多聚酶链式反应(PCR)PPT

多聚酶链式反应扩增多聚酶链式反应扩增DNA片段片段教材内容教材内容:基础知识基础知识 (一一)PCR原理原理 (二二)PCR的反应过程的反应过程实验操作实验操作操作提示操作提示结果分析与评价结果分析与评价课题延伸课题延伸练习练习一、课题目标一、课题目标n本课题通过本课题通过尝试尝试PCR（DNA多聚酶链式反应）技术的基多聚酶链式反应）技术的基本本操作操作，使学生，使学生体验体验PCR这这一常规的分子生物学实验一常规的分子生物学实验方方法法，理解理解PCR的的原理原理，讨论讨论PCR的的应用应用 教材分析教材分析二、课题重点与难点二、课题重点与难点n课题重点：课题重点：PCR的原理和的原理和PCR的基本操作。的基本操作。n课题难点：课题难点：PCR的原理。的原理。教材分析教材分析三、课题背景分析三、课题背景分析n课题背景首先介绍了课题背景首先介绍了PCR是一种在体外迅速是一种在体外迅速扩增扩增DNA片段的技术，然后说明这一技术在片段的技术，然后说明这一技术在遗传疾病的诊断、刑侦破案、古生物学、基遗传疾病的诊断、刑侦破案、古生物学、基因克隆等方面都有着广泛的应用，最后指出因克隆等方面都有着广泛的应用，最后指出本课题的目标是了解本课题的目标是了解PCR技术的基本原理，技术的基本原理，并尝试用并尝试用PCR技术扩增技术扩增DNA片段片段。教师在导。教师在导入本课题的学习时，可以先让学生谈一谈对入本课题的学习时，可以先让学生谈一谈对PCR的认识以及的认识以及PCR的应用，以激发学生的的应用，以激发学生的学习兴趣，然后再说明本课题的目标。学习兴趣，然后再说明本课题的目标。教材分析教材分析四、基础知识分析与教学建议四、基础知识分析与教学建议n（一）（一）PCR原理原理n知识要点：知识要点：1.细胞内参与细胞内参与DNA复制的各种组成复制的各种组成 成分与反应条件；成分与反应条件；2.DNA的合成方向；的合成方向；3.Taq DNA聚合酶的应用。聚合酶的应用。教材分析教材分析（一）（一）PCR原理原理 教学建议：教学建议：n 理解理解PCR的原理，需要首先了解细胞内参的原理，需要首先了解细胞内参与与DNA复制的各种组成成分与反应条件。复制的各种组成成分与反应条件。教师在教学过程中，可以首先引导学生回教师在教学过程中，可以首先引导学生回忆必修忆必修2遗传与进化遗传与进化中的有关中的有关DNA复制复制的知识。在此基础上，的知识。在此基础上，学生需要进一步了学生需要进一步了解解DNA双链的方向，能够区分双链的方向，能够区分DNA的的3端端和和5端端。此外，学生还需要了解。此外，学生还需要了解DNA聚合聚合酶的特性，如只能酶的特性，如只能从从DNA的的3端开始延伸端开始延伸DNA链、链、而不能从头合成而不能从头合成DNA等。等。教学建议教学建议（一）（一）PCR原理原理 教学建议：教学建议：nTaq DNA聚合酶的应用，解决了高聚合酶的应用，解决了高温导致温导致DNA聚合酶失活的问题，促聚合酶失活的问题，促成了成了PCR技术的自动化，是一个重技术的自动化，是一个重要的知识点。教师可以结合专题要的知识点。教师可以结合专题2中中课题课题2“土壤中分解尿素的细菌的分土壤中分解尿素的细菌的分离与计数离与计数”Taq细菌的发现过程，细菌的发现过程，帮助学生加深理解。帮助学生加深理解。教学建议教学建议（二）（二）PCR的反应过程的反应过程n知识要点：知识要点：PCR的基本步骤及每个步骤所发生的变化。的基本步骤及每个步骤所发生的变化。教材分析教材分析（二）（二）PCR的反应过程的反应过程 教学建议：教学建议：n这部分内容的教学应以读图识图为主。教这部分内容的教学应以读图识图为主。教科书中图科书中图5-9“PCR反应过程图解反应过程图解”详细地详细地描绘了描绘了参与参与PCR的各组成成分的各组成成分；每一轮反；每一轮反应的应的三个基本步骤三个基本步骤变性、复性和延伸变性、复性和延伸；每一轮中每一个步骤所发生的变化，即每一轮中每一个步骤所发生的变化，即每每个步骤所具有的作用个步骤所具有的作用。教师在教学中可以。教师在教学中可以请学生在读图的同时，结合教科书中的文请学生在读图的同时，结合教科书中的文字说明来加深理解。当学生遇到难以理解字说明来加深理解。当学生遇到难以理解的地方时，教师要及时给予解答。的地方时，教师要及时给予解答。教学建议教学建议(一一)PCR原原理理n体内体内DNA复制复制:n模板模板DNAn原料原料:dNTPn酶酶:解旋酶、解旋酶、DNA pol.n起始引物、合成方向起始引物、合成方向n合成环境合成环境nn解链解链模板变性模板变性n引物引物-起始起始引物引物-模板复性模板复性n子链延伸子链延伸子链延伸子链延伸(一一)PCR原理原理加样器的使用加样器的使用结果分析与评价结果分析与评价n此为紫外光吸收检此为紫外光吸收检测的结果检验法，测的结果检验法，实践中很少用；实践中很少用；普遍采用普遍采用琼脂糖凝琼脂糖凝胶电泳法胶电泳法检验检验PCR结果结果Fig.7.23DenatureAnneal PCR PrimersExtend PCR Primersw/TaqRepeat多聚酶链式反应（多聚酶链式反应（PCR）扩增扩增DNA片段片段 一、实验目的一、实验目的 n了解了解PCR的基本原理，学的基本原理，学习习PCR的基本操作技术。的基本操作技术。二、实验原理二、实验原理 n 多聚酶链式反应（多聚酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，简称简称PCR）是体外酶促合成特异）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方片段的一种方法。典型的法。典型的PCR由高温变性、低温退火和适温延伸三步由高温变性、低温退火和适温延伸三步反应组成一个循环周期，通过多次循环反应，使目的反应组成一个循环周期，通过多次循环反应，使目的DNA得以迅速扩增。其原理如下：将待扩增的得以迅速扩增。其原理如下：将待扩增的DNA置置于高温下使之解链，人工合成的两个寡核苷酸引物在低于高温下使之解链，人工合成的两个寡核苷酸引物在低温下分别与目的片段两侧的两条链互补结合；温下分别与目的片段两侧的两条链互补结合；DNA聚聚合酶在合酶在72将单核苷酸从引物的将单核苷酸从引物的3端开始掺入，沿模端开始掺入，沿模板板53端方向延伸，合成端方向延伸，合成DNA的新互补链。反复进行的新互补链。反复进行这种变性、退火和延伸反应循环，可使两引物限定范围这种变性、退火和延伸反应循环，可使两引物限定范围内的内的DNA序列以指数形式扩增。循环的次数主要取决序列以指数形式扩增。循环的次数主要取决于模板的浓度，从理论上讲一个模板于模板的浓度，从理论上讲一个模板DNA分子经分子经20次次循环扩增后可达循环扩增后可达106。PCRPCR的基本原理的基本原理 变性、复性、半保留复制变性、复性、半保留复制一生二，二生四，四生万物一生二，二生四，四生万物 PCR PCR三步曲三步曲变性变性 90909797退火退火 45456565延伸延伸 7272左右左右PCRPCR过程过程(二二)PCR的反应过程的反应过程n变性变性-复性复性-延伸延伸n多重循环多重循环(n)n模板以模板以2En扩增扩增短片段以指数式扩增短片段以指数式扩增长片段以线性式扩增长片段以线性式扩增最终主产物片段长度最终主产物片段长度在在P1-P2之间之间nPCR技术广泛应用于分子生物学等各个领技术广泛应用于分子生物学等各个领域。它既可用于基因的分离、克隆和核苷域。它既可用于基因的分离、克隆和核苷酸序列分析，又可用于突变体和重组体的酸序列分析，又可用于突变体和重组体的构建、基因表达调控和研究、基因多态性构建、基因表达调控和研究、基因多态性的分析、遗传病和传染病的诊断、肿瘤机的分析、遗传病和传染病的诊断、肿瘤机制的探索及医学鉴定等多方面，也被广泛制的探索及医学鉴定等多方面，也被广泛运用于刑侦物证鉴定、亲子鉴定及古分子运用于刑侦物证鉴定、亲子鉴定及古分子系统学研究等其他领域。系统学研究等其他领域。三、实验材料、器材及试剂三、实验材料、器材及试剂 n待扩增的模板待扩增的模板DNA；nDNA热循环仪，电泳仪，电泳槽，台式离心机热循环仪，电泳仪，电泳槽，台式离心机，紫外检测仪，紫外检测仪，1.5ml离心管架，移液器，离心管架，移液器，1.5ml离心管，离心管，0.2ml离心管，枪头等。离心管，枪头等。ndNTPs，Taq酶，引物一对，酶，引物一对，10PCR Reaction Buffer，TdH2O PCR PCR反应体系的五要素反应体系的五要素：引物、酶、引物、酶、dNTPdNTP、模板和、模板和MgMg2+2+Taq DNATaq DNA聚合酶聚合酶 来自水生栖热菌来自水生栖热菌 Thermus aquaticusThermus aquaticus 良好的耐热性良好的耐热性 MgMg2+2+依赖性依赖性 无校读功能无校读功能n 1.PCR反应反应 nPCR反应混合液的配制（反应混合液的配制（n为反应数）：为反应数）：n n2.0l 反应缓冲液（即反应缓冲液（即10PCR 反应缓冲液反应缓冲液 其中含其中含15mM MgCl2）n n2.0l dNTP(2mM,each)n n1.5l 引物引物F(2M)n n1.5l 引物引物R(2M)n n0.1l Taq酶酶(5U/l)n 混匀混匀,取取19l分别加入分别加入n个个0.2ml PCR管中管中,各管加入各管加入模板模板DNA 1l,轻轻用手摔一下轻轻用手摔一下.n无菌薄壁管中无菌薄壁管中顺序加入顺序加入反应体系各成分反应体系各成分:双双/三蒸水三蒸水 l 10缓冲液缓冲液 2.5 l 25mmol/L Mg2+2.5 l 4 dNTP 2.0 l 50umol/L引物引物12.0 l 50umol/L引物引物22.0 l 模板模板DNA 1-2 lTaq DNA多聚酶多聚酶1.0 l 25.0 l轻弹管壁，使各成分充分混匀！轻弹管壁，使各成分充分混匀！实验操作（实验操作（1）PCR反应体系：反应体系：四、实验步骤四、实验步骤 实验操作（实验操作（2）n设定循环程序设定循环程序:阶一阶一:94943m 3m 阶二阶二:(949430s-30s-55 55 1m1m-72721m1m )25253535循环循环阶三阶三:72725 510m10mPCR反应在带热盖的反应在带热盖的PCR仪上进行仪上进行,大约需要两个半小时大约需要两个半小时.操作提示操作提示n1、一切器具均经高压灭菌、一切器具均经高压灭菌-烘干烘干-冷却后使用；冷却后使用；n2、各试剂小份分装，、各试剂小份分装，-20 保存，现用现取；保存，现用现取；n3、酶的取用不离开冰浴；、酶的取用不离开冰浴；n取液吸头、离心管均取液吸头、离心管均一次一次性性使用，及时更换；使用，及时更换；2.PCR产物的检测产物的检测 n制备制备1.0%的琼脂糖凝胶的琼脂糖凝胶 n取取5l PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳产物进行琼脂糖凝胶电泳,紫外检测仪下观察紫外检测仪下观察,记录结果记录结果.n电泳结果电泳结果有无目标条带出现有无目标条带出现，可判别，可判别+/-结果；结果；n根据条带根据条带宽度和亮度宽度和亮度，可直观判断扩增产量；，可直观判断扩增产量；n关于关于PCR假阴性、假阳性及非特异扩增问题。假阴性、假阳性及非特异扩增问题。电泳检验电泳检验PCR结果、分析与评价结果、分析与评价PCR扩增扩增NGF基因（大鼠）基因（大鼠）rat beta-nerve growth factor sequence5-301 gttctacact ctgatcacag cgtttttgat cggcgtacag gcagaaccgt acacagagat361 caatgtccca gagggagact ctgtccctga agaccactgg actaaacttc agcattccct421 ctgacacagcc ctacgcagag cccgcagtgc ccctgctgaa ccaatagctg cccgtgtgac481 agggacgacc cgcaacatca ctgtggaccc caaactgttt aagaaacgga gactccgttc541 accccgcgtg ctgtttagca cccagcctcc caaactgttt aagaaacgga gactccgttc -3Perim 1:(5)gat cgg cgt aca ggc aga ac(3)328-347Perim 2:(3)cgc ggg gtg aac gga gtc tc(5)529-548 预期扩增长度：预期扩增长度：220bpDNA Marker NGF2000bp1000bp750bp500bp250bp100bp220bp PCR PCR引物设计引物设计 一对引物，分别与靶一对引物，分别与靶DNA5DNA5和和3 3端互补端互补 长度：长度：15153030个核苷酸个核苷酸 引物内、引物间不应有互补序列引物内、引物间不应有互补序列 引物与非特异扩增区无同源性引物与非特异扩增区无同源性引物的设计可以参照：引物的设计可以参照：两分钟两分钟StepByStep学会引物设计软件学会引物设计软件 Primer premier5.0/oligo软件软件 核酸基因技术讨论版核酸基因技术讨论版/生物信息学讨论版生物信息学讨论版/PCR技术讨论版技术讨论版引物设计：引物设计：1.长度在长度在15-30bp，GC含量在含量在45-55%之间。之间。Tm=4(G+C)+2(A+T)。2.碱基分布表现出随碱基分布表现出随机机性，避免相同碱基连续性，避免相同碱基连续 排列。排列。3.3不能与引物内部互补，以免形成二级结构。不能与引物内部互补，以免形成二级结构。4.两个引物各自的两个引物各自的3不能互补，以免形成自身不能互补，以免形成自身 扩增。扩增。5.引物必须经引物必须经GenBank查询后，证实没有与其他查询后，证实没有与其他 非目的非目的DNA高度互补，才能使用。高度互补，才能使用。PCRPCR的反应特点的反应特点特异性强特异性强灵敏度高灵敏度高：PCRPCR产物的生成量是以指数方式增产物的生成量是以指数方式增加的，能将加的，能将pg=10pg=10-12-12级的起始待测模板扩增级的起始待测模板扩增到微克到微克(g=10 g=10-6-6)水平水平简便、快速简便、快速：PCRPCR反应一般在反应一般在2 24 4 小时完成小时完成扩增反应扩增反应 对标本的纯度要求低对标本的纯度要求低：DNA DNA 粗制品可作为扩增模板。可直接用粗制品可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体液、毛发、细胞、活组临床标本如血液、体液、毛发、细胞、活组织等扩增检测织等扩增检测五、注意事项五、注意事项 n使用的全部溶液都应该没有核酸和核使用的全部溶液都应该没有核酸和核酸酶的污染酸酶的污染.n所有所有PCR试剂中使用的水都应该是最试剂中使用的水都应该是最高质量的三蒸水高质量的三蒸水.n 所有试剂都应该以大体积配制所有试剂都应该以大体积配制,试验一试验一下是否满意下是否满意,然后再分装成仅够一次使用的然后再分装成仅够一次使用的量储存量储存,从而确保每次扩增实验之间的一致从而确保每次扩增实验之间的一致性性.普通高中课程普通高中课程 标准实验教科书标准实验教科书 生物生物 选修选修 1生物技术实践生物技术实践专题专题4 DNA与蛋白质技术与蛋白质技术课题课题2 多聚酶链式反应扩增多聚酶链式反应扩增DNA片段片段n课程标准课程标准n具体内容标准具体内容标准尝试尝试PCR（DNA多聚酶链式反应）多聚酶链式反应）技术的技术的基本操作基本操作和和应用应用。n活动建议活动建议用某一用某一DNA片段进行片段进行PCR扩增扩增。37 刚才的发言，如刚才的发言，如有不当之处请多指有不当之处请多指正。谢谢大家！正。谢谢大家！