酵母RNA的提取、组分鉴定和含量测定.ppt

,实验六,酵母RNA的提取、组分鉴定和含量测定,【实验目的】,【实验原理】,1.学习稀碱法提取RNA的原理和操作方法。 2.了解核酸的组分，并掌握鉴定核酸组分的方法。 3.掌握地衣酚显色法及紫外分光光度法测定酵母RNA含量的原理和方法,酵母核酸中RNA含量较多。RNA可溶于碱性溶液，在碱提取液中加入酸性乙醇溶液可以使解聚的核糖核酸沉淀，由此即得到RNA的粗制品。,核糖核酸含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸各组分。加硫酸煮沸可使其水解，从水解液中可以测出上述组分的存在。 RNA含量测定,除可用紫外吸收法、定磷法外,常用地衣酚法测定。其反应原理是：当RNA与浓盐酸共热时,即发生降解,形成的核糖继而转变为糠醛,后者与3,5-二羟基甲苯(地衣酚orcinol)反应,在Fe3+或Cu2+催化下,生成鲜绿色复合物。,反应产物在670nm处有最大吸收,RNA浓度在10-100g/ml范围内,光吸收与RNA浓度成正比。地衣酚法特异性差,凡戊糖均有此反应,DNA和其他杂质也能与地衣酚反应产生类似颜色。因此,测定RNA时可先测得DNA含量再计算RNA含量。,1.实验材料： 酵母粉(或酵母片),【实验材料和主要仪器、试剂】,2.实验仪器： 研钵、150mL锥形瓶、恒温水浴锅、布氏漏斗 及抽滤瓶、离心机、漏斗、分光光度计。,3.实验试剂： 0.04mol/LNaOH溶液、95%乙醇、酸性乙醇 溶液、1.5mol/L硫酸溶液 、浓氨水、 0.1mol/L硝酸银溶液 、氯化铁浓盐酸溶 液、苔黑酚乙醇溶液、钼酸铵试剂（将2g 钼酸铵溶解在100ml10%硫酸中）、标准 RNA母液、标准RNA溶液、样品溶液、地衣 酚-铜离子试剂,【实验材料和主要仪器、试剂】,【操作步骤】,1.RNA的提取：将5g酵母悬浮30mL0.04mol/L氢氧化钠溶液中，并在乳钵中研磨均匀。将悬浮液转移至100毫升锥形瓶中。在沸水浴上加热30分钟后，冷却。离心(3000r/min)15分钟，将上清液缓缓倾入15 mL酸性乙醇溶液中。注意要一边搅拌一边缓缓倾入。待核糖核酸沉淀完全后，离心(3000r/min)3分钟。弃去清液。用95乙醇洗涤沉淀两次，乙醚洗涤沉淀一次后，再用乙醚将沉淀转移至布氏漏斗中抽滤。沉淀可在空气中干燥。,2.RNA的水解：取200mg提取的核酸，加入1.5mol/L硫酸溶液10mL，在沸水浴中加热10分钟。制成水解液并进行组分的鉴定。,3.RNA的组分鉴定 （1）嘌呤碱 取水解液1mL加入过量浓氨水，然后加入约1 mL 0.1mol/L硝酸银溶液，观察有无嘌呤碱的银化合物絮状沉淀生成。,3.RNA的组分鉴定 （2）核糖 取1支试管加人水解液1mL、三氯化铁浓盐酸溶液2mL和苔黑酚乙醇溶液0.2mL。放沸水浴中10分钟。注意溶液是否变成绿色，说明核糖的存在。 （3）磷酸 取1支试管，加入1ml水解液，加入5滴浓HNO3和1ml钼酸铵试剂后，在沸水浴中加热，观察有无黄色磷钼酸铵沉淀产生，说明磷酸是否存在。,4.RNA地衣酚法显色测定 （1)标准曲线的制作,（1)标准曲线的制作,按上表编号及加入试剂。加毕，摇匀，置沸水浴加热25min，取出后冷水冷却，以零号管作对照,于670nm波长处测定各管光吸收值。取测定的平均值,以RNA浓度为横坐标,光吸收为纵坐标作图,绘制标准曲线。,(2)样品的测定取两支试管,各加入2.0mL样品注液,再加2.0mL地衣酚-Cu2+试剂，如前述进行测定. (3)RNA含量的计算根据测得的光吸收值,从标准曲线上查出相当该光吸收的RNA含量，计算出制品中RNA的百分含量。,【注意事项】,样品中蛋白质含量较高时,应先用5%三氯乙酸溶液沉淀蛋白质后再测定。 本法特异性较差,凡属戊糖均有反应.微量DNA无影响,较多DNA存在时,亦有干扰作用。如在试剂中加入适量CuCl2 .2H2O可减少DNA的干扰。此外,利用RNA和DNA显色复合物的最大光吸收不同,且在不同时间显示最大色度加以区分。反应2min后,DNA在600nm呈现最大光吸收,而RNA则在反应15min后,在670nm下呈现最大光吸收。,定磷试剂含有还原剂抗坏血酸，抗坏血酸很容易被空气中的氧所氧化，使定磷试剂失效。因此可以改用钼酸铵试剂定磷。核酸分子中的有机磷经强酸消化后形成无机磷，在酸性条件下,无机磷与钼酸铵结合形成黄色磷钼酸铵沉淀。,【思考题】,1、如何得到高产量RNA粗制品？ 2、验证RNA中核糖的办法，可否用以检验脱氧核糖，为什么？ 3、用你所学过的化学知识,分析3种催化剂： FeC136H2O,CuC12H2O和CuO,哪种催化剂的催化效果更好？ 4、地衣酚反应中,干扰RNA测定的因素有哪些 如何能减少它们的影响。,