DNA片段扩增及DNA连接PCR讲解

DNA片段扩增及DNA连接PCR讲解一、一、PCR实验背景实验背景 二、二、PCR基本原理基本原理三、三、PCR引物设计原则引物设计原则四、四、PCR反应注意事项反应注意事项五、常见问题与对策五、常见问题与对策六、六、PCR的应用的应用讲解内容讲解内容 第二次实验课、第二次实验课、DNA片段扩增及片段扩增及DNA连接连接DNA片段扩增及DNA连接PCR讲解一实验背景一实验背景 The Nobel Prize in Chemistry 1993体外扩增特异体外扩增特异DNA片段片段DNA片段扩增及DNA连接PCR讲解二二PCR基本原理基本原理 3535355355在模板、引物、在模板、引物、4种种dNTP和耐热和耐热DNA聚合酶存在的条件下，聚合酶存在的条件下，特异扩增位于两段已知序列之间的特异扩增位于两段已知序列之间的DNA区段的酶促合成反应。区段的酶促合成反应。DNA片段扩增及DNA连接PCR讲解模板（模板（DNA或或cDNA）2 l10 PCR buffer（含（含MgCl2）5 ldNTPs(10mmol/L)1 l5引物引物(10 mol/L)1 l3引物引物(10 mol/L)1 l去离子水去离子水（补足反应体系）（补足反应体系）39 l Taq DNA pol.(2U/l)1 l 轻弹管底混合（用离心机甩一下）轻弹管底混合（用离心机甩一下）50l在一微量离心管中依次加入下列试剂：在一微量离心管中依次加入下列试剂：加入顺序不是随机的：加入顺序不是随机的：DNADNA聚合酶一定要最后加入。聚合酶一定要最后加入。DNA片段扩增及DNA连接PCR讲解PCR仪设定的反应条件：仪设定的反应条件：94oC 45 S DNA变性变性55 oC 45 S DNA复性复性72 oC 1 min 产物链延伸产物链延伸 25-30个循环后个循环后 72 oC 10 min 一般地，基因片段在一般地，基因片段在500-1000bp左右时，左右时，可按下列条件进行可按下列条件进行PCR：DNA片段扩增及DNA连接PCR讲解介绍：介绍：PCR仪仪如果上盖加热的如果上盖加热的PCR仪，可以直接放仪，可以直接放入仪器中进行入仪器中进行PCR；如果下面加热的如果下面加热的PCR仪，加入仪，加入2滴滴矿物油后，加入仪器中，不过这矿物油后，加入仪器中，不过这种仪器现在已经很少用到。种仪器现在已经很少用到。DNA片段扩增及DNA连接PCR讲解PCR仪内发生的反应仪内发生的反应变性变性退火退火延伸延伸55DNA片段扩增及DNA连接PCR讲解1234522557294时间（min）温度（）PCR的基本原理适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍DNA片段扩增及DNA连接PCR讲解PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点1234522557294时间（min）温度（）适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性子链延伸DNA加倍DNA变性形成2条单链模板DNA95DNA片段扩增及DNA连接PCR讲解PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点9550引物1引物2DNA引物DNA片段扩增及DNA连接PCR讲解PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点50引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶DNA片段扩增及DNA连接PCR讲解PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72第1轮结束95第2轮开始DNA片段扩增及DNA连接PCR讲解PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点955072TaqTaqTaqTaqDNA片段扩增及DNA连接PCR讲解PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72第2轮结束DNA片段扩增及DNA连接PCR讲解 PCR产物的积累规律反应初期，目的DNA片段呈指数扩增。随着目的DNA产物逐渐积累，在引物、模板与DNA聚合酶达到一定比例时，酶的催化反应趋于饱和，此时扩增DNA片段的增加减慢进入相对稳定状态，即出现“停滞效应”，又称“平台期”。到达平台期所需PCR循环次数取决于样品中模板的拷贝数、PCR扩增效率等因素。DNA片段扩增及DNA连接PCR讲解n反应分三步：变性（denaturation）；退火（annealing）；延伸（extension）DNA片段扩增及DNA连接PCR讲解 PCRPCR反应成功扩增的一个关键条件在于引物的正确设计。反应成功扩增的一个关键条件在于引物的正确设计。引物设计的总原则就是提高扩增的特异性，这取决于引引物设计的总原则就是提高扩增的特异性，这取决于引物与模板的特异结合。物与模板的特异结合。PCRPCR反应中有两条引物，即反应中有两条引物，即55引物和引物和33引物。引物。三、三、PCR引物的设计引物的设计引物设计引物设计 的的 基本原则基本原则引物的设计实例引物的设计实例 ()DNA片段扩增及DNA连接PCR讲解 PCR 引物设计引物设计 的的 基本原则基本原则2.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。在NCBI上搜索该基因。通过序列同源性比较软件（比如DNAman）比对（Alignment），相同的序列就是其保守区。1.引物的方向永远是引物的方向永远是 5 3 引物长度一般在1530核苷酸核苷酸之间。引物长度（primer length）常用的是18-27 bp。过短会使PCR的特异性降低；过长没有必要。引物3端要避开密码子的第3位。因为密码子的第3位易发生不改变aa突变。DNA片段扩增及DNA连接PCR讲解3.引物引物3端是端是DNA延伸的起点，因此一定要严延伸的起点，因此一定要严格与模板格与模板DNA配对。尤其是引物配对。尤其是引物3末端连续末端连续8个碱基要求与模板严格互补。个碱基要求与模板严格互补。但引物的但引物的3端最好没有连续端最好没有连续3个个G和和C。否则会。否则会使引物在模板的使引物在模板的G+C富集序列区错误配对。富集序列区错误配对。引物3端最好选择T？引物3端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异。当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3端最好选择T。引物3端的从结合的角度讲最佳碱基选择是从结合的角度讲最佳碱基选择是G和和C。DNA片段扩增及DNA连接PCR讲解4.碱基要随机分布。引物中四种碱基的分布最好是随机的，避免出现嘌呤，嘧啶的堆积现象。45-55%(40%60%)之间，Tm值最好接近72。上下游引物的GC含量不能相差太大。具有相似的Tm值。引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为5580。Tm值最好接近72。退火温度：一般低于Tm值210。引物长度要确保引物长度要确保Tm值不低于值不低于54C。DNA片段扩增及DNA连接PCR讲解6.引物自身及引物之间不应存在互补序列。引物内部不应存在互补序列。引物内部不应存在互补序列。以避免折叠成发夹结构(Hairpin)。尤其在引物3末端。按经验，不能有连续4(5)个碱基的互补。引物3末端一般不达到 3 bp。引物间不应存在互补序列。引物间不应存在互补序列。尤其应避免3端的互补，以免形成引物二聚体。引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其G值不要过高（应小于4.5kcal/mol）DNA片段扩增及DNA连接PCR讲解Primers That Form Hairpins A primer may be self-complementary and be able to fold into a hairpin.The 3 end of the primer is base-paired,preventing it annealing to the target DNA.5-GTTGACTTGATA T 3-GAACTCTDNA片段扩增及DNA连接PCR讲解Primers That Form Dimers Primer pairs should be checked for complementarity at the 3-end.This often leads to primer-dimer formation with itself or with the other primer.Primer dimers can be an excellent,but unwanted,substrate for the Taq polymerase.5-ACCGGTAGCCACGAATTCGT-3 3-TGCTTAAGCACCGATGGCCA-5 DNA片段扩增及DNA连接PCR讲解7.引物的5端可以修饰，而3端不可修饰。引物5 端修饰包括：加酶切位点；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；加入其它短序列包括起始密码子，终止密码子。引入启动子序列等。标记生物素、荧光、地高辛等；引物的延伸是从3 端开始的，不能进行任何修饰。3 端也不能有形成任何二级结构可能。在在PCRPCR的起始反应中，引物的起始反应中，引物55端游离的碱基并不影响端游离的碱基并不影响引导新生链引导新生链DNADNA合成的能力。但在后续的扩增循环中，这合成的能力。但在后续的扩增循环中，这些与初始模板不配对的序列被带到些与初始模板不配对的序列被带到PCRPCR产物的双链中去，产物的双链中去，所以如此引物参与的所以如此引物参与的PCRPCR产物，既含有目的扩增片段又含产物，既含有目的扩增片段又含有两侧引入的核苷酸序列。有两侧引入的核苷酸序列。DNA片段扩增及DNA连接PCR讲解8.引物5端和中间G值应该相对较高，而3端G值较低。G值是指DNA 双链形成所需的自由能，它反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，G值越大，则双链越稳定。应当选用5 端和中间G值相对较高，而3 端G值较低（绝对值不超过9）的引物。引物3 端的G 值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA 聚合反应。（不同位置的G值可以用Oligo 6软件进行分析）9.扩增产物的单链不能形成二级结构。某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。DNA片段扩增及DNA连接PCR讲解引物设计完成以后，应对其进行BLAST检测。如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了。10.10.引物的碱基序列不应与非扩增区域有同源引物的碱基序列不应与非扩增区域有同源性。与模板之间的特异性结合序列一般不少性。与模板之间的特异性结合序列一般不少于于15-18bp15-18bp。值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件比较困难，例如GC含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；用作克隆目的的PCR，因为产物序列相对固定，引物设计的选择自由度较低。在这种情况只能退而求其次，尽量去满足条件。DNA片段扩增及DNA连接PCR讲解引物设计引物设计 1、GC比值：碱基对中的比值：碱基对中的GC之间有三条氢键，之间有三条氢键，AT之间有两条之间有两条 氢键，氢键，GC和和AT在引物序列中的合理比例是设定在引物序列中的合理比例是设定PCR退火温度的退火温度的 重要依据。通常在一个引物中重要依据。通常在一个引物中GC和和AT各半。各半。2、引物特异序列的长度至少为、引物特异序列的长度至少为15-18bp。3、引物的方向：引物的方向永远是、引物的方向：引物的方向永远是53方向，正向（方向，正向（Sense）引物是与一股模板引物是与一股模板DNA序列相一致的，而反向（序列相一致的，而反向（Antisense）引物）引物则与这股模板则与这股模板DNA序列相互补。序列相互补。4、引物的酶切位点：通常在引物的引物的酶切位点：通常在引物的5-端设计适当的限制端设计适当的限制 性酶切位点。两种酶切位点使克隆具有方向性。性酶切位点。两种酶切位点使克隆具有方向性。5、引物上启始和终止密码：如果想表达、引物上启始和终止密码：如果想表达DNA片段，所片段，所 用的载体又不含启始密码和终止密码，应将其设计在用的载体又不含启始密码和终止密码，应将其设计在 引物的酶切位点之后、特异性引物的酶切位点之后、特异性DNA序列之前。序列之前。6、如果表达的蛋白用亲合层析方法纯化，可将必要、如果表达的蛋白用亲合层析方法纯化，可将必要 的序列设计在引物中以使所表达的融合蛋白易于纯化。的序列设计在引物中以使所表达的融合蛋白易于纯化。DNA片段扩增及DNA连接PCR讲解specificity:conserved genomic region.3小时，具有35外切酶活性，催化DNA合成的忠实性比Taq DNA聚合酶高12倍。35 proofreading exonuclease activity.with greater accuracy.no extra A.DNA片段扩增及DNA连接PCR讲解（3.3）Vent-TM DNA聚合酶聚合酶 半衰期：半衰期：100 ，95分钟分钟 97.5 ，130分钟 其扩增产物的长度可达1013kb。活活 性：性：具有35外切酶活性，具有校对功能，错误掺入率为1/31000。忠实性比TaqDNA聚合酶提高510倍。DNA片段扩增及DNA连接PCR讲解（3.4）Tth DNA聚合酶聚合酶 半衰期：半衰期：95 0C，20分钟分钟 活活 性：性：具有逆转录酶活性，可简化RT-PCR。但不具35外切酶活性，没有校对功能，催化聚合反应的错误掺入率为1/500。DNA片段扩增及DNA连接PCR讲解缓冲液含缓冲液含50mmol/L的的KCl可促进引物退火，大于此浓度将会可促进引物退火，大于此浓度将会抑制抑制TaqDNA聚合酶的活性。聚合酶的活性。4、10 X PCR buffer 5 l Buffer:10-50mmol/L Tris-HCl (pH8.3-8.8,20)。DNA片段扩增及DNA连接PCR讲解 5、Mg 2+：2025mmol/L 3 l For Taq polymerase activity.镁离子浓度：镁离子浓度：1.52.0 mmol/L Concentration:too Low:low activitytoo High:non-specific amplificationTaq DNA聚合酶活性需要Mg2+。Mg2+浓度过低，会显著降低酶活性。Mg2+浓度过高又使酶催化非特异性扩增增强。DNA片段扩增及DNA连接PCR讲解 当反应体系中含有高浓度的当反应体系中含有高浓度的 primers、dNTP、EDTA 时时:上述分子中的磷酸基团可与Mg2+结合而降低游离Mg2+浓度，从而影响Taq DNA聚合酶的活性。Vary Mg2+in steps of 0.5 mM Within 1.55.0 mM;Sometimes a compromise between yield and specificity.DNA片段扩增及DNA连接PCR讲解 dNTPs 贮备液：浓度为贮备液：浓度为 10 mmol/L。（注：dNTP 具有较强的酸性，使用时应用1mol/LNaOH将pH值调至中性(7.07.5)。分装，分装，20存放，存放，反复冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTPs浓度在20200mol/L。dNTP浓度过高浓度过高会增加非特异性配对碱机的错误掺入率。低浓度的低浓度的dNTP会导致反应速度的下降，减少PCR产物量，但可提高反应的特异性及实验的精确性。4种种 dNTP 浓度应相同浓度应相同:错误碱基的掺入率降至最低。1 l;2kb gene:2 l 6、底物、底物:dNTPs（脱氧核苷三磷酸）脱氧核苷三磷酸）(10mmol/L)1 l （被稀释了（被稀释了 50 倍倍,即浓度：即浓度：200 mol/L）DNA片段扩增及DNA连接PCR讲解 7、添加剂：添加剂：DMSO（二甲基亚砜）（二甲基亚砜）2.5 l 相当于将相当于将 但但1010的的DMSODMSO会对聚合酶活性产生不良影响。会对聚合酶活性产生不良影响。加入适量二甲基亚砜（终浓度：加入适量二甲基亚砜（终浓度：5）有）有利于引物、模板的解链，减少其二级结构，利于引物、模板的解链，减少其二级结构，DNA片段扩增及DNA连接PCR讲解1）为什么有时候需要进行热启动？）为什么有时候需要进行热启动？（二）、如何确定（二）、如何确定PCR的变性、退火和延伸的变性、退火和延伸温度和时间？温度和时间？热启动：热启动：Taq DNA聚合酶在聚合酶在DNA双链充双链充分打开之后再加入分打开之后再加入PCR反应体反应体系中，系中，这样可保证模板这样可保证模板DNA、引物变、引物变性充分，避免发夹结构或其它性充分，避免发夹结构或其它二级结构影响引物的退火，使二级结构影响引物的退火，使引物能更加顺利地、特异性地引物能更加顺利地、特异性地结合到模板上。结合到模板上。热启动结束后暂停热启动结束后暂停PCR反应，反应，在在PCR仪上直接趁热仪上直接趁热加入加入DNA pol。Optimizing the PCR Reaction program DNA片段扩增及DNA连接PCR讲解变性温度：变性温度：一般选用一般选用94 95 。变性时间：变性时间：可根据模板长短、可根据模板长短、G和C含量确定，一般采用一般采用30秒。秒。2）变性）变性但过高或时间过长都会导致酶活性损失。但过高或时间过长都会导致酶活性损失。oC 2h，95oC 40mins，97oC 5mins.30 cycles will need 15 minDNA片段扩增及DNA连接PCR讲解 3）退火温度和时间）退火温度和时间PCR的基本流程：的基本流程：94oC,45 sec55oC,1 min72oC,2 min 退火温度的变化是根退火温度的变化是根据引物的据引物的GC比例、引比例、引物的长度调整的。物的长度调整的。AnnealingFrom 45oC to 60oC.Usually it is around 55 for 1 min.退火退火 温度与引物序列关系非常密切，退火时间与温度与引物序列关系非常密切，退火时间与引物长度和引物长度和GC含量有关。含量有关。引物长度一般在引物长度一般在15-25bp之间。之间。Tm=4(G+C)+2(A+T)DNA片段扩增及DNA连接PCR讲解(a)Annealing temperature is too highPrimers and templates remain dissociated.(b)Annealing temperature is too low.Mismatched hybrid.(c)Correct annealing temperature.Priming occures only at the desired target sites.How to decide annealing temperature?(a)(b)(c)温度越高，特异性(specificity)越高。DNA片段扩增及DNA连接PCR讲解温度：温度：72，74，是 Taq 酶的最适工作温度。时间：根据待扩增基因片段的大小确定延伸时间。时间：根据待扩增基因片段的大小确定延伸时间。过长会导致产物非特异性增加。酶的酶的 延伸效率：延伸效率：1000bp/1min。4）延伸温度和时间）延伸温度和时间DNA片段扩增及DNA连接PCR讲解cycles循环次数：循环次数：2530cycles 循环过多会增加碱基的错配几率。4）循环次数）循环次数DNA片段扩增及DNA连接PCR讲解总结：总结：其他因素其他因素1）热启动：提高扩增的特异性）热启动：提高扩增的特异性2）添加剂：）添加剂：DMSO消除引物与模板的二级结构，降消除引物与模板的二级结构，降低低DNA的解链温度，增进的解链温度，增进DNA复性时的特异配对。复性时的特异配对。3）液体石蜡：防止反应液蒸发后反应成分的改变。）液体石蜡：防止反应液蒸发后反应成分的改变。How big is a target DNA?typically in the size range 100-1500 bp.Longer targets are amplifiable 25 kb.Requires modified reaction buffer,cocktails of polymerases,and longer extension times.DNA片段扩增及DNA连接PCR讲解五、五、常见问题与对策常见问题与对策DNA片段扩增及DNA连接PCR讲解无扩增产物-假阴性1.1.模板模板:提取的模板核酸中含有杂蛋白质、酚、EDTA等抑制了Taq酶活性 too much or too little 原原因因DNA片段扩增及DNA连接PCR讲解2.2.引物：引物：选一个好的引物合成单位。选一个好的引物合成单位。引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，两引物带的亮度应大体一致两引物带的亮度应大体一致，如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。引物发生降解引物发生降解:引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放4 导致引物变质降解失效。引物设计不当引物设计不当:引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。DNA片段扩增及DNA连接PCR讲解 Mg2+浓度：浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量,甚至不出扩增条带。酶失活：酶的失活，PCR时忘了加Taq酶。变性不彻底：变性温度低，变性时间短。退火温度太高，延伸时间太短退火温度太高，延伸时间太短PCR仪温度的准确性。设立阳性对照设立阳性对照 假阴性假阴性DNA片段扩增及DNA连接PCR讲解 假阳性假阳性现象：空白对照出现目的扩增产物空白对照出现目的扩增产物DNA片段扩增及DNA连接PCR讲解PCR污染原因污染原因 实验室中克隆质粒的污染、PCR扩增产物污染 实验室中加样枪、白大衣、PCR试剂的污染 实验室中气溶胶污染 标本间交叉污染PCR污染：极微量的污染便可导致假阳性DNA片段扩增及DNA连接PCR讲解 打开离心管前 应先离心，将管壁及管盖上的液体甩至管底部。开管动作要轻，以防管内液体溅出，防止防止将将靶序列靶序列溅出离心管外，防止将溅出离心管外，防止将靶序列靶序列吸入加样枪内吸入加样枪内，造成实验室污染；除了除了酶等不能耐高温的物质外，所有试剂器材均高压不能耐高温的物质外，所有试剂器材均高压消毒。消毒。手套、手套、离心管及枪头离心管及枪头(质量好）等一次性使用等一次性使用,不要不要碰到别处。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。3)3)各种试剂先进行分装，低温贮存。各种试剂先进行分装，低温贮存。防止污染的方法防止污染的方法DNA片段扩增及DNA连接PCR讲解合理分隔实验室合理分隔实验室 隔离的专用操作区、专用加样器 标本处理区;PCR反应液制备区;PCR循环扩增区;PCR产物鉴定区.DNA片段扩增及DNA连接PCR讲解阴性对照阴性对照 试剂试剂 对照对照:在PCR试剂中不加模板DNA或RNA，进行PCR扩增，以监测试剂是否污染污染设立适当的对照设立适当的对照 标本对照标本对照:被检的标本是血清就用 鉴定后的正常血清作对照;被检的标本是组织细胞就用相应的组织细胞作对照DNA片段扩增及DNA连接PCR讲解 非特异性扩增 现象：现象：1 1）PCRPCR扩增后出现的条带与预计的扩增后出现的条带与预计的大小不一致；大小不一致；2 2）或者同时出现特异性扩增带与非）或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。特异性扩增带。DNA片段扩增及DNA连接PCR讲解 1)1)引物特异性差引物特异性差,引物与靶序列不完全互补、或形成引物二聚体。其对策:必要时，重新设计引物。2)2)模板或引物浓度过高模板或引物浓度过高 3)3)酶量过多或质量不好酶量过多或质量不好 4)Mg4)Mg2+2+浓度偏高浓度偏高 5)5)退火温度偏低退火温度偏低 6)6)循环次数过多循环次数过多 原原因因 非特异性扩增DNA片段扩增及DNA连接PCR讲解 拖尾 现象：现象：产物在凝胶上呈产物在凝胶上呈Smear状态状态 M 1 2DNA片段扩增及DNA连接PCR讲解1)1)模板不纯或降解模板不纯或降解2)Buffer2)Buffer不合适不合适3)3)退火温度偏低退火温度偏低4)4)酶量过多或质量差酶量过多或质量差5)dNTP5)dNTP、MgMg2+2+浓度偏高浓度偏高6)6)循环次数过多循环次数过多 原原因因 拖尾 如果是在低分子量部分有smear,可能是引物dimer,应当减少引物量，或更换引物。如果是在高分子量部分有smear,可能是高分子的DNA模板，应减少模板量，或减少循环数。