血红蛋白的提取和分离.ppt

2003年4月14日宣布人类基因组序列图完成，这标志着进入了后基因组时代。,人类基因组：指DNA分子所携带的全部遗传信息。,蛋白质组：生物个体表达的蛋白质分子的总和。主要是对蛋白质功能的研究,本课题学习目标,简述蛋白质提取和分离的基本原理，并了解凝胶色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理。 1、主要概念：凝胶色谱法 电泳法 缓冲溶液 它们在血红蛋白的提取中分别起到什么作用。 2.主要原理：凝胶色谱法分离蛋白质的原理 电泳法分离样品的原理 缓冲溶液的组成和作用机理 3、课题重点：凝胶色谱法的原理和方法 4、课题难点：样品的预处理 色谱柱填料的处理和色谱柱的装填。,知识回顾-有关蛋白质的几个问题：,1、含量 2、组成元素 3、相对分子质量 4、基本组成单位： 结构简式： 种类： 5、氨基酸连接方式,占细胞干重的50以上，细胞中含量最多的有机物,C、H、O、N,高分子化合物,氨基酸,脱水缩合,知识回顾-有关蛋白质的几个问题：,6、肽键 7、分子结构 8、蛋白质多样性的原因：(多样性的根本原因) 9 、蛋白质的鉴定方法,氨基酸的种类不同；数目成百上千；排列顺序变化多端；多肽链的空间结构千差万别,具有催化作用，如参加生物体各种生命活动的酶;,有些蛋白质具有运输载体的功能;（血红蛋白）,有些蛋白质其信息传递作用，能够调节机体的生命活动，如胰岛素、生长激素等;,有些蛋白质有免疫功能。（抗体）,可以说，一切生命活动都离不开蛋白质， 蛋白质是生命活动的主要承担者、体现者。,10、生理功能,是结构物质，是构成细胞和生物体的重要物质。如：羽毛、肌肉、头发、等;,相关计算总结： 假设氨基酸的平均相对分子质量为a，由n个氨基酸分别形成1条肽链或m条肽链。 (1)氨基数肽链数R基上的氨基数 各氨基酸中氨基总数肽键数 (2)羧基数肽链数R基上的羧基数 各氨基酸中羧基总数肽键数,1.分离生物大分子的基本思路：,选用一定的物理或化学的方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。,2.蛋白质分离和提取的原理：,根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大小、所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不同种类的蛋白质。,基础知识,基础知识（一） 凝胶色谱法（分配色谱法）,2.凝胶：,大多数凝胶是由多糖类化合物（如葡聚糖或 琼脂糖）构成的多孔小球体，内部有许多贯穿的通道。,根据被分离的蛋白质相对分子质量的大小，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，来进行分离。,1.概念：,3.凝胶色谱法的原理,当相对分子量不同的蛋白质通过凝胶时，相对分子量较小的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢;而相对分子量较大的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短，移动速度较快。相对分子质量不同的蛋白质分子因此得以分离。依据的特性是：蛋白质分子量的大小。,4.凝胶色谱法分离蛋白质的原理和具体过程,凝胶色谱法分离蛋白质过程的动画演示,原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，相对（ ）的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程（ ），移动速度（ ），而（ ）的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在（ ）移动，路程（ ），移动速度（ ），相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。,相对分子质量较小,较长,较慢,相对分子质量较大,凝胶外部,较短,较快,（二）缓冲溶液,1.概念:,在一定的范围内，凡是能够抵制外加少量强 酸或强碱的影响使原来溶液PH值基本保持不变的混 合溶液。,能够抵制外界的酸和碱对溶液PH值的影响， 维持PH基本不变。,2.作用:,3.缓冲溶液的配制:,通常由12 种缓冲剂溶解于水 中配制而成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同PH范围内使用的缓冲液。,4.提问：在本课题中使用的缓冲液是:_ , 其目的是:,利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证 血红蛋白的正常结构和功能，便于观察(红色)和科 学研究(活性),磷酸缓冲液,弱酸和弱酸盐组合,H2CO3/NaHCO3,CH3COOH/CH3COONa,5、缓冲溶液的组分分类,弱碱和弱碱盐,多元弱酸的酸式盐和其他所对应的次级盐,NH4OH /NH4CI,NaH2PO4 /Na2HPO4,KH2PO4 /K2HPO4,生物体内进行的各种生物化学反应都是在一定的pH下进行的，为了能够在实验室条件下准确模拟生物体内的过程，就必须保持体外的pH与体内的基本一致。因此，缓冲溶液的正确配制和pH的准确测定，在生物化学的研究工作中有着极其重要的意义。,在生物化学的研究工作，为什么要正确配制缓冲溶液和准确测定缓冲溶液的pH？,？,（三） 电泳：,1.概念：,带电粒子在电场作用下发生迁移的过程。,2.原理：,许多重要的生物大分子，如多肽、 核酸等都具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团会带上正电或负电。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动。电泳利用了待分离样品中各种分子带电性质的差异以及分子本身的大小，形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。,3.类型:,琼脂糖凝胶电泳、聚丙稀酰胺凝胶电泳。,在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带电荷相反的电极移动,琼脂糖凝胶电泳示意图,原理：许多重要的生物大分子，如（ ）等都具有( ) 在( )下，这些基团会带上（ ） 。在电场的作用下，这些带电分子会向着与其（ ）移动。电泳利用了待分离样品中各种分子（ ）以及分子本身（ ）、（ ）的不同使带电分子产生不同的（ ），从而实现样品中各种分子的分离。,多肽、核酸,可解离的基团,正电或负电,所带电荷相反的电极,带电性质的差异,大小,形状,迁移速度,一定的PH,实例：聚丙稀酰胺凝胶电泳,1、在测定蛋白质分子量时常用十二烷基硫酸钠（SDS）聚丙稀酰胺凝胶电泳。聚丙稀酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺在引发剂和催化剂的作用下聚合交联成的具有三维网状结构的凝胶。,蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决 于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。 为了消除净电荷对迁移率的影响，可以在凝胶中加入 SDS。,2.原理：,聚丙稀酰胺凝胶电泳,SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是单条肽链的分子量。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小。,3. SDS作用机理:,用SDS测定蛋白质分子量的方法,使用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量时，可选用一组已知分子量的标准蛋白同时进行电泳，根据已知分子量的标准蛋白的电泳区带位置，用电泳迁移率和分子量的对数作标准曲线，可以测定未知蛋白质的分子量。市场上有高分子量、次高分子量及低分子量的标准蛋白试剂出售。,电泳检测PCR结果,影响蛋白质分子运动速度的因素,为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加入( )。SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是( )。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电泳迁移率完全取决于( )。,蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它（ ）等因素。,SDS,单条肽链的分子量,分子的大小,所带静电荷的多少以及分子的大小,阅读课本相关内容，思考以下问题： 1、蛋白质的提取和分离一般分成几步？ 2、样品怎样处理？ 3、蛋白质怎样分离？,1. 用鸡的红细胞提取DNA，用哺乳动物的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？,鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取；人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富，便于提取血红蛋白。,血液,血 浆,水分,其他物质：,血浆蛋白,无机盐 磷脂 葡萄糖等,血细胞,白细胞,血小板,红细胞 （最多）,血红蛋白 （90）,2个a肽链,2个一肽链,4个亚铁红素基团,血液有哪些成分？,每个肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳，血红蛋白因含有血红素而呈红色。,血红蛋白的特点：,二、实验操作,样品处理粗分离纯化纯度鉴定,1.样品处理：,（一）蛋白质提取和分离步骤,（二）操作过程,本课题可选用猪、牛、羊或其他脊椎 动物的血液来分离血红蛋白。,(1)红细胞的洗涤:,洗涤目的:,去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的 分离纯化，洗涤次数不可过少。,1、采集血样。 2、低速短时间离心（速度越高和时间越长，会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀，达不到分离的效果） 3、吸取血浆：上层透明的黄色血浆。 4、盐水洗涤：用五倍体积的质量分数为0.9的氯化钠溶液洗涤。 5、低速离心（低速短时间） 6、重复4、5步骤三次，直至上清液中已没有黄色，表明洗涤干净。,洗涤操作：,3次洗涤后的结果,初次离心后的结果,问： 1、洗涤操作过程中，为什么要低速短时间离心？ 2、为了使红细胞洗涤干净，需如何处理？ 3、用质量分数为0.9的氯化钠溶液洗涤， 能否用蒸馏水或浓度高的氯化钠溶液？为什么？,(2)血红蛋白的释放：,加蒸馏水到原血液体积，再加40体积的甲苯 ，置于磁力搅拌器上充分搅拌10分钟（加速细胞破裂）,细胞破裂释放出血红蛋白。,(3)分离血红蛋白溶液：,过程：将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度离心10 min。,二、实验操作,说出：蒸馏水和甲苯的作用。,试管中溶液层次： 第1层（最上层）：甲苯层（无色透明）； 第2层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（白色薄层固体）； 第3层（中下层）：血红蛋白的水溶液层（红色透明液体）； 第4层（最下层）：杂质沉淀层（暗红色）。 分离：用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。,(4)透析：,过程：取1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/l的磷酸缓冲液中（pH为7.0），透析12小时。 透析目的：除去样品中分子量较小的杂质。,二、实验操作,原理：透析袋能使小分子自由进出，而大分子保留在袋内。,透析过程动画演示,利用透析袋透析,凝胶色谱操作:,（1）凝胶色谱柱的制作：,取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。底塞的制作：打孔挖出凹穴安装移液管头部覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端。注意事项：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。顶塞的制作：打孔安装玻璃管。组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。安装其他附属结构。,（2）凝胶色谱柱的装填,凝胶的选择：材料：交联葡聚糖凝胶（G-75）。 G：表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围。 75：表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5克。 凝胶的前处理：配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。 凝胶色谱柱的装填方法： A、固定：将色谱柱装置固定在支架上。 B、装填：将凝胶悬浮液一次性的装填入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。,注意：1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。 2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。,装配好的凝胶柱,洗涤平衡：装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在50cm高的操作压下，用300ml的20mmol/l的磷酸缓冲液（pH为7.0）充分洗涤平衡12小时。注意：1、液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。2、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。,（2）凝胶色谱柱的装填,50cm高,（3）样品加入与洗脱,调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。 滴加透析样品：吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。 样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。 洗脱：小心加入pH=7.0 的20mmol/l的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。 收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5ml收集一试管，连续收集。（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）,（3）样品加入与洗脱,注意：正确的加样操作是：1、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。,收集得到的纯化后的蛋白,思考下面的问题：,让血红蛋白处在稳定的pH范围内，维持结构和功能。,1、在血红蛋白的整个过程中不断用磷酸缓冲液处理的目的是什么？,2、与其他真核细胞相比，红细胞有什么特点？这一特点对你进行蛋白质得分离有什么意义？,血红蛋白是有色蛋白，因此在凝胶色谱分离时可以通过观察颜色来判断什么时候应该收集洗脱液。这使血红蛋白的分离过程非常直观，大大简化了实验操作。,3、你能描述血红蛋白分离的完整过程吗？,血红蛋白提取和分离的程序可分为四大步，包括：样品处理、粗分离、纯化和纯度鉴定。首先通过洗涤红细胞、血红蛋白的释放、离心等操作收集到血红蛋白溶液，即:样品的处理；再经过透析去除分子量较小的杂质，即样品的粗分离；然后通过凝胶色谱法将相对分子质量较大的杂质蛋白除去，即:样品的纯化；最后经聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定。,（三）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳,鉴定血红蛋白纯度。,目的：,观察你处理的血液样品离心后是否分层（见教科书图5-18），如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。,三、实验结果分析与评价,1、你是否完成了对血液样品的处理？你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗？,2、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱柱装填得成功吗？你是如何判断的？,由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖2000或红色葡聚糖，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。,如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。,3、你能观察到蛋白质的分离过程中，红色区带的移动吗？请描述红色区带的移动情况，并据此判断分离效果？,三、实验结果分析与评价,总结以下几个问题,1.凝胶色谱法分离蛋白质的的原理是怎样的? 2.什么是缓冲溶液?它的作用是什么? 3.电泳的作用及其原理是什么? 4.你能描述血红蛋白分离的完整过程吗? 5.与其他真核细胞相比,红细胞有什么特点?这一特点对你进行 蛋白质的分离有什么意义?,1答：凝胶色谱法也称为分配色谱法，它是根据分子量的大小分离蛋白质的方法之一。所用的凝胶实际上是一些微小的多孔球体，这些小球体大多数是由多糖类化合物构成，小球体内部有许多贯穿的通道，当一个含有各种分子的样品溶液缓慢流经时，各分子在色谱柱内进行两种不同的运动，即垂直向下的运动和无规则的扩散运动。相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部，只能分布在颗粒之间，通过的路程较短，移动速度较快；相对分子质量较小的蛋白质分子比较容易进入凝胶内的通道，通过的路程较长，移动速度较慢。因此，样品中相对分子质量较大的蛋白质先流出，相对分子质量中等的分子后流出，相对分子质量最小的分子最后流出，这种现象又叫分子筛现象。此外，凝胶本身具有三维网状结构，相对分子质量大的分子通过这种网状结构上的空隙时阻力大，而相对分子质量小的分子通过时阻力小，因此不同分子量的蛋白质分子可以获得分离。,1、凝胶色谱法分离蛋白质的原理是怎样的?,2、答：在一定范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液pH发生明显变化的作用叫做缓冲作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。缓冲溶液通常是由一或两种化合物（缓冲剂）溶解于水中制得，调节缓冲剂的配比就可制得不同pH范围的缓冲液。 缓冲溶液的作用是维持反应体系的pH不变。在生物体内进行的各种生物化学过程都是在精确的pH下进行的，受到氢离子浓度的严格调控。为了在实验室条件下准确地模拟生物体内的天然环境，就必须保持体外生物化学反应过程有与体内过程完全相同的pH。,2、什么是缓冲液？它的作用是什么?,你能从凝胶色谱的分离原理分析为什么凝胶的装填要紧密、均匀吗？P70,答：凝胶实际上是一些微小的多孔球体，小球体内部有许多贯穿的通道。相对分子质量较大的蛋白质分子不能进入凝胶颗粒内部，只能分布在颗粒之间，通过的路程较短，移动速度较快；相对分子质量较小的蛋白质分子比较容易进入凝胶内的通道，通过的路程较长，移动速度较慢。因此，样品中相对分子质量较大的蛋白质先流出，相对分子质量中等的分子后流出，相对分子质量最小的分子最后流出，从而使各种相对分子质量不同的分子得以分离。如果凝胶装填得不够紧密、均匀，就会在色谱柱内形成无效的空隙，使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过，搅乱洗脱液的流动次序，影响分离的效果。,