄糖标准溶液，直至蓝色消失立即呈现黄色为终点，记录消耗葡萄糖标准溶液的总体积。2、样品的测定1）样品预处理：吸取试样2.00 mL10.00mL(控制水解液总糖量为1 g/L2 g/L)于100mL容量瓶中,加30 mL水和5 mL盐酸溶液（6mol/L）,在6870水浴中加热水解15min。冷却后，加入2滴甲基红指示液（1g/L），用氢氧化钠溶液（200g/L）中和至红色消失（近似于中性）。加水定容，摇匀，用滤纸过滤后备用。2）预滴定：准确吸取费林甲、乙液各5.00mL及5.00 mL样品水解液于100mL锥形瓶中, 摇匀后置于电炉上加热至沸腾, 用葡萄糖标准溶液滴定至终点，记录消耗葡萄糖标准溶液的体积。3）滴定：准确吸取费林甲、乙液各5.00mL及5.00 mL样品水解液于100mL锥形瓶中,加入比预滴定体积少1.00mL的葡萄糖标准溶液，摇匀后置于电炉上加热至沸腾，继续用葡萄糖标准溶液滴定至终点。记录消耗葡萄糖标准溶液的体积。接近终点时，滴入的葡萄糖标准溶液用量应控制在0.50 mL1.00 mL。 四、结果计算 按下式计算总糖的含量,结果的表述以算术平均值报三位有效数字： 式中:X 一样品中总糖的含量，g/L；V。一空白试验时，消耗葡萄糖标准溶液的体积，mL；V一样品测定时，消耗葡萄糖标准溶液的体积，mL；c一葡萄糖标准溶液的浓度，g/mL；n一样品的稀释倍数。所得结果表示至一位小数。五、精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的5%。（同一样品两次滴定结果之差不得超过0.10 mL。）红曲黄酒非糖固形物的测定一、实验原理试样经100105加热，其中的水分、乙醇等可挥发性物质被蒸发，剩余的残留物即为总固形物。总固形物减去总糖即为非糖固形物。二、实验仪器1）天平：感量0.0001g2）电热干燥箱：温控13）干燥器：内装盛有效干燥剂三、实验步骤吸取试样5mL于已知干燥至恒重的蒸发皿（或直径为50mm、高30mm称量瓶）中，放入1032电热干燥箱烘干4h，取出称量。四、计算 试样中总固形物含量按式（1）计算：（1）式中：X1试样中总固形物的含量，单位为克每升（g/L）；m1蒸发皿（或称量瓶）和试样烘干至恒重的质量，单位为克（g）；m2蒸发皿（或称量瓶）烘干至恒重的质量，单位为克（g）；n 试样稀释倍数：V 吸取试样的体积，单位为毫升（mL）。试样中非糖固形物含量按式（2）计算： X=X1X2 （2）式中：X试样中非糖固形物的含量，单位为克每升（g/L）；X1试样中总固形物的含量，单位为克每升（g/L）；X2试样中总糖的含量，单位为克每升（g/L）。所得结果表示至一位小数。五、精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的5%。红曲黄酒PH的测定 一、实验原理 将玻璃电极和甘汞电极浸入试样溶液中，构成一个原电池。两极间的电动势与溶液的pH有关。通过测量原电池的电动势，即可得到试样溶液的pH。二、实验仪器 酸度计（精度0.01），备有玻璃电极和甘汞电极（或复合电极）。三、实验步骤 1）按仪器使用说明书调试和校正酸度计。2）用水冲洗电极，再用试液洗涤电极两次，用滤纸吸干电极外面附着的液珠，调整试液温度至251，直接测定，直至pH读书稳定1min为止，记录。或在室温下测定，换算成25是的pH。所得结果表示至小数点后一位。四、精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的1%。红曲黄酒中氧化钙的测定（高锰酸钾滴定法） 一、实验原理试样中的钙离子与草酸铵反应生成草酸钙沉淀。将沉淀滤出，洗涤后，用硫酸溶解，再用高锰酸钾标准溶液滴定草酸根，根据高锰酸钾溶液的消耗量计算试样中氧化钙的含量。二、实验试剂与仪器试剂： 甲基橙指示液（1g/L）： 称取0.10g甲基橙，用水溶解并稀释至100ml。氢氧化铵溶液（1+10）： 1体积氢氧化铵加入10体积的水，混匀。硫酸溶液（1+3）: 1体积硫酸+3体积水高锰酸钾标准溶液（0.01mol/L）: 按GB/T 601配制与标定。临用前，准确稀释10倍。饱和草酸铵溶液、浓盐酸仪器：电炉（300500W）、滴定管（50ml）三、实验步骤准确吸取试样25ml于400ml烧杯中，加水50ml，再依次加入甲基橙指示液3滴、盐酸2ml、饱和草酸铵溶液30ml，加热煮沸，搅拌，逐滴加入氢氧化铵溶液直至试液变为黄色。 将上述烧杯置于40温热处保温2h3h，用玻璃漏斗和滤纸过滤，用500ml氢氧化铵溶液分数次洗涤沉淀，直至无氯离子（经硝酸酸化，用硝酸银检验）。将沉淀及滤纸小心从玻璃漏斗中取出，放入烧杯中，加沸水100ml和硫酸溶液25ml，加热，保持6080使沉淀完全溶解。用高锰酸钾标准溶液滴定至微红色并保持30s为终点。记录消耗的高锰酸钾标准溶液的体积V1 。同时用25ml水代替试样作空白试验，记录消耗高锰酸钾标准溶液的体积V0 。四、计算 试样中氧化钙的含量（所得结果表示至一位小数）：X= （V1 -V0）c0.028 1000 V2式中： X试样中氧化钙的含量（g/L）; V1测定试样时，消耗0.01mol/L高锰酸钾标准溶液的体积（mL）； V0空白试验时，消耗0.01mol/L高锰酸钾标准溶液的体积（mL）； c高锰酸钾标准溶液的实际浓度（mol/L）； 0.028氧化钙的摩尔质量的数值（g/mol）；V2吸取试样的体积（mL）五、精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的5%。红曲黄酒中-苯乙醇的测定一、实验原理 试样被气化后，随同载气进入色谱柱，利用被测各组分在气、液两相中具有不同的分配系数，在柱内形成迁移速度的差异而得到分离。分离后的组分先后流出色谱柱，进入氢火焰检测器中被检测，依据色谱图各组分的保留值与标样作对照定性；利用峰面积，按内标法定量。二、实验试剂与仪器试剂：乙醇溶液（15%vol）：吸取15ml乙醇(色谱纯)，加水稀释至100ml,摇匀。-苯乙醇标准溶液（2%vol）：吸取-苯乙醇(色谱纯)2ml，用乙醇溶液定容至100ml。2-乙基正丁酸内标溶液（2%vol）：吸取2-乙基正丁酸(色谱纯)2ml，用乙醇溶液定容至100ml。仪器： 气相色谱仪：配有氢火焰离子化检测器（FID）。 微量注射剂：2L。 毛细管色谱柱：PEG20M，柱长25m30m，内径0.32mm，或同等分析效果的其他色谱柱。三、色谱条件载气：高纯氮汽化室温度：230检测器温度：250柱温（PEG20M毛细管色谱柱）：在50恒温2min后，以5/min的升温速度至200，继续恒温10min。载气、氢气、空气的流速：随仪器而异，应通过实验选择最佳操作流速，使-苯乙醇、内标峰与酒样中其他组分峰获得完全分离。四、标准值的测定 吸取-苯乙醇标准溶液1ml，移入100ml容量瓶中，计入内标溶液1ml，用乙醇溶液定容。此溶液中-苯乙醇和内标的浓度均为0.02%vol。 开启仪器，待色谱仪基线稳定后，用微量注射器进样（进样量随仪器的灵敏度而定），记录-苯乙醇和内标的保留时间及其峰面积。 -苯乙醇的相对校正因子值计算： 式中：-苯乙醇的相对校正因子A1-测定标样值时，内标的峰面积A2-测定标样值时，-苯乙醇的峰面积d2-苯乙醇的相对密度d1 -内标物的相对密度1. 试样的测定 取试样约8ml于10ml容量瓶中，加入内标溶液0.1ml，用试样定容。混匀后，在与测定值相同的条件下进样。依据保留时间确定-苯乙醇和内标色谱峰的位置，并测定其面积，计算出试样中-苯乙醇的含量。2. 计算试样中-苯乙醇的含量计算（所得结果表示至一位小数）： 式中： X-试样中-苯乙醇的含量（mg/L）A3-试样中-苯乙醇的峰面积A4-添加于试样中内标的峰面积c-试样中添加内标的浓度（mg/L）红曲黄酒酒精度的测定一、实验原理试样经过蒸馏，用酒精计测定馏出液中酒精的含量。二、实验仪器电炉：500w800w。冷凝管：玻璃，直形。酒精计：标准温度20，分度值为0.2。水银温度计：50，分度值为0.1。量筒：100mL。三、实验步骤在约20时，用容量瓶量取试样100mL,全部移入500mL蒸馏瓶中，用100mL水分次洗涤容量瓶，洗液并入蒸馏瓶中，加数粒玻璃珠。装上冷凝管，通入冷水，用原100mL容量瓶接收馏出液（外加冰浴）。加热蒸馏，直至收集馏出液体积约95mL时，停止蒸馏。于水浴中冷却至约20,用水定容。摇匀。倒入100mL量筒中，测量馏出液的温度与酒精度。按测得的实际温度和酒精度标示值查附录A，换算成20时的酒精度。四、计算所得结果表示至一位小数。五、精密度在重复性条件下获得的两次独立测得结果的绝对差值不得超过算术平均值的5%。红曲黄酒中总酸、氨基酸态氮的测定一、实验原理氨基酸是两性化合物，分子中的氮基玉甲醛反应后失去碱性，而使羧基呈酸性。用氢氧化钠标准溶液滴定羧基，通过氢氧化钠标准溶液消耗的量可以计算出氨基酸态氮的含量。二、实验试剂与仪器试剂：(1)甲醛溶液：36%38%（无缩合沉淀）。(2)无二氧化碳的水：按GB/T 603制备。(3)氢氧化钠标准滴定溶液（0.1mol/L）:按GB/T 601配制和标定。仪器：(1)酸度计或自动电位滴定仪：精度0.01pH。(2)磁力搅拌器。(3)分析天平：感量0.0001g。三、实验步骤按仪器使用说明书调剂和校正酸度计。吸取试样10mL于150mL烧杯中，加入无二氧化碳的水50mL。烧杯中放入磁力搅拌棒，置于电磁搅拌器上，开启搅拌，用氢氧化钠标准溶液2(3)滴定，开始时可快速滴加氢氧化钠标准滴定溶液，当滴定至pH=7.0时，放慢滴定速度，每次加半滴氢氧化钠标准滴定溶液，直至pH=8.20为终点。记录消耗0.1mol/L氢氧化钠标准滴定溶液的体积（V1）。加入甲醛溶液2(1)10mL,继续用氢氧化钠标准滴定溶液滴定至pH=9.20,记录加入甲醛后消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积（V2）。同时做空白试验，分别记录不加甲醛溶液及加入甲醛溶液时，空白试验所消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积（V3，V4）。四、计算试样中总酸含量按下式计算： X1=（V1-V3）c0.090 1000 V 式中: X1试样中总酸的含量，单位为克每升（g/L）； V1测定试样时，消耗0.1mol/L氢氧化钠标准滴定溶液的体积，单位为毫升（mL）； V3空白试验时，消耗0.1mol/L氢氧化钠标准滴定溶液的体积，单位为毫升（mL）； c氢氧化钠标准滴定溶液的浓度，单位为摩尔每升（mol/L）； 0.090乳酸的摩尔质量的数值，单位为克每摩尔（g/mol）； V吸收试样的体积，单位为毫升（mL）。试样中氨基酸态氮含量按下式计算： X2=（V2-V4）c0.014 V 1000式中：X2试样中氨基酸态氮的含量，单位为克每升（g/L）；V2加甲醛后，测定试样时消耗0.1mol/L氢氧化钠标准滴定溶液的体积，单位为毫升（mL）；V4加甲醛后，空白试验时消耗0.1mol/L氢氧化钠标准滴定溶液的体积，单位为毫升（mL）；c氢氧化钠标准滴定溶液的浓度，单位为摩尔每升（mol/L）；0.014氮的摩尔质量的数值，单位为克每摩尔（g/mol）；V吸收试样的体积，单位为毫升（mL）。所得结果表示至一位小数。五、精密度在重复性条件下获得的两次独立测得结果的绝对差值不得超过算术平均值的5%。微生物检验细菌菌落总数测定一、实验原理 菌落总数就是指在一定条件下（如需氧情况、营养条件、pH、培养温度和时间等）每克（每毫升）检样所生长出来的细菌菌落总数。菌落总数测定是用来判定黄酒被细菌污染的程度及卫生质量，它反映黄酒在生产过程中是否合卫生要求，以便对被检样品做出适当的卫生学评价。菌落总数的多少在一定程度上标志着食品卫生质量的优劣。菌落总数检验工作中会遇到各种实验平板的菌落计数工作，如倾注法平板，螺旋接种平板，3M菌落总数测试纸片，滤膜法平板等。二、实验试剂和仪器 1.培养基和试剂： 无菌生理盐水：称取8.59氯化钠溶于1000mL蒸馏水中，121高压灭菌15min。1mol/L氢氧化钠（NaOH)：称取40g氢氧化钠溶于1000mL蒸馏水中。1mol/L盐酸（HCl)：移取浓盐酸90mL，用蒸馏水稀释至1000mL。PetrifilmTM菌落总数测试片和压板。平板计数琼脂培养基磷酸盐缓冲液 2.仪器 恒温培养箱：361，301冰箱：25恒温水浴箱：461天平：感量0.1g。3.5均质器振荡器。无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具o.lmL刻度）无菌锥形瓶：容量250mL、500mL无菌培养皿：直径90mm。pH计或pH比色管或精密pH试纸。放大镜或（和）菌落计数器或PetrifilmTM1）自动判读仪。三、实验步骤 1.流程被检样品用生理盐水进行无菌稀释，做成几个适当稀释倍数的悬液选择23个适当稀释度悬液各1ml，加入无菌空培养皿内，每个稀释度做23个培养皿每个培养皿中倾注约15ml熔化并冷却到45 左右的营养琼脂或肉汤琼脂培养基，冷却后，于37培养24h菌落计数报告结果2.菌落计数报告a操作方法：培养到时间后，计数每个平板上的菌落数。可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平板的菌落总数后，求出同稀释度的各平板平均菌落数，计算处原始样品中每克（或每ml）中的菌落数，进行报告。b到达规定培养时间，应立即计数。如果不能立即计数，应将平板放置于04，但不得超过24h。c计数时应选取菌落数在30300之间的平板（SN标准要求为25250个菌落），若有二个稀释度均在30300之间时，按国家标准方法要求应以二者比值决定，比值小于或等于2取平均数，比值大于2则其较小数字（有的规定不考虑其比值大小，均以平均数报告）。d若所有稀释度均不在计数区间。如均大于300，则取最高稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。如均小于30，则以最低稀释度的平均菌落数乘稀释倍数报告之。如菌落数有的大于300，有的又小于30，但均不在30300之间，则应以最接近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数报告之。如所有稀释度均无菌落生长，则应按小于1乘以最低稀释倍数报告之。有的规定对上述几种情况计算出的菌落数按估算值报告。e不同稀释度的菌落数应与稀释倍数成反比（同一稀释度的二个平板的菌落数应基本接近），即稀释倍数愈高菌落数愈少，稀释倍数愈低菌落数愈多。如出现逆反现象，则应视为检验中的差错（有的食品有时可能出现逆反现象，如酸性饮料等），不应作为检样计数报告的依据。f当平板上有链状菌落生长时，如呈链状生长的菌落之间无任何明显界限，则应作为一个菌落计，如存在有几条不同来源的链，则每条链均应按一个菌落计算，不要把链上生长的每一个菌落分开计数。如有片状菌落生长，该平板一般不宜采用，如片状菌落不到平板一半，而另一半又分布均匀，则可以半个平板的菌落数乘2代表全平板的菌落数。g当计数平板内的菌落数过多（即所有稀释度均大于300时），但分布很均匀，可取平板的一半或1/4计数。再乘以相应稀释倍数作为该平板的菌落数。8菌落数的报告，按国家标准方法规定菌落数在1100时，按实有数字报告，如大于100时，则报告前面两位有效数字，第三位数按四舍五入计算。固体检样以克（g)为单位报告，液体检样以毫升（ml）为单位报告，表面涂擦则以平方厘米（cm）报告。大肠菌群测定一、实验原理大肠菌群是一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌，该菌主要来源于人畜粪便，故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量，推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。食品中的大肠菌群数系以100ml(g)检样内大肠菌群最可能数(MPN)表示。二、实验试剂和仪器1.试剂 乳糖胆盐发酵管、伊红美蓝琼脂平板、乳糖发酵管、革兰氏染色液、结晶紫染色液、95%乙醇、蒸馏水、生理盐水、番红染液2、仪器 恒温培养箱、1000ml三角烧瓶、1ml、10ml移液管、接种针、显微镜、超净工作台、玻片、酒精灯、洗耳球、试管架、天平、培养皿、试管、三、检验程序被检样品乳糖胆盐发酵管，361，242h不产气大肠杆菌阴性报告产气伊红美兰琼脂平板，361，242h革兰氏染色革兰式阳性大肠杆菌阴性报告革兰氏阴性无芽孢杆菌乳糖发酵管，361，242h产气不产气大肠杆菌阳性大肠杆菌阴性报告报告稀释三、操作步骤：1. 检样稀释（1） 以无菌操作将检样25ml放于含有225ml灭菌生理盐水或其他稀释液的灭菌玻璃瓶内（瓶内预置适当数量的玻璃珠），经充分振摇制成1：10的均匀稀释液。（2） 用1ml灭菌移液管吸取1:10稀释液1ml，注入含有9ml灭菌生理盐水的试管内，振摇试管混匀，做成1:100稀释液。（3） 另取1ml灭菌吸管，按上条操作依次做10倍递增稀释液，每递增稀释一次，用1支1ml灭菌一移液管。（4） 根据食品卫生标准要求或对被检样品污染情况的估计，选择三个稀释度，每个稀释度接种三管。2. 乳糖发酵实验将待检样品接种于乳糖胆盐发酵管内，接种量在1ml以上者，用双料乳糖胆盐发酵管，1ml及1ml以下者，用单料乳糖胆盐发酵管。每一稀释度接种三管，置361温箱内培养242h,如所有乳糖胆盐发酵管都不产气，则可报告大肠杆菌阴性，如有产气者，按下列程序进行。3分离培养 将产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，置361温箱内，培养1824h，然后取出，观察菌落形态，并做革兰氏染色和证实实验。4证实试验：在上述平板上，挑取可疑大肠菌群菌落12个进行革兰氏染色同时接种乳糖发酵管，置于361温箱内培养242hr，观察产气情况。乳糖发酵管产气，革兰氏染色为阴性的无芽孢杆菌，即可报告为大肠菌群阳性5报告 根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，报告每100ml(g)大肠菌群的最可能数。 金黄色葡萄球菌检验 Baird-Parker平板计数法一、 实验原理金黄色葡萄球菌进入人体内，可引起局部的痈疾和蜂窝组织炎，还可以引起肺炎、心肌炎、骨骼炎、肾盂肾炎等系统化脓性感染，甚至可发展成败血症。此外，食品中生长金黄色葡萄球菌是食品卫生中的一种潜在危险，因为金黄色葡萄球菌在是中会产生肠毒素，食用后将引起食物中毒，这在我国细菌性食物中毒事件中，仅次于沙门氏菌和副溶血弧菌。因此，检验食品中金黄色葡萄球菌是实际意义。绝大多数金黄色葡萄球菌在血琼脂平板上产生金黄色色素，菌落周围有透明的溶血圈，在厌氧条件下能分解甘露醇产酸，产生血浆凝固酶和耐热的DNA酶一、 实验设备和材料恒温培养箱：36 1 。冰箱：2 5 。恒温水浴箱：37 65 。无菌吸管：1 mL（具0.01 mL 刻度）、10 mL（具0.1 mL 刻度）或微量移液器及吸头。无菌锥形瓶：容量100 mL、500 mL。无菌培养皿：直径90 mm。注射器：0.5 mL。pH 计或pH 比色管或精密pH 试纸。二、 培养基与试剂1、 10 %氯化钠胰酪胨大豆肉汤2、 7.5 %氯化钠肉汤3、 血琼脂平板4、 Baird-Parker 琼脂平板5、脑心浸出液肉汤(BHI)。6、 稀释液：磷酸盐缓冲液7、 营养琼脂小斜面8、 革兰氏染色液9、 无菌生理盐水注：各培养基的配料与制作见附录A三、 检验程序四、 操作步骤1、 样品的稀释以无菌吸管吸取25 mL样品置盛有225 mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。用1 mL 无菌吸管或微量移液器吸取1:10 样品匀液1 mL，沿管壁缓慢注于盛有9 mL 稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1 支1 mL 无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100 的样品匀液。按上述的方法，制备10 倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1 次1 mL 无菌吸管或吸头。2、 样品的接种选择2 个3 个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10 倍递增稀释时，每个稀释度分别吸取1 mL 样品匀液以0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL 接种量分别加入三块Baird-Parker 平板，然后用无菌L 棒涂布整个平板，注意不要触及平板边缘。使用前，如Baird-Parker平板表面有水珠，可放在25 50 的培养箱里干燥，直到平板表面的水珠消失。3、 培养在通常情况下，涂布后，将平板静置10 min，如样液不易吸收，可将平板放在培养箱36 1培养1 h；等样品匀液吸收后翻转平皿，倒置于培养箱，36 1 培养，45 h48 h。4、 典型菌落计数和确认金黄色葡萄球菌在Baird-Parker 平板上，菌落直径为2 mm3 mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落有似奶油至树胶样的硬度，偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落；但无混浊带及透明圈。长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌落所产生的黑色较淡些，外观可能粗糙并干燥。选择有典型的金黄色葡萄球菌菌落的平板，且同一稀释度3 个平板所有菌落数合计在20 CFU200 CFU 之间的平板，计数典型菌落数。如果：a）只有一个稀释度平板的菌落数在20 CFU200 CFU之间且有典型菌落，计数该稀释度平板上的典型菌落；b） 最低稀释度平板的菌落数小于20 CFU 且有典型菌落，计数该稀释度平板上的典型菌落；c） 某一稀释度平板的菌落数大于200 CFU 且有典型菌落，但下一稀释度平板上没有典型菌落，应计数该稀释度平板上的典型菌落；d） 某一稀释度平板的菌落数大于200 CFU 且有典型菌落，且下一稀释度平板上有典型菌落，但其平板上的菌落数不在20 CFU200 CFU 之间，应计数该稀释度平板上的典型菌落；以上按公式（1）计算。e） 2 个连续稀释度的平板菌落数均在20 CFU200 CFU 之间，按公式（2）计算从典型菌落中任选5 个菌落（小于5 个全选），做血浆凝固酶试验。5、血浆凝固酶试验：挑取、Baird-Parker 平板或血平板上可疑菌落1 个或以上，分别接种到5 mL BHI和营养琼脂小斜面，36 1 培养18 h24 h。取新鲜配置兔血浆0.5 mL，放入小试管中，再加入BHI 培养物0.2 mL0.3 mL，振荡摇匀，置361 温箱或水浴箱内，每半小时观察一次，观察6 h，如呈现凝固（即将试管倾斜或倒置时，呈现凝块）或凝固体积大于原体积的一半，被判定为阳性结果。同时以血浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌菌株的肉汤培养物作为对照。也可用商品化的试剂，按说明书操作，进行血浆凝固酶试验。结果如可疑，挑取营养琼脂小斜面的菌落到5 mL BHI，36 1 培养18 h48 h，重复试验。五、 结果计算公式（1）：T = AB/Cd（1）式中：T样品中金黄色葡萄球菌菌落数；A某一稀释度典型菌落的总数；B某一稀释度血浆凝固酶阳性的菌落数；C某一稀释度用于血浆凝固酶试验的菌落数；d稀释因子。公式（2）T =（A1B1/C1+A2B2/C2）/1.1d.(2)式中：T 样品中金黄色葡萄球菌菌落数；A1第一稀释度（低稀释倍数）典型菌落的总数；A2第二稀释度（高稀释倍数）典型菌落的总数；B1第一稀释度（低稀释倍数）血浆凝固酶阳性的菌落数；B2第二稀释度（高稀释倍数）血浆凝固酶阳性的菌落数；C1第一稀释度（低稀释倍数）用于血浆凝固酶试验的菌落数；C2第二稀释度（高稀释倍数）用于血浆凝固酶试验的菌落数；1.1计算系数；d 稀释因子（第一稀释度）。六、结果与报告根据Baird-Parker平板上金黄色葡萄球菌的典型菌落数，按六中公式计算，报告每g（mL）样品中金黄色葡萄球菌数，以CFU/g(mL)表示；如T值为0，则以小于1乘以最低稀释倍数报告。附录A培养基和试剂A.1 10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤A.1.1 成分胰酪胨（或胰蛋白胨） 17.0 g植物蛋白胨（或大豆蛋白胨） 3.0 g氯化钠 100.0 g磷酸氢二钾 2.5 g丙酮酸钠 10.0 g葡萄糖 2.5 g蒸馏水 1 000 mLpH 7.30.2A.1.2 制法将上述成分混合，加热，轻轻搅拌并溶解，调节pH，分装，每瓶225 mL，121 高压灭菌15 min。A.2 7.5%氯化钠肉汤A.2.1 成分蛋白胨 10.0 g牛肉膏 5.0 g氯化钠 75 g蒸馏水 1 000 mLpH 7.4A.2.2 制法将上述成分加热溶解，调节pH，分装，每瓶225 mL，121 高压灭菌15 min。A.3 血琼脂平板A.3.1 成分豆粉琼脂（pH7.47.6） 100 mL脱纤维羊血（或兔血） 5 mL10 mLA.3.2 制法加热溶化琼脂，冷却至50 ，以无菌操作加入脱纤维羊血，摇匀，倾注平板。A.4 BairdParker琼脂平板A.4.1 成分胰蛋白胨 10.0 g牛肉膏 5.0 g酵母膏 1.0 g丙酮酸钠 10.0 g甘氨酸 12.0 g氯化锂（LiCl6H2O） 5.0 g琼脂 20.0 g蒸馏水 950 mLpH 7.00.2A.4.2 增菌剂的配法30%卵黄盐水50 mL 与经过除菌过滤的1%亚碲酸钾溶液10 mL 混合，保存于冰箱内。A.4.3 制法将各成分加到蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解，调节pH。分装每瓶95 mL，121 高压灭菌15 min。临用时加热溶化琼脂，冷至50 ，每95 mL 加入预热至50 的卵黄亚碲酸钾增菌剂5 mL 摇匀后倾注平板。培养基应是致密不透明的。使用前在冰箱储存不得超过48 h。A.5 脑心浸出液肉汤(BHI)A.5.1 成分胰蛋白质胨 10.0 g氯化钠 5.0 g磷酸氢二钠（Na2HPO412H2O） 2.5 g葡萄糖 2.0 g牛心浸出液 500 mLpH 7.40.2A.5.2 制法加热溶解，调节pH，分装16 mm160 mm 试管，每管5 mL 置121 ，15 min 灭菌。A.6 兔血浆取柠檬酸钠3.8 g，加蒸馏水100 mL,溶解后过滤，装瓶，121 高压灭菌15 min。兔血浆制备：取3.8%柠檬酸钠溶液一份，加兔全血四份，混好静置 (或以3000 r/min 离心30 min)，使血液细胞下降，即可得血浆。A.7 磷酸盐缓冲液A.7.1 成分：磷酸二氢钾（KH2PO4） 34.0 g蒸馏水 500 mLpH 7.2A.7.2 制法：贮存液：称取34.0 g的磷酸二氢钾溶于500 mL蒸馏水中，用大约175 mL的1 mol/L氢氧化钠溶液调节pH至7.2，用蒸馏水稀释至1 000 mL后贮存于冰箱。稀释液：取贮存液1.25 mL，用蒸馏水稀释至1 000 mL，分装于适宜容器中，121 高压灭菌15 min。A.8 营养琼脂小斜面A.8.1 成分蛋白胨 10.0 g牛肉膏 3.0 g氯化钠 5.0 g琼脂 15.0 g20.0 g蒸馏水 1 000 mLpH 7.27.4A.8.2 制法将除琼脂以外的各成分溶解于蒸馏水内，加入15%氢氧化钠溶液约2 mL调节pH至7.27.4。加入琼脂，加热煮沸，使琼脂溶化，分装13 mm130 mm管，121 高压灭菌15 min。A.9 革兰氏染色液A.9.1 结晶紫染色液A.9.1.1 成分结晶紫 1.0 g95乙醇 20.0 mL1草酸铵水溶液 80.0 mLA.9.1.2 制法将结晶紫完全溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。A.9.2 革兰氏碘液A.9.2.1 成分碘 1.0 g碘化钾 2.0 g蒸馏水 300 mLA.9.2.2 制法将碘与碘化钾先行混合，加入蒸馏水少许充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300 mL。A.9.3 沙黄复染液A.9.3.1 成分沙黄 0.25 g95乙醇 10.0 mL蒸馏水 90.0 mLA.9.3.2 制法将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。A.9.4 染色法a) 涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染液，染 1 min，水洗。b) 滴加革兰氏碘液，作用 1 min，水洗。c) 滴加 95乙醇脱色约15 s30 s，直至染色液被洗掉，不要过分脱色，水洗。d) 滴加复染液，复染 1 min，水洗、待干、镜检。A.10 无菌生理盐水A.10.1 成分氯化钠 8.5 g蒸馏水 1 000 mLA.10.2 制法称取8.5氯化钠溶于1 000 mL蒸馏水中，121 高压灭菌15 min。红曲黄酒的沙门氏菌检验一、实验原理沙门氏杆菌为革兰氏阴性无芽孢好气性杆菌，检验步骤中，推定试验是先在BP 及 TSA 上培养检体，依照菌落的型态与革兰氏染色观察判断疑似沙门氏杆菌；其次，进行生化试验，检测微生物产生凝固其的特性；第三为辅助试验，分别进行触 试验、溶菌 试验、厌氧下葡萄糖之利用、厌氧下甘露醇之利用、热安定型核酸分解 试验；最后，再估算沙门氏杆菌的数目。沙门氏杆菌对低渗透压的环境十分敏感，因此检体处理与使用稀释溶液时，均需运用生理食盐水，以免沙门氏杆菌死亡，无法检出。二、实验设备、材料与试剂1、设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：冰箱：2 5 。恒温培养箱：36 1 ，42 1 。振荡器。电子天平：感量0.1 g。无菌锥形瓶:容量500 mL，250 mL。无菌吸管：1 mL（具0.01 mL刻度）、10 mL（具0.1 mL刻度）或微量移液器及吸头。无菌培养皿：直径90 mm。无菌试管：3 mm50 mm、10 mm75 mm。无菌毛细管。pH计或pH比色管或精密pH试纸。全自动微生物生化鉴定系统。2、培养基和试剂 缓冲蛋白胨水（BPW）： 见附录A中A.1。四硫磺酸钠煌绿（TTB）增菌液：见附录A中A.2。亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液：见附录A中A.3。亚硫酸铋（BS）琼脂：见附录A中A.4。HE琼脂：见附录A中A.5。木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD）琼脂：见附录A中A.6。沙门氏菌属显色培养基。三糖铁（TSI）琼脂：见附录A中A.7。蛋白胨水、靛基质试剂：见附录A中A.8。尿素琼脂（pH 7.2）：见附录A中A.9。氰化钾 （KCN） 培养基：见附录A中A.10。赖氨酸脱羧酶试验培养基：见附录A中A.11。糖发酵管：见附录A中A.12。邻硝基酚-D半乳糖苷（ONPG）培养基：见附录A中A.13。半固体琼脂：见附录A中A.14。丙二酸钠培养基：见附录A中A.15。沙门氏菌O和H诊断血清。生化鉴定试剂盒。三、 实验步骤1、 检验程序2、 操作步骤（1）前增菌 称取25 g（mL）样品放入盛有225 mL BPW的无菌均质杯中，以8 000 r/min10 000 r/min均质1 min2 min，或置于盛有225 mL BPW的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1 min2 min。若样品为液态，不需要均质，振荡混匀。如需测定pH值，用1 mol/mL无菌NaOH或HCl调pH 至6.80.2。无菌操作将样品转至500 mL锥形瓶中，如使用均质袋，可直接进行培养，于36 1 培养8 h18h。（2）增菌 轻轻摇动培养过的样品混合物，移取1 mL，转种于10 mL TTB 内，于42 1 培养18 h24 h。同时，另取1 mL，转种于10 mL SC内，于36 1 培养18 h24 h。（3）分离 分别用接种环取增菌液1环，划线接种于一个BS琼脂平板和一个XLD琼脂平板（或HE琼脂平板或沙门氏菌属显色培养基平板）。于36 1 分别培养18 h24 h （XLD琼脂平板、HE琼脂平板、沙门氏菌属显色培养基平板） 或40 h48 h （BS琼脂平板），观察各个平板上生长的菌落,各个平板上的菌落特征见表1。（4）生化试验 自选择性琼脂平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落，接种三糖铁琼脂，先在斜面划线，再于底层穿刺；接种针不要灭菌,直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板，于36 1 培养18 h24 h，必要时可延长至48 h。在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内，沙门氏菌属的反应结果见表2。接种三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基的同时,可直接接种蛋白胨水 （供做靛基质试验）、尿素琼脂 （pH7.2）、氰化钾 （KCN） 培养基，也可在初步判断结果后从营养琼脂平板上挑取可疑菌落接种。于36 1 培养18 h24 h，必要时可延长至48 h，按表3判定结果。将已挑菌落的平板储存于2 5 或室温至少保留24 h，以备必要时复查。 反应序号A1：典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、KCN和赖氨酸脱羧酶3项中有1项异常，按表4可判定为沙门氏菌。 如有2项异常为非沙门氏菌。 反应序号A2：补做甘露醇和山梨醇试验，沙门氏菌靛基质阳性变体两项试验结果均为阳性，但需要结合血清学鉴定结果进行判定。 反应序号A3：补做ONPG。ONPG阴性为沙门氏菌，同时赖氨酸脱羧酶阳性,甲型副伤寒沙门氏菌为赖氨酸脱羧酶阴性。必要时按表5进行沙门氏菌生化群的鉴别。 如选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统，可根据5.4.1的初步判断结果，从营养琼脂平板上挑取可疑菌落，用生理盐水制备成浊度适当的菌悬液，使用生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统进行鉴定。（5） 血清学鉴定 1 抗原的准备 一般采用1.21.5琼脂培养物作为玻片凝集试验用的抗原。O血清不凝集时，将菌株接种在琼脂量较高的 （如23） 培养基上再检查；如果是由于Vi抗原的存在而阻止了O凝集反应时，可挑取菌苔于1 mL生理盐水中做成浓菌液，于酒精灯火焰上煮沸后再检查。H抗原发育不良时，将菌株接种在0.550.65半固体琼脂平板的中央，俟菌落蔓延生长时，在其边缘部分取菌检查；或将菌株通过装有0.30.4半固体琼脂的小玻管1次2次，自远端取菌培养后再检查。2 多价菌体抗原（O）鉴定 在玻片上划出2个约1 cm2 cm的区域，挑取1环待测菌，各放1/2环于玻片上的每一区域上部，在其中一个区域下部加1滴多价菌体（O）抗血清，在另一区域下部加入1滴生理盐水，作为对照。再用无菌的接种环或针分别将两个区域内的菌落研成乳状液。将玻片倾斜摇动混合1 min，并对着黑暗背景进行观察，任何程度的凝集现象皆为阳性反应。3 多价鞭毛抗原（H）鉴定 同2。4 血清学分型（选做项目） 1 O 抗原的鉴定 用AF多价O血清做玻片凝集试验，同时用生理盐水做对照。在生理盐水中自凝者为粗糙形菌株，不能分型。被AF多价O血清凝集者，依次用O4；O3、O10；O7；O8；O9；O2和O11因子血清做凝集试验。根据试验结果，判定O群。被O3、O10血清凝集的菌株，再用O10、O15、O34、O19单因子血清做凝集试验，判定E1、E2、E3、E4各亚群，每一个O抗原成分的最后确定均应根据O单因子血清的检查结果，没有O单因子血清的要用两个O复合因子血清进行核对。不被AF多价O血清凝集者，先用9种多价O血清检查，如有其中一种血清凝集，则用这种血清所包括的O群血清逐一检查，以确定O群。每种多价O血清所包括的O因子如下：O多价1 A，B，C，D，E，F，群 （并包括6,14群）O多价2 13，16，17，18，21群O多价3 28，30，35，38，39群O多价4 40，41，42，43群O多价5 44，45，47，48群O多价6 50，51，52，53群O多价7 55，56，57，58群O多价8 59，60，61，62群O多价9 63，65，66，67群2 H 抗原的鉴定 属于AF各O群的常见菌型，依次用表6所述H因子血清检查第1相和第2相的H抗原。不常见的菌型，先用8种多价H血清检查，如有其中一种或两种血清凝集，则再用这一种或两种血清所包括的各种H因子血清逐一检查，以第1相和第2项的H抗原。8种多价H血清所包括的H因子如下：H多价1 a，b，c，d，i H多价2 eh，enx，enz15，fg，gms，gpu，gp，gq，mt，gz51H多价3 k，r，y，z，z10，lv，lw，lz13，lz28，lz40H多价4 1,2；1,5；1,6；1,7；z6H多价5 z4z23，z4z24，z4z32，z29，z35，z36，z38H多价6 z39，z41，z42，z44H多价7 z52，z53，z54，z55H多价8 z56，z57，z60，z61，z62 每一个H抗原成分的最后确定均应根据H单因子血清的检查结果，没有H单因子血清的要用两个H复合因子血清进行核对。检出第1相H抗原而未检出第2相H抗原的或检出第2相H抗原而未检出第1相H抗原的,可在琼脂斜面上移种12代后再检查。如仍只检出一个相的H抗原，要用位相变异的方法检查其另一个相。单相菌不必做位相变异检查。位相变异试验方法如下：小玻管法： 将半固体管（每管约1 mL2 mL） 在酒精灯上溶化并冷至50 ，取已知相的H因子血清0.05 mL0.1 mL，加入于溶化的半固体内，混匀后，用毛细吸管吸取分装于供位相变异试验的小玻管内，俟凝固后，用接种针挑取待检菌，接种于一端。将小玻管平放在平皿内，并在其旁放一团湿棉花，以防琼脂中水分蒸发而干缩，每天检查结果，待另一相细菌解离后，可以从另一端挑取细菌进行检查。培养基内血清的浓度应有适当的比例，过高时细菌不能生长，过低时同一相细菌的动力不能抑制。一般按原血清1：2001：800的量加入。小倒管法：将两端开口的小玻管 （下端开口要留一个缺口，不要平齐） 放在半固体管内,小玻管的上端应高出于培养基的表面，灭菌后备用。临用时在酒精灯上加热溶化，冷至50 ，挑取因子血清1环，加入小套管中的半固体内，略加搅动，使其混匀，俟凝固后，将待检菌株接种于小套管中的半固体表层内，每天检查结果，待另一相细菌解离后，可从套管外的半固体表面取菌检查，或转种1软琼脂斜面，于37 培养后再做凝集试验。简易平板法：将0.350.4半固体琼脂平板烘干表面水分，挑取因子血清1环，滴在半固体平板表面，放置片刻，待血清吸收到琼脂内，在血清部位的中央点种待检菌株，培养后，在形成蔓延生长的菌苔边缘取菌检查。3 Vi抗原的鉴定 用Vi因