第五章酶主讲人曹劲松

第五章第五章 酶酶主讲人：曹劲松主讲人：曹劲松本章共分十一节，主要内容包括：本章共分十一节，主要内容包括：酶的分类与命名（2）酶的性质（1、3）酶催化的影响因素（4）酶的作用原理（5）酶的几个重要概念（6、7、8）酶工程的基本内涵（9）酶的分离提纯及活力测定（10）酶在食品工业中的应用（11）酶的分类 1961年国际生化协会酶命名委员会根据酶所催化的反应类型将酶分为六大类，即氧化还原酶类、转移酶类、水氧化还原酶类、转移酶类、水解酶类、解酶类、裂解酶类、异构酶类和合成酶类，裂解酶类、异构酶类和合成酶类，分别用分别用1 1、2 2、3 3、4 4、5 5、6 6的编号来表示的编号来表示，再根据底物中被作用的基团或键的特点将每一大类分为若干个亚类，每个亚类可再分若干个亚-亚类，仍用1、2、3、编号。故每一个酶的分类编号由用“”隔开的四个数字组成。编号之前是酶学委员会的缩写EC。酶编号的前三个数字表明酶的特性：反应性质、反应物（或底物）性质、键的类型，第四个数字则是酶在亚-亚类中的顺序号。EC 1.1.1.27 大类大类 亚类亚类 亚亚类亚亚类 序号序号如乙醇脱氢酶如乙醇脱氢酶1、氧化还原酶类 即催化生物氧化还原反应的酶，如脱氢酶、氧化酶、过氧化物酶、羟化酶以及加氧酶类。2、转移酶类 催化不同物质分子间某种基团的交换或转移的酶，如转甲基酶、转氨基酶、已糖激酶、磷酸化酶等。3、水解酶类 利用水使共价键分裂的酶，如淀粉酶、蛋白酶、酯酶等。4、裂解酶类 由其底物移去一个基团而使共价键裂解的酶，如脱羧酶、醛缩酶和脱水酶等。5、异构酶类 促进异构体相互转化的酶，如消旋酶、顺反异构酶等。如：6-磷酸葡萄糖异构酶催化的反应。6、合成酶类 促进两分子化合物互相结合，同时使ATP分子中的高能磷酸键断裂的酶，如谷氨酰胺合成酶、谷胱甘肽合成酶等。酶的命名（1）国际系统命名法 在系统命名法中，一种酶只可能有一个名称和一个编号。在科技文献中，一般使用酶的系统名称。系统名称包括底物名称、构型、反应性质，最后加一个酶字。例如：系统名称:丙氨酸：-酮戊二酸氨基转移酶 它所催化的反应:谷氨酸+丙酮酸 -酮戊二酸+丙氨酸 但因某些系统名称太长，为方便起见，有时仍用酶的习惯名称。(2)习惯命名法:A.根据作用底物来命名，如淀粉酶、蛋白酶等。B.根据所催化的反应的类型命名，如脱氢酶、转移酶等。C.两个原则结合起来命名，例如丙酮酸脱羧酶等。D.根据酶的来源或其它特点来命名，如胃蛋白酶、胰蛋白酶等。这在一定程度上造成很多酶有多种名称的情况。酶的性质 酶的化学本质 酶的催化功能 酶的催化作用的特点 影响酶反应速率的因素分析酶的化学组成，发现它们主要是蛋白性成分。根据其化学组成可将酶分为：简单蛋白酶 即那些只需要其蛋白质部分就具有催化功能的酶。复合蛋白酶 即那些发挥其催化活性还需要有非蛋白成分协助的酶，也称“结合蛋白质酶”。复合蛋白酶的非蛋白成分称为辅因子或辅基，一些金属酶需要Mg2+、Fe2+、Zn2+等金属作辅基辅基。其它一些酶则需要小分子有机化合物如B族维生素作为辅因子，称为辅酶辅酶。酶的蛋白质部分称酶蛋白，酶蛋白与其辅因子一起合称为全酶全酶。根据组成酶蛋白分子的肽链数量及其组装特点，又可将酶分为三类：单体酶单体酶 单体酶只有一条多肽链，属于这一类的酶很少，一般都 是催化水解的酶，分子量在13 00035 000之间，如溶菌 酶、胰蛋白酶等 寡聚酶寡聚酶 寡聚酶由几个甚至几十个亚基组成，这些亚基可以是相 同的多肽链，也可以是不同的多肽链。亚基之间不是共价 结合，彼此很容易分开。多酶体系多酶体系 多酶体系是由几种酶彼此嵌合形成的复合体。它有利 于一系列反应的连续进行。如脂肪酸合成酶体系、呼 吸链酶系等。综上所述，关于酶的化学本质：酶是蛋白质，由氨基酸组成。既然是蛋白质，酶：有两性电解质性质；受某些物化因素影响而变性，容易发生构象变化而丧失酶活；水溶液具有胶体的性质。催化性质催化性质 酶是生物催化剂，与无机催化剂相比，二者有共性：1、用量少而催化效率高 2、不改变化学反应的平衡点 3、可降低反应的活化能 酶之所以具有催化能力，主要在于它们具有一个所谓的“活性部位活性部位”。正是由于有这种结构才使之具备上述催化生物化学反应的功能。酶的活性部位 又称“活性中心”。指酶蛋白上对于催化底物发生反应具有关键作用的区域。进一步说，活性部位本质上是蛋白质多肽链上原本相距较远的一系列氨基酸残基经由折叠而形成的特定区域。在这个区域内，特定的、对于催化反应具有贡献的氨基酸残基的侧链基团的空间配置恰到好处，有助于酶与底物的结合，有助于底物的转变。溶菌酶的活性中心溶菌酶的活性中心*谷氨酸谷氨酸35和天和天冬氨酸冬氨酸52是催化是催化基团；基团；*色氨酸色氨酸62和和63、天冬氨酸天冬氨酸101和和色氨酸色氨酸108是结是结合基团；合基团；*AF为底物多为底物多糖链的糖基，位糖链的糖基，位于酶的活性中心于酶的活性中心形成的裂隙中。形成的裂隙中。酶催化作用的特点酶催化作用的特点但酶的化学本质是蛋白质，又在生物体内作用，因此酶的作用又有特性：1、高效率；2、酶的作用具有高度的专一性；3、酶易失活，从而丧失原有催化活力；4、酶活力可调节控制；5、酶的催化活力可能与辅酶、辅基和金属离子有关。专一性专一性绝对专一性绝对专一性：除一种底物以外，其它任何物质它都不起 催化作用。相对专一性相对专一性立体专一性立体专一性：只能对一种立体异构体起催化作用，对其 对体则全无作用。基团专一性基团专一性：除了要求A和B之间的键合适外，还对其所作用键两端的基团具有不同的专一性。键专一性键专一性：只要求底物分子上有适合的化学键就可以起催化作用。这种这种专一性催化作用，对于其在食品、化工领域的应用具有重专一性催化作用，对于其在食品、化工领域的应用具有重要实践意义。要实践意义。影响因素影响因素一、底物浓度的影响 1、在酶浓度，pH，温度等条件不变的情况下研究底物浓度和反应速度的关系。如右图所示：RNase-底物复合物底物复合物 2、米氏方程 1913年，德国化学家Michaelis和Menten根据中间产物学说对酶促反应的动力学进行研究，基于平衡假设推导出了表示整个反应中底物浓度和反应速度关系的著名公式，称为米米氏方程，氏方程，式中式中KmKm称为称为米氏常数米氏常数。SKSVvmmax恒态假说，即假设酶催化反应过程中ES浓度基本保持恒定不变，推导出修正后的米氏方程，形式上与上述公式完全相同。它体现了各种因素对于酶促反应速度的综合影响。E +SE SK-1K1K2 E +P产物酶底物酶底物复合物酶二、酶浓度的影响 在一定条件下酶反应的速度与酶的浓度成正比。因为酶催化反应时，首先要与底物形成所谓中间物，即酶底物复合物ES。当底物浓度大大超过酶浓度时，反应达到最大速度Vm，如果此时增加酶的浓度，可增加反应速度，酶反应速度与酶浓度成正比关系。三、温度的影响温度对酶反应的影响是双重的：（1）随着温度的增加，反应速度也增加，直至最大速度为止。（2）随温度升高而使酶逐步变性。故酶总有一个最适反应温度，在这个温度时，酶的活力最高。在10-80常温范围内，酶活力随着反应温度的变化趋势一般可表示如右图。酶酶活活性性0.51.02.01.50 10 20 30 40 50 60 温度温度 C 温度对淀粉酶活性的影响温度对淀粉酶活性的影响 四、pH的影响 在一定的pH下,酶具有最大的催化活性，通常称此pH为最适pH。但是需指出，所谓“最适pH”实际上是一个操作参数。在不同pH时活性发生变化的原因主要在于：（1）pH能影响酶分子结构的稳定性。（2）pH能影响酶分子的解离状态。五、酶原酶原的激活和激活剂激活剂 有的酶在分泌时是无活性的酶原，需要经某种酶或酸将其分子作适当的改变或切去一部分才能呈现活性。这种激活过程又称酶原致活作用或酶原激活作用。凡是能提高酶活性的物质，都称为激活剂。酶的激活剂多为无机离子或简单有机化合物。六、酶的抑制作用和抑制剂 非专一性不可逆抑制不可逆抑制 专一性不可逆抑制 竞争性抑制可逆抑制 非竞争性抑制 反竞争性抑制竞争性抑制竞争性抑制定义定义抑制剂与底物的结构相似，抑制剂与底物的结构相似，能与底物竞争酶的活性中心，能与底物竞争酶的活性中心，从而阻碍酶底物复合物的从而阻碍酶底物复合物的形成，使酶的活性降低。这形成，使酶的活性降低。这种抑制作用称为竞争性抑制种抑制作用称为竞争性抑制作用。作用。请大家思考：如果酶催化反应体系中存在某种竞争性抑制剂，请大家思考：如果酶催化反应体系中存在某种竞争性抑制剂，那么你所测定得到的米氏常数将发生什么样的变化？那么你所测定得到的米氏常数将发生什么样的变化？竞争性抑制曲线 表表5-3 各种抑制作用的比较（参阅课本）各种抑制作用的比较（参阅课本）它列出了不同情况下的酶反应动力学方程式，以及相比于不存在抑制因素的条件下其Km和Vm的变化情况。酶的催化反应机制酶的催化反应机制 酶专一性的机制 酶催化的常见机制酶专一性的机制 锁钥学说(lock and key theory)诱导契合学说(induced-fit hypothesis)1、邻近与定向效应；2、诱导契合与底物扭曲变形；3、共价催化；4、酸碱催化；5、微环境效应。多酶体系 调节酶 同工酶 诱导酶 抗体酶 核糖酶 酶的几个重要概念酶的几个重要概念 细胞中的许多酶常常是在一个连续的反应链中起作用，即前一个反应的产物是后一个反应的底物，在完整细胞内的某一代谢过程中，由几个酶形成的反应体系，称为多酶体系。如果体系中几种酶彼此有机地组合在一起。精巧地镶嵌成一定的结构，即形成多酶复合体。这种结构既能提高反应途径的效率，又能增强调控的准确性。多酶体系调节酶一、别构酶 酶分子的非催化部位与某些化合物可逆地非共价结合后导致酶分子发生构象改变，进而改变酶的活性状态，称为酶的别构调节(allosteric regulation)，具有这种调节作用的酶称别构酶(allosteric enzyme)。别构酶促反应底物浓度和反应速度的关系不符合米氏方程，呈S型曲线。凡能使酶分子发生别构作用的物质称为效应物，如因别构导致酶活性增加的物质称为正效应物(positive effector)或别构激活剂，反之称负效应物(negative effector)或别构抑制剂。a-非调节酶非调节酶 b-正协同别构酶正协同别构酶 的的S形曲线形曲线 别构酶与米氏酶的动力学曲线比较别构酶与米氏酶的动力学曲线比较二、共价调节酶 某些酶可以通过其它酶对其多肽链上某些基团进行可逆的共价修饰，使其处于活性与非活性的互变状态，从而调节酶活性。这类酶称为共价修饰酶。目前发现有数百种酶被翻译后都要进行共价修饰，其中一部分处于分支代谢途径，成为对代谢流量起调节作用的关键酶或限速酶蛋白激酶蛋白激酶ATPADP蛋白质蛋白质蛋白质蛋白质Pn蛋白磷酸酶蛋白磷酸酶nPiH2O同工酶 同功酶是指能催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组酶。乳酸脱氢酶是研究的最多的同工酶。诱导酶结构酶 细胞内结构酶是指细胞中天然存在的酶，它的含 量较为稳定，受外界的影响很小。如糖代谢酶系、呼吸酶系等。诱导酶 是指当细胞中加入特定诱导物后诱导产生的酶，它的含量在诱导物存在下显著增高，这种诱导物往往 是该酶底物的类似物或底物本身。很多酶制剂生产中 利用了这种原理。抗体酶 抗体酶（abzyme）又称催化抗（catalyticantibody）,是指通过一系列化学与生物技术方法制备出的具有催化活性的抗体，它除了具有相应免疫学特性，还类似于酶，能催化某种反应。抗体与酶相似，都是蛋白质分子，酶与底物的结合及抗体与抗原的结合都是高度专一性的，但这两种结合的基本区别在于酶与高能的过渡态分子相结合，而抗体结合的是基态分子抗原。O C A.酯酶的底酯酶的底物物酯酯B.酯的羧基碳酯的羧基碳原子受到亲核原子受到亲核攻击形成四面攻击形成四面体过渡态体过渡态C.设计的磷酸设计的磷酸酯类似物酯类似物,作作为抗原去免疫为抗原去免疫实验动物实验动物磷酸酯类似物磷酸酯类似物(半抗原半抗原)对酯水解反应有催化对酯水解反应有催化作用的单克隆作用的单克隆抗体抗体免疫免疫免疫反应免疫反应诱导法制备具有酯酶活性的抗体诱导法制备具有酯酶活性的抗体动物免疫动物免疫接种接种核糖酶 研究发现：有些RNA分子也可具有类似酶的高效催化活性。例如L19RNA，它是原生动物四膜虫26S rRNA前体经自身拼接所释放出的内含子的缩短形式。在一定条件下能够以高度专一性的方式去催化寡聚核糖苷底物的切割与连接。五聚胞苷酸能被L19RNA转化成或长或短的聚合物。因此，L19RNA是既有核糖核酸酶活性，又有RNA聚合酶活性的生物分子，可以看作是酶了。但是，一般仍然可以认为酶具有蛋白质的化学本质。酶工程酶工程化学酶工程天然酶固定化酶化学修饰酶人工模拟酶生物酶工程克隆酶突变酶新酶 将酶学和工程学相结合，产生了酶工程(enzyme engineering)这样一个新的领域。它主要研究酶的生产、纯化、固定化技术、酶分子结构的修饰和改造以及在工农业、医药卫生和理论研究等方面的应用。固定化酶固定化酶 将水溶性酶用物理或化学方法处理，固定于高分子支持物将水溶性酶用物理或化学方法处理，固定于高分子支持物(或载体或载体)上而成为不溶于水，但仍有酶活性的一种酶制剂形上而成为不溶于水，但仍有酶活性的一种酶制剂形式，称固定化酶式，称固定化酶(immobilized enzyme)。包埋法包埋法 吸附法吸附法共价偶联法共价偶联法交联法交联法酶工程酶工程以固定化酶、固定化细胞为重要内容的酶工程技术是当今生物工程的重要组成部分。生物工程是属于高新技术领域的系统工程，酶工程也是一样，其整个过程包括上游工程（Up stream process，缩写USP）和下游工程（Down stream process，缩写DSP），前者包括酶学基本理论、产酶动植物和微生物种的改良，采用基因重组或细胞融合改造产酶菌株，以及研究开发新的酶源，为开发利用提供科学依据。而后者属整个系统工程的后处理工艺技术，解决如何提高酶和最终产物回收率和纯度质量问题，及其应用问题。酶的分离提纯 1、基本原则：提取过程中避免酶变性而失去活性；防止强酸、强碱、高温和剧烈搅拌等；强调在低温下操作，并在操作中加入缓冲溶液；材料一旦匀浆要尽快完成。2、基本操作程序：选材料（微生物、动植物等）破碎、匀浆抽提酶活力的测定 酶活力：又称为酶活性，一般把酶催化一定化学反应的能力称为酶活力，通常以在一定条件下酶所催化的化学反应速度来表示。基本原理:酶是蛋白质，种类多，结构复杂多样，一般对酶的测定，不是直接测定其酶蛋白的浓度，而是测定其催化化学反应的能力，这是基于在最优化条件下，当底物足够（过量），在酶促反应的初始阶段，酶促反应的速度（初速度）与酶的浓度成正比（即V=KE），故酶活力测定的是化学反应速度，一定条件下可代表酶活性分子浓度。测定酶活的方法：终点法:酶反应进行到一定时间后终止其反应，再用化学或物理方法测定产物或反应物量的变化。动力学法:连续测定反应过程中产物底物或辅酶的变化量，直接测定出酶反应的初速度。酶活力的表示方法酶活力的表示方法活力单位活力单位（active unit）习惯单位（习惯单位（U）:底物底物(或产物或产物)变化量变化量/单位时间单位时间 国际单位（国际单位（IU）:1moL变化量变化量/分钟分钟 Katal（Kat）：）：1moL变化量变化量/秒秒比活力比活力=总活力单位总活力单位总蛋白总蛋白mg数数=U(或或IU)mg蛋白蛋白量度酶催化能力大小量度酶催化能力大小转换系数转换系数（Kcat）底物（底物（moL）/秒秒每个酶分子每个酶分子量度酶纯度量度酶纯度比活力比活力（specific activity）量度转换效率量度转换效率 酶在食品工业中的应用 一、酶对食品感观功能的影响 内源酶类对食品的风味、质构、色泽等感观质量具有重要的影响，其作用有的是期望的，有的是不期望的。如动物屠宰后，水解酶类的作用使肉嫩化，改善肉食原料的风味和质构；水果成熟时，内源酶类综合作用的结果会使各种水果具有各自独特的色、香、味，但如果过度作用，水果会变得过熟和酥软，甚至失去食用价值。二、酶对食品营养功能的影响 脂肪氧合酶催化胡萝卜素降解而使面粉漂白，在蔬菜加工过程中则使胡萝卜素破坏而损失维生素A源；在一些用发酵方法加工的鱼制品中，由于鱼和细菌中的硫胺素酶的作用，使这些制品缺乏维生素B1；果蔬中的Vc氧化酶及其它氧化酶类是直接或间接导致果蔬在加工和贮存过程中维生素C氧化损失的重要原因之一。三、酶对食品生理调节功能的影响1、促致毒与解毒作用 有时底物本身是无毒的，在经酶催化降解后变成有害物质。例如，木薯含有生氰糖苷，虽然它本身并无毒，但是在内源糖苷酶的作用下，产生剧毒的氢氰酸。十字花科植物的种子以及皮和根含有葡萄糖芥苷，在芥苷酶作用下会产生对人和动物体有害的化合物。在酶的作用下，也可将食物中有毒的食物成分降解为无毒的化合物，从而起到解毒的作用。因食用蚕豆而引起的血球溶解贫血病是人体缺乏解毒酶的重要例子。2、酶促进活性肽的生成 例如，一些乳源蛋白成分在蛋白酶水解作用下，可以生成具有促进钙吸收的肽，或者其它具有抗高血压、免疫调节的肽。关于常见酶在食品加工中的应用，请大家参阅课本上p130-131上的表5-5。