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生化实验技术,主讲:钱国英 教授 浙江万里学院,第一讲 核酸化学实验技术 第二讲 蛋白质化学实验技术 第三讲 酶学实验技术 第四讲 糖类化学实验技术 第五讲 脂类化学实验技术 第六讲 维生素和辅酶化学实验技术,实验授课内容,课堂理论:课前辅导生化大分子基本性质、提取、分 离纯化、含量检测等相关生化物质的分离分析技术。 项目任务:设计案例,引导学生去解决案例问题的方式 向学生布置项目任务、实验设计和实施要求。 实验设计:学生分组查阅资料设计实验方案 网上递交教师修改及审核大组讨论评价 实验操作:各小组(2人)为单位进行实验试剂、器材的 准备,按实验设计完成实验内容操作。 实验论文:根据任务要求,每位学生独立完成课程论文。 课堂讨论:大组为单位进行全班ppt形式交流汇报,实验实施流程,第一讲 核酸化学实验技术,案例1,目前,人们的生活中充斥了越来越多的转基因产品,如转基因大豆、转基因棉花、转基因玉米、马铃薯、水稻等等。 转基因作为一种新兴的生物技术手段,它的不成熟和不确定性,使得转基因食品的安全性成为人们关注的焦点。,问题:如何检测转基因食品?,第一节 实验项目发布与设计方案评价,什么是转基因食品?,转基因食品:以转基因生物为直接食品或为原料加工生产的食品。 转基因食品利用现代分子生物技术,将某些生物的基因转移到其他物种中去,改造生物的遗传物质,使其在形状、营养品质、消费品质等方面向人们所需要的目标转变。,转基因育种的程序?,标记基因 启动子 外源目的基因 终止序列,载体的构建,转基因食品的核酸检测技术,检测对象:转基因的启动子、终止子、抗性筛选基因、目的基因等外源基因 检测方法:普通定性PCR、实时荧光定量PCR、基因芯片 其中以普通定性PCR、实时荧光定量PCR最常用。,核酸定性PCR法检测转基因食品,样品基因组DNA的提取 DNA提取质量检测 特有序列的PCR 琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物 进一步验证:测序、PCR产物酶切鉴定、实时荧光定量PCR方法等,一般步骤,核酸定性PCR法检测转基因食品,案例2,某实验人员从土壤中分离筛选出一株产植酸酶的菌株,经形态学和生理生化特性初步鉴定为真菌。 真菌种类繁多,地球上大约存在150万种真菌,已经被发现和运用的大约有69000种。,生物遗传物质携带了物种的特异信息,在属种间具有高度的保守性。因此,可应用分子生物学鉴定手段对真菌进行种类鉴定和系统分类。,问题:如何准确鉴定其种属 ?,图1 真菌rDNA转录区和相关引物,真核生物基因组中编码核糖体的基因包括28S、5S、18S和5.8S rDNA 4种,在染色体上头尾相连,串联排列,相互间由间隔区分隔。 18S、5.8S和28S rDNA基因组成一个转录单元(图1),三者高度保守,适合较高等级水平生物群体间的系统分析。 其间的间隔区为内转录间隔区(Internal Transcribed Spacer,ITS),包括ITS1和ITS2,进化相对迅速,具有多态性,适合较低等级水平的系统学研究。,设计特定引物对该真菌菌株中的基因组中的rDNA转录区的特定核苷酸片段进行PCR扩增,通过对所获得的PCR产物进行测序分析,与已知真菌序列比对即可确定该菌株在系统分类学上的位置。,基于rDNA-ITS序列在真菌分子鉴定中的应用,你如何获得高质量的基因组DNA并鉴定菌株的目的基因序列?,表1 真菌rDNA-ITS通用扩增引物,图1 真菌rDNA转录区和相关引物,真菌rDNA-ITS通用引物,实验设计要求: 根据案例提交一个具体解决基因组提取及分离鉴定的实验设计方案,包括从提供的不同材料中提取、分离得到基因组DNA,测定所得DNA的含量、纯度及分子大小,并利用已知引物进行PCR扩增,分析PCR检测的结果。,实验题目: 基因组DNA的提取与PCR鉴定,实验项目与任务布置,分组题目,项目1:定性PCR法检测转基因食品 项目2:rDNA-ITS扩增法鉴定真菌种类,全班分成4大组,各选一个题目。 每个大组3个小组,2名同学一个小组。 以大组为单位进行实验准备和讨论。 以小组为单位进行实验设计和操作。,实验目标,学习从各种材料(动物、植物组织、微生物)中提取和纯化DNA的原理和操作技术。 学习水平式琼脂糖凝胶电泳及紫外检测,确定DNA的纯度、含量与分子大小。 学习PCR的基本原理和操作方法。 掌握高速冷冻离心机、微量移液枪、水平电泳仪、PCR仪等仪器设备的使用。,实验设计需包含的主要技术内容,基因组DNA提取:可选用浓盐法、阴离子去污剂法、苯酚抽提法、水抽提法、试剂盒法等 DNA含量测定:可选用二苯胺法、紫外分光光度法等 DNA纯度测定:紫外分光光度法 DNA分子大小测定:琼脂糖凝胶电泳 PCR技术,实验结果要求,各标准曲线 基因组DNA产品得率(mg/100g) 基因组DNA产品纯度 基因组DNA琼脂糖凝胶电泳图 PCR产物琼脂糖凝胶电泳图 PCR产物分子大小(bp) 检测结论,基因组DNA提取 4学时 DNA的含量与纯度测定 4学时 DNA的琼脂糖凝胶电泳 4学时 PCR及产物检测 4学时,实验时间安排,课后研讨题,1.DNA提取的方法主要有哪些?并说明各方法的原理。 2.结合本人实验操作的体会,试述在提取过程中应如何避免大分子DNA的降解和断裂? 3.查阅资料,说明提取的基因组DNA有哪些方面的用途? 4.查阅资料,举例说明DNA琼脂糖凝胶电泳的应用和发展。 5.琼脂糖凝胶电泳所用DNA染料EB具有潜在的致癌性,查阅资料,查找可替代EB的染料并说明优缺点。,课后研讨题,6.结合本次实验,说明PCR技术的主要用途和发展。 7.通过本次实验,谈谈你对转基因食品安全性的认识。 8.查阅资料,说明转基因食品检测的常规方法。 9.查阅资料,综述常用的物种分子鉴定技术。 10.案例分析:在美国海豹突击队击毙本拉登几个小时后,美国总统奥巴马向全世界宣布拉登已被成功击毙,死者确定为本拉登的可能性是99.9%。查阅资料,根据所学核酸分子鉴定技术,分析如何对其进行法医鉴定。,相关事项,实验习惯 药品配制与保存 实验记录 实验交流 实验论文,Good Luck!,小组上交材料,论文格式模板,研讨课要求,以大组为单位课后总结结果,讨论,制作一份ppt,课内讨论汇报。 ppt内容包括:实验背景和目的,实验主要原理,实验条件的选择,各小组实验结果和分析,课后研讨题,实验体会等。,基因组是指细胞内遗传信息的携带者DNA的总体。 为了研究DNA分子在生命代谢中的作用,常常需要从不同的生物材料中提取DNA。由于DNA分子在生物体内的分布及含量不同,要选择适当的材料提取DNA。 从各种材料中提取DNA方法不同,分离提取的难易程度也不同。真核生物的DNA主要存在于细胞核中,与蛋白质结合构成染色体,原核生物的DNA不与任何蛋白质结合。,理论介绍,一、内容提要,保持基因组DNA结构相对完整:防止各种因素引起的降解。 纯度高:尽量排除其他大分子成分的污染(蛋白质、多糖和RNA等)。 得率好:选用合适的方法获得足够量的DNA。,二、分离纯化核酸的总原则,三、基因组DNA提取的原理和方法,裂解细胞,释放DNA,核酸分离纯化,沉淀并吸附核酸,核酸溶解(缓冲液),准备适宜的材料,去除蛋白质、RNA等杂质,细胞破碎,细菌溶菌酶(降解细胞壁),EDTA(抑制DNA酶,防止DNA降解),去垢剂SDS(破坏细胞膜) 酵母破壁酶或液氮研磨 植物材料液氮研磨(使细胞冻结,用研钵碾制成粉状) 动物组织匀浆或液氮研磨,化学法、机械法、生物法,DNA与蛋白质的分离,SDS:真核生物的DNA与组蛋白结合形成DNP,SDS能够破坏DNA与蛋白质之间的静电引力或配位键,可使DNA与蛋白质解聚,释放出DNA。 CTAB:是一种阳离子去污剂,可溶解细胞膜,能与核酸形成复合物,在高盐溶液(NaCl0.7M)中是可溶的,当NaCl降低到0.3M 时,可沉淀CTAB-核酸复合物。 苯酚-氯仿-异戊醇:苯酚、氯仿能变性蛋白质,离心分层,DNA溶于上层水相,变性蛋白质位于水相和有机相之间。异戊醇可减少抽提过程的泡沫产生。,1.DNP中DNA与蛋白质的分离,2.蛋白质的去除,核酸分离纯化,RNA的去除,用不含DNA酶的RNase处理,使RNA降解。 添加RNase处理后,可再用等量的苯酚/氯仿抽提,离心除去蛋白质及寡核苷酸。,核酸分离纯化,含DNA的水相可用1倍体积的异丙醇或2倍体积的无水乙醇沉淀。 基因组的大分子DNA沉淀形成纤维状絮团漂浮其中,可用吸头将其挑出,而小分子DNA则只形成颗粒状沉淀附在壁上及底部。 如果DNA沉淀量少或无法捞出,可离心获取沉淀。 沉淀DNA前,为提高沉淀效果,可加入NaAC、乙酸铵等盐类促进沉淀。 获取的沉淀需再用70%乙醇洗涤除去残留的有机物、无机盐等。,沉淀并吸附核酸,基因组DNA提取注意事项,使用新鲜、幼嫩的材料;材料应适量,过少造成核酸提取量少,过多影响裂解,导致DNA量少。(推荐0.2-5g)。 简化操作步骤,缩短提取过程,避免物理、化学和生物的因素对核酸的降解,如机械剪切力、高温和DNase等酶,防止过酸、过碱,避免剧烈振荡和混合。 采用酚-氯仿抽提时应采用上下颠倒的方法充分混匀,但动作要轻柔,离心分离两相时,应保证一定的转速和时间。 沉淀DNA用的异戊醇、乙醇事先放入-20冰箱,待用时取出。,特别注意,液氮研磨时为防止冻伤,需戴棉线手套操作,研磨越细越好。 苯酚腐蚀性极强,并可引起严重灼伤,操作时应戴手套。 一定要搞清提取原理,知道每一步操作DNA所在的位置,防止出错。,四、基因组DNA的检测,1、二苯胺显色法测定DNA浓度 二苯胺法定量测定DNA的原理为:在强酸、加热条件下,可以使DNA中的嘌呤碱基与脱氧核糖间的糖苷键断裂,产生嘌呤碱基、脱氧核糖与嘧啶核苷酸。其中,2-脱氧核糖在酸性环境中成为w-羟基-r-酮基戊醛,此物与二苯胺反应生成蓝色化合物,在595nm处有最大吸收。DNA在40-400ug范围内光吸收值与DNA含量成正比。,详见教材:实验二十二 二苯胺显色法测定DNA浓度,2、紫外分光光度法测定DNA含量 核酸、核苷酸及其衍生物都具有共轭双键,具有紫外吸收。DNA的紫外吸收峰为260nm。一般在260nm波长下,在pH7.0时每毫升含1g DNA溶液的光吸收值约为0.020。故测定待测DNA溶液260nm的光吸收值即可计算出其中核酸的含量。此法操作简便,迅速。,详见实验课件:核酸定量测定,3、紫外分光光度法测定DNA纯度 当DNA样品中含有蛋白质、酚或其他小分子污染物时,会影响DNA吸光度的准确测定。DNA纯度的判断根据OD260/OD280值判断,符合要求、纯度高的纯化DNA其比值为1.8。如果样品中污染有蛋白质或酚,其OD260/OD280将明显低于此值。此时无法对样品中的核酸进行精确定量。,4、琼脂糖凝胶电泳法测定DNA分子大小 电泳是荷电溶质或粒子在电场作用下发生定向泳动的现象。核酸的分离和鉴定通常采用琼脂糖凝胶电泳。 不同大小、不同形状和不同构象的DNA 分子在相同的电泳条件下(如凝胶浓度、电流、电压、缓冲液等),有不同的迁移率,所以可通过电泳使其分离。琼脂糖凝胶电泳分离后的DNA可用溴化乙啶(EB)染色。,详见实验课件:DNA的琼脂糖凝胶电泳,五、PCR检测技术,聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR),是一种选择性的体外扩增DNA或RNA的分子生物学技术。 PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程,其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。,PCR由变性、退火、延伸三个基本反应步骤构成:,模板DNA的变性:模板DNA经加热至94左右一定时间后,使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离,成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备; 模板DNA与引物的退火:模板DNA经加热变性成单链后,温度降至50左右,引物与模板DNA单链的互补序列配对结合; 引物的延伸:DNA模板引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基互补配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。,PCR反应示意图,重复循环:变性退火延伸这三个过程就可获得更多的“半保留复制链”,而且这种新链又可成为下次循环的模板。 每完成一个循环需24分钟,23小时就能将待扩增目的基因扩增放大几百万倍。,PCR动画演示,
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