分子发光分析法1课件

分子发光分析法分子发光分析法第一节第一节 分子发光分析概述分子发光分析概述第二节第二节 荧光光谱法的基本原理荧光光谱法的基本原理第三节第三节 荧光分析仪器荧光分析仪器第四节第四节 荧光分析方法及其应用荧光分析方法及其应用第1页，共43页。第一节第一节 分子发光分析概述分子发光分析概述荧光（荧光（fluorescence）现象的第一次）现象的第一次记录：记录：1575年，西班牙内科医生和植物学家年，西班牙内科医生和植物学家N.Monardes，观察到，观察到Lignum Nephriticum木头切片的水溶液呈现天木头切片的水溶液呈现天蓝色。蓝色。第一次被提议用于分析：第一次被提议用于分析：1864年，年，Stokes第一次用于分析：第一次用于分析：1867年，年，Goppelsrder根据根据Al-桑色素配合物的荧光，建立桑色素配合物的荧光，建立了了Al 3+的荧光测定方法。的荧光测定方法。George Gabriel Stokes(1819-1903)第2页，共43页。一、分子发光一、分子发光 当分子吸收一定的能量后，从基态跃迁到较高激发态，在返回基态的过程中伴随有光辐射，这种现象称为分子发光。，以此建立的分析方法称为分子发光分析法。第3页，共43页。二、二、分子发光类型分子发光类型1.按激发的模式不同按激发的模式不同光致发光；化学发光；生物发光；光致发光；化学发光；生物发光；热致发光；电致发光；摩擦发光：热致发光；电致发光；摩擦发光：2按分子激发态类型按分子激发态类型 荧光：由第一电子激发单重态所产生的辐射跃迁而伴随的发荧光：由第一电子激发单重态所产生的辐射跃迁而伴随的发光现象。分子中全部轨道里的电子都是自旋配对的光现象。分子中全部轨道里的电子都是自旋配对的 S=0，2S+1=1,处于单重态，用处于单重态，用S0表示。表示。磷光：由最低的电子激发三重态所产生的辐射跃迁。磷光：由最低的电子激发三重态所产生的辐射跃迁。电子电子在跃迁过程中伴随着自选方向的改变在跃迁过程中伴随着自选方向的改变 S=1 2S+1=3，三重，三重 态，用态，用T表示。表示。第4页，共43页。荧光分析法特点 灵敏度高。检出限比分光光度法低24个数量级。选择性好。不同的物质用不同的光进行激发，选择不同的不同的物质用不同的光进行激发，选择不同的激发光波长；不同的物质发射的荧光不同，选择不同的检激发光波长；不同的物质发射的荧光不同，选择不同的检测荧光波长。比较容易排除其它物质的干扰，选择性好。测荧光波长。比较容易排除其它物质的干扰，选择性好。实验方法简单；实验方法简单；待测样品用量少；仪器价格适中；测定范围较广待测样品用量少；仪器价格适中；测定范围较广 其发光强度可定量测定许多痕量的无机物和有机物，广泛应用其发光强度可定量测定许多痕量的无机物和有机物，广泛应用在生物化学、分子生物学、免疫学及农牧产品分析、卫生检疫在生物化学、分子生物学、免疫学及农牧产品分析、卫生检疫等领域。等领域。荧光法比磷光法应用广泛，不如分光光度法荧光法比磷光法应用广泛，不如分光光度法第5页，共43页。第二节第二节 荧光光谱法的基本原理荧光光谱法的基本原理一、荧光（磷光）光谱的产生一、荧光（磷光）光谱的产生1、电子自旋的多重性、电子自旋的多重性 分子中的所有价电子自旋都是配对的，称为单分子中的所有价电子自旋都是配对的，称为单重态，用重态，用“S”表示；表示；分子中电子对自旋平行的电子态，称为三重分子中电子对自旋平行的电子态，称为三重态，用态，用“T”表示。表示。第6页，共43页。2 2、电子激发态的多重度、电子激发态的多重度 电子激发态的多重度：M=2S+1 S为电子自旋量子数的代数和(0或1)；若分子中全部电子都是自旋配对的，S=0，2S+1=1，单重态S；若电子在跃迁过程中伴随自旋方向的改变，S=1，2S+1=3，激发三重态T。符号S0、S1、S2分别表示基态单重态，第一和第二电子激发单重态；T1和T2分别表示第一和第二电子激发三重态。平行自旋比成对自旋稳定(洪特规则)，三重态能级比相应单重态能级低；大多数有机分子的基态处于单重态。第7页，共43页。3、激发态、激发态基态的能量传递途径基态的能量传递途径 电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，电子处于激发态是不稳定状态，返回基态时，通过辐射跃迁通过辐射跃迁(发光发光)和无辐射跃迁等方式失去能量；和无辐射跃迁等方式失去能量；传递途径传递途径辐射跃迁辐射跃迁荧光荧光延迟荧光延迟荧光磷光磷光内转移内转移外转移外转移系间跨越系间跨越振动弛豫振动弛豫 无辐射跃迁无辐射跃迁第8页，共43页。S2S1S0T1吸吸收收发发射射荧荧光光发发射射磷磷光光系间跨越系间跨越内转换内转换振动弛豫振动弛豫能能量量l l 2l l 1l l 3 外转换外转换l l 2T2内转换内转换振动弛豫振动弛豫第9页，共43页。辐射跃迁能量传递过程辐射跃迁能量传递过程 荧光荧光：10-710-9 s,第一激发单重态的最低第一激发单重态的最低振动能级振动能级基态；发射荧光的能量比分子基态；发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长较长吸收的能量小，波长较长l l 2 l l 2 l l 1；S1 S0+hv 磷光磷光：10-410s；第一激发三重态的最低第一激发三重态的最低振动能级振动能级基态；基态；T1 S0+hv S0 激发激发振动弛豫振动弛豫内转移内转移系间跨越系间跨越振动弛豫振动弛豫 T1 延迟荧光延迟荧光：T1S1，由，由S1发出的荧光。发出的荧光。第10页，共43页。无辐射跃迁能量传递过程无辐射跃迁能量传递过程 振动弛豫：振动弛豫：同一电子能级同一电子能级内以热能量交换形式由高振动能级至低内以热能量交换形式由高振动能级至低相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间相邻振动能级间的跃迁。发生振动弛豫的时间10-12 s。内转换：内转换：对于具有相同多重度的分子，若较高电子能级的低振动能层与较低电子能级的高振动能层相重叠时，则电子可在重叠的能层之间通过振动耦合产生无辐射跃迁，如S2-S1；T2-T1。外转换：外转换：激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转激发分子与溶剂或其他分子之间产生相互作用而转移能量的非辐射跃迁；外转换使荧光或磷光减弱或移能量的非辐射跃迁；外转换使荧光或磷光减弱或“猝灭猝灭”。第11页，共43页。系间跨越系间跨越发生在两个不同多重态之间的无辐射跃迁，如从S1到T1，该跃迁是禁阻的。但当不同多重态的两个电子能层有较大重叠时，处于这两个能层上的受激电子的自旋方向发生变化，即可通过自旋-轨道耦合而产生无辐射跃迁S1 T1第12页，共43页。二、激发光谱曲线和荧光光谱曲线二、激发光谱曲线和荧光光谱曲线1 1、荧光、荧光(磷光磷光)的激发光谱曲线与发射光谱曲线的激发光谱曲线与发射光谱曲线200260320380440500560620荧荧 光光 激激 发发 光光 谱谱荧荧 光光 发发 射射 光光 谱谱磷磷 光光 光光 谱谱室室 温温 下下 菲菲 的的 乙乙 醇醇 溶溶 液液 荧荧（磷磷）光光 光光 谱谱第13页，共43页。2、激发光谱与发射光谱的关系激发光谱与发射光谱的关系 Stokes位移：位移：激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光激发光谱与发射光谱之间的波长差值。发射光谱的波长比激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。谱的波长比激发光谱的长，振动弛豫消耗了能量。发射光谱的形状与激发波长无关：发射光谱的形状与激发波长无关：电子跃迁到不同激发态能电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量，产生不同吸收带，但均回到第一激级，吸收不同波长的能量，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光。光。镜像规则：镜像规则：通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）成镜像对称关系。光谱形状一样）成镜像对称关系。第14页，共43页。镜像规则的解释镜像规则的解释 基态上的各振动能级分布与第一激发态上的各振动能级分布类似；基态上的零振动能级与第一激发态的二振动能级之间的跃迁几率最大，相反跃迁亦然。第15页，共43页。第16页，共43页。三、影响荧光的因素三、影响荧光的因素1、分子产生荧光必须具备的条件、分子产生荧光必须具备的条件（1）具有合适的结构；）具有合适的结构；（2）具有一定的荧光量子产率。）具有一定的荧光量子产率。荧光量子产率（荧光量子产率（）：）：吸收的光量子数发射的光量子数激发分子总数发射荧光的分子数第17页，共43页。荧光量子产率与激发态能量释放各过程荧光量子产率与激发态能量释放各过程的速率常数有关，凡是能使荧光速率常数升的速率常数有关，凡是能使荧光速率常数升高而使其它过程速率常数降低的过程，均能高而使其它过程速率常数降低的过程，均能提高量子产率。提高量子产率。iffkkk=kf：荧光发射过程的速率常数，取决于化学结构。：荧光发射过程的速率常数，取决于化学结构。ki：其他有关过程（内转移、系间窜跃、外转移）：其他有关过程（内转移、系间窜跃、外转移）的速率常的速率常数的总和。由化学环境和结构共同决定。数的总和。由化学环境和结构共同决定。第18页，共43页。2、化合物的结构与荧光（1）跃迁类型：）跃迁类型：*的荧光效率高，系间跨越过程的速率的荧光效率高，系间跨越过程的速率常数小，有利于荧光的产生；常数小，有利于荧光的产生；（2）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移；）共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移；（3）刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的）刚性平面结构：可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故具有很相互作用，故具有很强的荧光。如荧光素强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，和酚酞有相似结构，荧光素有很强的荧光，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有。酚酞却没有。第19页，共43页。（4）取代基的类型和位置）取代基的类型和位置 加强荧光的取代基：加强荧光的取代基：供电子基。供电子基。-OH、-OR、-NH2、-CN、-NHR、-NR2、-OCH3等。等。减弱荧光的取代基：减弱荧光的取代基：得电子取代基。如得电子取代基。如-CO、-COOH、COOR、COR、NO2、NO、SH等。等。影响不明显取代基：影响不明显取代基：NH3、R、SO3H等等 重原子效应：重原子效应：芳烃上取代芳烃上取代F、Cl、Br、I原子之后，系间原子之后，系间窜跃加强，随原子量增加，磷光加强，称为重原子效应。窜跃加强，随原子量增加，磷光加强，称为重原子效应。第20页，共43页。取代基位置：取代基位置：一般邻、对位取代一般邻、对位取代，间位取，间位取代代。随共轭体系增大，影响减小。随共轭体系增大，影响减小。电子跃迁类型：电子跃迁类型：含有含有n电子的电子的N、O、S等杂原等杂原子有机物易发生子有机物易发生n跃迁（例如喹啉、芳酮跃迁（例如喹啉、芳酮类）。系间窜跃强烈，荧光很弱或不发荧光。类）。系间窜跃强烈，荧光很弱或不发荧光。不含杂原子的有机荧光体系多发生不含杂原子的有机荧光体系多发生跃迁，跃迁，电子自旋允许，电子自旋允许，。第21页，共43页。（5 5）金属螯和物的荧光）金属螯和物的荧光 除过渡元素的顺磁性原子发生线状荧光，一般无机盐除过渡元素的顺磁性原子发生线状荧光，一般无机盐类金属离子在溶液中只能发生无辐射跃迁，有些金属类金属离子在溶液中只能发生无辐射跃迁，有些金属螯和物能产生很强的荧光。螯和物能产生很强的荧光。螯和物中配位体的发光螯和物中配位体的发光：通过形成金属螯合物使原来：通过形成金属螯合物使原来不发荧光的有机配合物的刚性结构增强，平面结构增不发荧光的有机配合物的刚性结构增强，平面结构增大，发射荧光。大，发射荧光。螯合物中金属离子的特征荧光：螯合物中金属离子的特征荧光：首先通过配位体的首先通过配位体的跃迁而被激发，接着配位体把能量转移给金属离子，跃迁而被激发，接着配位体把能量转移给金属离子，导致导致dd跃迁或跃迁或ff*跃迁，最终发射的是跃迁，最终发射的是dd*或或ff*跃迁光谱。跃迁光谱。第22页，共43页。金属发光金属发光 N NOH HON NOOAl3+配体发光荧光弱荧光强Mn(II)d*dNSO3HOH第23页，共43页。3、溶剂的影响、溶剂的影响 同一种荧光体在不同的溶剂中其荧光光谱的位置和同一种荧光体在不同的溶剂中其荧光光谱的位置和强度都可能有显著的差别。强度都可能有显著的差别。一般增大溶剂的极性将使一般增大溶剂的极性将使*跃迁的能量降低，从跃迁的能量降低，从而导致荧光增强。而导致荧光增强。含重原子的溶剂（碘乙烷、四溴化碳），含重原子的溶剂（碘乙烷、四溴化碳），f降低。降低。第24页，共43页。4、温度的影响 低温下测定，提高灵敏度。因为辐射跃迁的速率基本不随温度变，而非辐射跃迁随温度升高显著增大。大多数荧光物质都随溶液温度升高荧光效率下降，荧光强度减弱。因为内、外转换增加、粘度因为内、外转换增加、粘度 或或“刚性刚性”降低降低 如荧光素的乙醇溶液在0以下每降低10，荧光效率增加3%，冷至-80时，荧光效率为100%。第25页，共43页。5、pH值的影响 具酸或碱性基团的有机物质，在不同具酸或碱性基团的有机物质，在不同pHpH值时，其结构值时，其结构可能发生变化，因而荧光强度将发生改变可能发生变化，因而荧光强度将发生改变 对无机荧光物质，对无机荧光物质，因因pHpH值会影响其稳定性，因而也可使其荧值会影响其稳定性，因而也可使其荧光强度发生改变。光强度发生改变。OHO_OHH+_例：例：苯酚苯酚离子化后，离子化后，荧光消失荧光消失pH1有有荧光荧光pH13无荧光无荧光第26页，共43页。但两个苯环相连的化合物，又表现出相反的性质，但两个苯环相连的化合物，又表现出相反的性质，分子形式无荧光，离子化后显荧光。分子形式无荧光，离子化后显荧光。例：例：苯酚苯酚有荧光有荧光无荧光无荧光OHO_表面活性剂也会影响荧光强度和特性。第27页，共43页。6 6、荧光熄灭、荧光熄灭 广义：广义：任何可使某种荧光物质的荧光强度下降的作用或任任何可使某种荧光物质的荧光强度下降的作用或任何可使荧光量子产率降低的作用。何可使荧光量子产率降低的作用。狭义狭义：指荧光物质分子与溶剂分子或其它溶质分子的相互作用：指荧光物质分子与溶剂分子或其它溶质分子的相互作用引起的荧光强度降低的现象称为荧光熄灭。引起的荧光强度降低的现象称为荧光熄灭。熄灭剂：这些引起荧光强度降低的物质称为熄灭剂。熄灭剂：这些引起荧光强度降低的物质称为熄灭剂。第28页，共43页。导致荧光熄灭作用的几种主要类型 碰撞熄灭：是荧光熄灭的主要原因。在粘度大的溶剂中，熄灭作用较小；温度升高，熄灭作用增加。能量转移：熄灭剂与处于激发单重态的分子作用后，使熄灭剂激发。电荷转移：熄灭剂与处于激发态的分子发生电荷转移。转入三重态熄灭：含有减弱荧光的电子取代基物质如羧酸、羰基、硝基和重原子效应容易发生系间串跃，使荧光猝灭。第29页，共43页。光化学反应熄灭：光化学反应熄灭：由光致激发态分子所发生由光致激发态分子所发生的化学反应。影响较大的是光解反应和光氧的化学反应。影响较大的是光解反应和光氧化反应。化反应。自熄灭和自吸收自熄灭和自吸收l自熄灭：荧光物质浓度较大时，由于激发态自熄灭：荧光物质浓度较大时，由于激发态分子之间的碰撞引起的能量损失。分子之间的碰撞引起的能量损失。l自吸收：当荧光物质的荧光光谱曲线与吸收自吸收：当荧光物质的荧光光谱曲线与吸收光谱曲线重叠时，荧光被处于基态的分子吸光谱曲线重叠时，荧光被处于基态的分子吸收，称为自吸收。收，称为自吸收。第30页，共43页。四、定量分析基本原理四、定量分析基本原理 假如以每秒钟每平方厘米的光强度为假如以每秒钟每平方厘米的光强度为I0的入射光，照的入射光，照射到一个盛有荧光物质溶液的液池，透过光强度射到一个盛有荧光物质溶液的液池，透过光强度It，荧光强度为荧光强度为If 和吸光强度和吸光强度Ia及荧光效率及荧光效率F成正比：成正比：fFaII2f0I2.31(2.3)/2!(2.3)/3!FkIcbcbcbk：与仪器有关的常数；I0：激发光的强度；F：荧光量子产率：激发波长处的摩尔吸光系数；b：光程长度。第31页，共43页。f0I=2.3I kbc =kc适用于稀溶液，微量或痕量组分的测定 当cl项很小时，括号内第二项及以后的高次项均可忽略不计，Parker方程可简化为：对于较浓溶液，由于猝灭现象和自吸收等原因，使对于较浓溶液，由于猝灭现象和自吸收等原因，使荧光强度和浓度不呈线性关系。荧光强度和浓度不呈线性关系。第32页，共43页。五、定性分析依据不同结构不同结构的物质所发射的荧光波长不发射的荧光波长不同可鉴别物质。同可鉴别物质。常用常用比较法比较法激发光谱与发射光谱一起鉴定物质可提高激发光谱与发射光谱一起鉴定物质可提高定性结果的可信度定性结果的可信度第33页，共43页。第三节第三节 荧光分析仪器荧光分析仪器19世纪前 肉眼观察 1928年 Jette，West发明光电比色计1939年 应用光电倍增管（PMT）1952年 商品化校正光谱仪器 1980年后 计算机化 第34页，共43页。与分光光度计有两点不同与分光光度计有两点不同两个单色器两个单色器检测器与激发光互成直角检测器与激发光互成直角第35页，共43页。1、光源 激发光源一般要求比吸收测量中的光源有激发光源一般要求比吸收测量中的光源有更大的发射强度；适用波长范围宽更大的发射强度；适用波长范围宽 荧光计中，常使用卤钨灯作光源荧光计中，常使用卤钨灯作光源 荧光光度计中常用高压汞灯和氙弧灯荧光光度计中常用高压汞灯和氙弧灯应用最广泛的一种光应用最广泛的一种光源，可发射源，可发射250800nm很强的连续光源很强的连续光源第36页，共43页。2 2、单色器、单色器 荧光计用滤光片作单色器，荧光计只能用于定量分析，荧光计用滤光片作单色器，荧光计只能用于定量分析，不能获得光谱不能获得光谱 大多数荧光光度计一般采用两个光栅单色器，有较高的分辨率，大多数荧光光度计一般采用两个光栅单色器，有较高的分辨率，能扫描图谱，既可获得激发光谱，又可获得荧光光谱能扫描图谱，既可获得激发光谱，又可获得荧光光谱 第一单色器作用：第一单色器作用：分离出所需要的激发光，选择最佳激发波分离出所需要的激发光，选择最佳激发波长长l l ex，用此激发光激发液池内的荧光物质，用此激发光激发液池内的荧光物质 l l ex 第二单色器作用：第二单色器作用：滤掉一些杂散光和杂质所发射的干扰光，滤掉一些杂散光和杂质所发射的干扰光，用来选择测定用的荧光波长用来选择测定用的荧光波长l l em。在选定的在选定的l l em 下测定荧光强下测定荧光强度，定量分析度，定量分析第37页，共43页。3、样品池：盛放测定溶液，通常是石英材料的方形池，四面都透光，只能用手拿棱或最上边4、检测器 把光信号转化成电信号，放大，直接转成荧光强度 荧光的强度一般较弱，要求检测器有较高的灵敏度，荧光光度计采用光电倍增管 荧光分析比吸收光度法具有高得多的灵敏度，是因为荧光强度与激发光强度成正比，提高激发光强度可大大提高荧光强度5、读出装置：记录仪记录或打印机打印出结果，扫描激发光谱和发射光谱第38页，共43页。第四节第四节 荧光分析方法及其应用荧光分析方法及其应用一、荧光定量分析方法一、荧光定量分析方法1、工作曲线法、工作曲线法2、比较法：若有试剂空白需扣除、比较法：若有试剂空白需扣除 3.荧光猝灭法荧光猝灭法 荧光猝灭剂的浓度荧光猝灭剂的浓度CQ与荧光强度的关系可用与荧光强度的关系可用SternVolmer方程表示：方程表示：F0/F=1+KCQ F0与与F分别为猝灭剂加入前与加入后试液的荧光强度。分别为猝灭剂加入前与加入后试液的荧光强度。F0/F对对CQ作图得一直线。作图得一直线。00 xxssFFccFF第39页，共43页。4 4、多组分混合物的荧光分析、多组分混合物的荧光分析 若荧光峰相互不干扰若荧光峰相互不干扰，可分别在不同波长处测定。，可分别在不同波长处测定。如果荧光峰互相干扰如果荧光峰互相干扰，但激发光谱有显著差别，其中一个组，但激发光谱有显著差别，其中一个组分在某一激发波长下不吸收，不会产生荧光，可通过选择激发分在某一激发波长下不吸收，不会产生荧光，可通过选择激发光进行测定。光进行测定。如：如：8-羟基喹啉与羟基喹啉与Al 3+、Ga3+的配和物的氯仿萃取溶液，荧的配和物的氯仿萃取溶液，荧光峰均在光峰均在520nm,激发峰分别为激发峰分别为365、435.8nm。若同一激发波长下，荧光波长互相干扰若同一激发波长下，荧光波长互相干扰，可利用荧光强度，可利用荧光强度的加和性，在适宜的荧光波长处测定，解联立方程。的加和性，在适宜的荧光波长处测定，解联立方程。第40页，共43页。二、荧光分析法的应用二、荧光分析法的应用(1)(1)无机化合物的分析无机化合物的分析 与有机试剂配合物后测量；可测量约与有机试剂配合物后测量；可测量约60多种元素。多种元素。铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法；铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法；氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定；氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定；铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定；铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定；铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定；铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定；铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定(2)生物与有机化合物的分析：生物与有机化合物的分析：见表见表 第41页，共43页。第42页，共43页。第43页，共43页。