《茎尖分生组织培养》PPT课件.ppt

4 茎尖分生组织培养,一、概念和意义 1.概念 茎尖分生组织培养：指对不超过0.1mm的茎尖或几十微米的茎尖进行的培养。 特点：可获无病毒苗，操作困难，成苗时间长。 普通茎尖培养：对几毫米至几十毫米长的茎尖、芽尖及侧芽的培养。操作技术简单、易成活、成苗时间短、繁殖速度快。,2.意义 茎尖培养在园艺植物离体培养中最常见，可快速繁殖无性系、培养无病毒苗、品种改良。 二、茎尖分生组织培养一般方法 1.材料的制备 健壮枝梢 去除叶片 分成1-2cm 自来水冲洗 消毒 75%的酒精30秒 0.1%升汞或20倍次氯酸钠消毒8-10min 无菌水 修剪剥离茎尖，通常切割下顶端0.20.5 mm叶原基的茎尖（无菌水） 接种。,2.培养基 多为MS培养基及其改良配方，还有White、B5、Heller、Gautheret等。 3.培养条件 （1）温度：2628 （2）光照：光培养的效果通常比暗培养好。 （3）湿度：与其他器官培养相似。,4.3 脱毒苗的培育和病毒检测,一、脱毒苗的培育 （一）脱毒苗培育的意义 全世界已发现植物病毒有近700种，植物病毒病严重地影响果树、蔬菜、花卉、林木等植物的生长，造成产量降低，品质变劣，其危害仅次于真菌病害。受病毒浸染的植物终身带毒，目前尚无药物可以治愈。通过茎尖分生组织脱毒、热处理脱毒等方法可脱除植物体内病毒，恢复植物原有特性。,（二）热处理脱毒 1.原理 热处理脱毒又叫热温处理或热疗法。其基本原理是一些病毒对热不稳定，在高于常温的温度下（35-40度）既钝化失活。 2.热处理法有：温汤处理（热水浸泡）和热风处理两种。,具体方法： 第一，热水浸泡处理，适用于切下的材料，在50度左右的温水中浸渍数分钟至数小时，方法简便易行但材料易受伤。 第二，热风处理，将生长的盆栽植物移入室内或生长箱内，处理温度因植物种类、生理状况而异。一般为3540度，短则几十分钟，长达数月。,（三）茎尖培养脱毒 1.茎尖培养脱毒的原理 （1）病毒在植物体内的分布 病毒浓度不同，离尖端越远病毒浓度越高。茎尖或根尖离体培养便可获得无病毒再生植株。 必须指出的是，所谓无病毒，只是相对的，不是绝对的。 （2）茎尖大小与脱毒 茎尖外植体的大小与脱毒效果成反比。茎尖分生组织不能合成自身需要，生长素，细胞分裂素，因而带叶原基的茎尖生长快，成苗率高。因此茎尖越大培养成活率越高。因此对不同植物脱毒适宜的茎尖大小不同。,2.茎尖培养脱毒的方法 （1）取样与消毒 可直接选定的植株上取顶芽进行消毒接种。采顶芽与侧芽消毒接种。 消毒方法是：剪取顶芽梢段3、5厘米，剥去大叶片，用自来水冲洗干净，在75%酒精中浸泡30秒左右，用1%-3次氯酸钠或5%-7%的漂白粉溶液消毒10-20分，最后用无菌水冲洗材料4-5次。,（2）接种 材料置1040倍的双筒解剖镜下，解剖刀切取0.10.3mm带有12个叶原基的茎尖，接种到培养基上。,（3）培养 接种后材料置25+2 ，光照度1500-5000LX，每日光照10-16h条件下培养。但一般光照培养比暗培养效果好。其间应更换新鲜培养基。提高培养基中BA的浓度可形成大量从生芽。 3.培养基与培养方式 ： （1）培养基：常用MS， White等培养基。 （2）培养方式：茎尖培养一般采用半固体培养基,（四）、其他脱毒方法 1.热处理结合茎尖培养脱毒 2.微体嫁接脱毒 微尖嫁接技术（micrografting shoot-tip），指在人工培养基上培养实生砧木，嫁接无病毒茎尖（0.14-1.0mm,带3-4个叶愿基）以培养脱毒苗的技术。 主要脱毒程序是：无菌砧木培养 茎尖准备 嫁接 嫁接苗培养 移植。 3.抗病毒药剂脱毒,二、病毒检测 主要是对脱毒苗的鉴定。方法有 1.直接测定法：直接观察待侧植株生长状态是否异常，茎叶上有无特定病毒引起的可见症状，从而可判断病毒是否存在。 2.指示植物法： 将一些对病毒反映敏感，症状特征显著的植物作为指示植物（鉴定别寄生），用以检验待测植物体内特定病毒的存在。即指示植物法。常用鉴定指示植物有苋科植物千日红和藜属笕色藜。 特点：条件简单，操作方便，故一直沿用至今，仍为一种经济而有效的鉴定方法，只能测出病毒的相对感染力。,3.抗血清鉴定法 植物病毒是由核酸和蛋白质组成的核蛋白复合体，因而也是一种抗原，注射到动物体内即产生抗体，抗体存在于血清之中，称为抗血清。由于不同病毒产生的抗血清都有特异性，用特定病毒的抗血清来鉴定该种病毒，具有高度的专一性和特异性，几分钟至几小时即可完成，方便简易，为常用方法之一。,三、无病毒苗的保存和繁殖,（一）无病毒苗的保存 无病毒植株并不是有额外的抗病性，它们有可能很快又被重新感染。所以一旦培育得到无病毒苗，就应很好保存，这些原原种或原种材料保管得好可以保存利用510年。 1.隔离保存,通常无病毒苗应种植在隔虫网内，使用300目，即网眼为0.40.5mm大小的网纱，也可用盆栽钵，可以防止蚜虫、叶蝉、土壤线虫进入。栽培用的土壤也应进行消毒，周围环境也要整洁，并及时喷施农药防治虫害，以保证植物材料在与病毒严密隔离的条件下栽培。有条件的地方可以到海岛或高冷山地种植保存，那里气候凉爽，虫害少，有利于无病毒材料的生长，繁殖。另一种更便宜的方法，是把由茎尖得到的并已经过脱毒检验的植物通过离体培养进行繁殖和保存。,植物离体快速繁殖,植物离体快速繁殖又称微体快繁（微繁）：是指利用植物组织培养技术进行的一种营养繁殖方法；是在无菌条件下，把离体的植物器官、组织，放在人工控制的环境中，使其分化、繁殖，在短时间内产生大量遗传性一致的完整新植株的技术。,植物离体快速繁殖的优点： 1.繁殖系数高，繁殖周期短，繁殖速度快 2.应用广泛，是推广良种的重要手段 3.繁殖材料用量少，不受季节限制，可实现工厂化生产 4.能获得无菌苗木无性系 5.木本植物应用潜力大,植物离体快速繁殖的基本程序： 1.稳定无菌培养体系的建立时期 是指从外植体选择、采取、清洗、灭菌、接种和茎芽发生，一直到获得茎芽稳定生长和增殖，茎芽扩繁数量可以随意控制的整个时期。 本时期主要包括外植体选择、外植体灭菌、培养基选定和稳定化培养等环节。,2.稳定培养系的增殖、生长和增壮时期 是指使已经达到稳定状态的培养物，通过不断的继代培养进行增殖，从而达到所要求的数量；培养增殖后的培养物生长和壮大到生根所需要的大小和壮实程度的时期，是商品化组织培养的主要时期。 此阶段是整个商品化培养过程的关键。快繁的目的就是在最短的时间内生产最多的优质苗木。,3.诱导茎芽生根形成小苗时期 本时期是使上一期培养出的微枝发出不定根，形成完整的小苗，以便经过驯化，培养成商品苗。 4.生根小苗移栽和驯化时期 这个阶段是将已生根的完整植株从培养室移植到室外土壤中，使小苗继续长大。 即是所说的试管苗驯化。,试管苗驯化,试管苗驯化过程也叫炼苗，这是组织培养技术应用于生产实践面临的一个重大问题。要使试管苗移栽成功要做好以下工作： 1.培育壮苗（内因） 2.选择合适的移栽介质 3.注意移栽方式 4.加强载后的环境调控,