肿瘤个体化治疗检测技术指南

肿瘤个体化治疗检测技术指南（试行）前言肿瘤的个体化治疗基因检测已在临床广泛应用，实现肿瘤个体化用药基因检 测标准化和规范化，是一项意义重大的紧迫任务。本指南从诊断项目的科学性、 医学实验室检测方法的准入、样本采集至检测报告发出的检测流程、实验室质量 保证体系四个方面展开了相关论述，使临床医生能够了解所开展检测项目的临床 目的、理解检测结果的临床意义及对治疗的作用；医学实验室为患者或临床医护 人员提供及时、准确的检验报告，并为其提供与报告相关的咨询服务。检测技术 的标准化和实验室准入及质量保证对临床和医学实验室提出了具体的要求，以最 大程度的保证检测结果的准确性。本指南是参考现行相关的法规和标准以及当前认知水平下制定的，随着法 规和标准的不断完善，以及肿瘤个体化治疗靶点基因的不断发现，本技术规范相 关内容也将进行适时调整。本指南起草单位：中国医学科学院肿瘤医院分子肿瘤学国家重点实验室、苏 州生物医药创新中心，经国家卫生计生委个体化医学检测技术专家委员会、中国 抗癌协会相关专业委员会、中华医学会检验医学分会、中华医学会肿瘤学分会的 专家修订。本指南起草人：詹启敏、曾益新、王珏、姬云、钱海利、李晓燕、孙石磊1. 本指南使用范围错误!未定义书签。2. 简介错误!未定义书签。3. 标准术语和基因突变命名错误!未定义书签。标准术语错误!未定义书签。基因突变命名错误!未定义书签。参考序列错误!未定义书签。各类变异错误!未定义书签。4. 分析前质量保证错误!未定义书签。样本类型及获取错误!未定义书签。采样质量的评价错误!未定义书签。样本采集中的防污染 错误!未定义书签。样本运送和保存错误!未定义书签。5. 分析中质量保证错误!未定义书签。实验室设计要求错误!未定义书签。检测方法错误!未定义书签。DNA提取方法与质量控制错误!未定义书签。RNA提取方法与质量控制错误!未定义书签。试剂的选择、储存及使用注意事项 错误!未定义书签。核酸扩增质量控制 错误!未定义书签。设备维护和校准错误!未定义书签。人员培训错误!未定义书签。方法的性能验证错误!未定义书签。6.分析后质量保证错误!未定义书签。检测结果的记录错误!未定义书签。失控结果的记录与分析错误!未定义书签。报告及解释错误!未定义书签。记录保留错误!未定义书签。检测后基因咨询错误!未定义书签。样本（及核酸）保留与处理错误!未定义书签。检测与临床数据收集与分析错误!未定义书签。7.肿瘤个体化医学检测的质量保证错误!未定义书签。标准操作程序错误!未定义书签。质控品室内质量控制室间质量评价PCR污染控制错误!未定义书签错误!未定义书签错误!未定义书签错误!未定义书签附录入：常见的检测项目错误!未定义书签。基因突变检测项目错误!未定义书签。基因表达检测项目错误!未定义书签。融合基因检测项目错误!未定义书签。基因甲基化检测项目错误!未定义书签。参考文献:错误!未定义书签。1. 本指南使用范围本指南由国家卫生计生委个体化医学检测技术专家委员会制定，是国家卫生 计生委个体化医学检测指南的重要内容，旨在为临床分子检测实验室进行肿瘤个 体化用药基因的检测提供指导。本指南的主要适用对象为开展个体化医学分子检 测的医疗机构临床分子检测实验室。2. 简介肿瘤个体化治疗以疾病靶点基因诊断信息为基础，以循证医学研究结果为依 据，为患者提供接受正确治疗方案的依据，已经成为现代医学发展的趋势。临床 研究证实，通过检测肿瘤患者生物样本中生物标志物的基因突变、基因SNP分型、 基因及其蛋白表达状态来预测药物疗效和评价预后，指导临床个体化治疗，能够 提高疗效，减轻不良反应，促进医疗资源的合理利用。3. 标准术语和基因突变命名标准术语1）基因（Gene）:是遗传物质的最小功能单位，是指具有一定生物学意义的一段 DNA。2）突变（Mutation）:是细胞中DNA核苷酸序列发生了稳定的改变。3）融合基因（Fusion gene）:是指两个基因的全部或一部分的序列相互融合为 一个新的基因的过程。融合基因的表达产物为融合蛋白。4）基因表达（Gene Expression）：是基因中的DNA序列生产出蛋白质的过程。 步骤从DNA转录成mRNA开始，一直到对于蛋白质进行翻译后修饰为止。5）基因扩增（gene amplification）：为一特异蛋白质编码的基因的拷贝数选择 性地增加而其他基因并未按比例增加的过程。6）DNA甲基化（DNA Methylation）：为DNA化学修饰的一种形式，将甲基添加 到DNA分子上，例如在胞嘧啶环的5碳上。DNA甲基化能在不改变DNA序列的前 提下，将DNA甲基化状态遗传至下一代细胞或个体。7）聚合酶链反应（PCR）：是一种体外扩增特异DNA片段的技术。利用DNA在体外 摄氏高温时变性会变成单链，低温时引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再 调温度至DNA聚合酶最适反应温度，DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖（5-3）的方 向合成互补链。8）质控品：是含量或成分已知的处于与实际样本相同的基质中的特性明确的物 质，这种物质通常与其他杂质混在一起，专门用于质量控制目的的样本或溶液。基因突变命名人类基因组突变学会（HGVS）已建立系统的基因突变命名方法。具体基因突 变命名方法可查阅网站。HGVS基因突变命名指南根据需求不断更新。本文以2011 年8月更新版本为准。当描述某一序列改变时，其前缀表明其参考序列类型。例如“g. ”表示基因 组序列，“c.”表示cDNA序列，“m. ”表示线粒体DNA序列，“r.”表示RNA序列， “p. ”表示蛋白序列。在数据库中的收录号以及版本号应当在实验记录报告中列 出，当两种突变在反式（intrans）中检测到，则用方括号表示。例如，CF突变 为杂合性突变（508号苯丙氨酸缺失和1303号天冬酰胺被赖氨酸替代），则在DNA 水平规范描述方式为c.1521_1523delCTT + 3909CG。参考序列美国国立生物技术信息中心（NCBI）收录的参考序列编码具有权威性及唯一 性。其中前缀“NM_”表示为mRNA序列，“NP_”表示多肽序列，“NG_”表示基 因组序列。基因组参考序列应列出完整基因序列，包括5以及3非编码区（UTR）。 当使用某段编码DNA参考序列描述突变时，应选择合适的转录体，且转录体的起 始转录点应当明确，例如选择最常见的转录体，或者是已知的最大转录体，或者 具有组织特异性的编辑转录体。当某一参考序列具有多种转录方式时，选择NCBI 数据库里注释最全面的版本。各类变异3.4.1 DNA序列变异术语规范DNA核苷酸用大写字母A （腺嘌呤）、C （胞嘧啶）、G（鸟嘌呤）以及T （胸腺 嘧啶）来表示。用正链来表示DNA序列。当DNA序列改变时，以相应核苷酸所在 位置及相应字母来描述。“”符号表示“从某一变化至另一”。在描述突变方式 时，数字、字母、箭头、上标以及下标之间不应出现空格。3.4.2 RNA序列变异术语规范RNA序列以小写字母a （腺嘌呤）、c （胞嘧啶）、g （鸟嘌呤）、u （尿嘧啶） 进行描述。RNA序列改变描述方式与DNA相类似。具体术语可参阅HGVS网站（）。3.4.3蛋白质序列变异术语规范蛋白质序列改变通常以单个字母或三个字母（第一个字母大写）来描述。尽 管单个字母描述氨基酸明确无误，但是由于三联密码子相对于其编码的氨基酸存 在冗余性，具体给出发生突变的三联体密码子可以更清楚地描述氨基酸改变方 式。例如，用来描述氨基酸的A （丙氨酸）、C （半胱氨酸）、G （甘氨酸）以及T （苏氨酸）可能会与核苷酸字母A （腺嘌呤）、C （胞嘧啶）、G （鸟嘌呤）以及T （胸腺嘧啶）相混淆。3.4.4错义突变及无义变异术语规范由于三联体密码子的简并性，多个位点核苷酸的改变可能不影响最终氨基酸 序列。因此，应该分别从DNA水平和氨基酸水平描述突变。从DNA水平对某一突 变位点的描述方式包括碱基位点，正常碱基，”符号，突变碱基。例如，某一 蛋白第551号氨基酸残基由G （甘氨酸）突变为D （天冬氨酸），从DNA水平描述 即A。在氨基酸水平，由于错义突变的产物以氨基酸残基位点以及表示氨基酸的单 字母或三联体密码子来描述。表示方法是野生型的氨基酸、位点、突变氨基酸， 三者之间不要有空格。例如，表示该蛋白中551号甘氨酸残基3）被天冬氨酸 残基（D）所代替。无义突变表示方法与之相类似。需要指出的是X符号代表 终止密码子。例如，表示542位点的甘氨酸残基被终止密码子所代替。3.4.5缺失和插入术语规范缺失和插入突变分别用前缀“del ”和“ins”来表示，并注明突变位点以及 碱基。例如，表示在该DNA序列中441号位点发生A碱基缺失。表示在该DNA 序列中从241号到243号缺失ATC三个碱基。在蛋白水平，上述突变描述方式为，表示该蛋白质中第24号的异亮氨酸残 基发生缺失。“indels ”则表示该段序列缺失的同时有片段插入。例如， 234_239delAATTCGinsTA （或者 234_239delinsTA）表示该 DNA 序列 234 至 239 号位点缺失AATTCG六个碱基，同时该段位点被新插入的TA碱基所替代。3.4.6移码突变术语规范移码突变用“fs”符号来表示。“fs*#”则用于进一步描述突变类型。例如， *21表示该蛋白发生移码突变，第62号氨基酸由组氨酸突变为脯氨酸并产生新 的阅读框架，终止于第62号密码子下游21号密码子处。该突变也可简要描述为, 即该蛋白从第62号密码子发生移码突变。3.4.7碱基重复序列HGVS推荐，核苷酸重复序列基因多态性描述时通常以一个重复序列为单元, 后面加上“重复的次数”，如CGG55。当重复序列的次数在一个范围之内时, 需要在小括号“（）”中标注出可能的最少的和最高的重复次数，如某个人HTT 基因中发现有12个和15个CAG重复，基因水平的表示如下：12 + 15，蛋白 水平则表示为：12 + 15HTT基因的重复序列范围则描述为：（27_35）或 (27_35)。3.4.8遗传药理学基因型术语规范最广泛使用的命名法描述遗传药理学基因型不同于其他遗传学基因检测，例 如代谢相关基因细胞色素P450家族，人类细胞色素P450（CYP）等位基因命名 委员会（）推荐用“*”命名，见图1。在该系统中，最常见的等位基因被指定 为“* 1”。Cytochipm里 F450 1 D 6 4Superfamily1Family Subfamily Isoenzyme Allele variant图1.细胞色素P4502D6等位基因命名规范3.4.9其他对于更复杂的突变，可参考HGVS（）建议的命名规则，解决其他复杂的变 异的命名。4. 分析前质量保证样本类型及获取4.1.1新鲜组织（包括手术和活检组织）肿瘤新鲜冷冻材料可提取出最高品质的DNA、RNA。在手术现场取样的情况也 比较多，但需要在显微镜下确认肿瘤细胞含量。周围炎症严重的肿瘤、黏液产生 过高的肿瘤、病变中心广泛纤维化的肿瘤细胞不能采集，以免产生假阴性结果。切割后取其中一半，并利用另一半切面制作组织标本，然后进行确认。手术切除的组织样本理想的保存方法是迅速置于液氮中，然后保存于液氮罐 或-80C冰箱，这一过程应在手术样本离体后30分钟内完成。由于组织样本通常 需先进行病理学分析，在分析完成后应尽早将组织样本置于稳定剂中，避免核酸 降解。4.1.2 石蜡包埋组织（formalin-fixed paraffin-embedded, FFPE）10%中性福尔马林固定手术切除样本，按病理学操作规范进行取材。制作石蜡切片时，切取5片连续切片，其中1片进行HE染色，确认肿瘤细胞 的含量。在高灵敏度检测方法中，可考虑使用活检标本。DNA容易受固定的影响，长时间（1周以上）浸泡在福尔马林中的样本的DNA 会被片段化，不能检出突变。活检材料的固定时间一般是24小时，对于穿刺等 活检样本，固定时间控制在624小时为佳。4.1.3胸腹水等细胞学样本用胸腹水中的肿瘤细胞用于基因检测时，必须确认肿瘤细胞，穿刺获得胸腹 水样本提交给细胞病理检查之后，剩余液体冷藏/冷冻保存，也可在含有细胞成 分的离心沉淀中加入含有蛋白质变性剂的缓冲液（AL缓冲液，Qiagen公司）等 室温保存。由于细胞学样本的肿瘤细胞含量较低，因此必须使用高灵敏度检测方 法。4.1.4血浆样本循环DNA（circulating free DNA, cfDNA）是存在于血浆中的游离DNA,肿瘤 来源的DNA占血浆游离DNA的比例在不同肿瘤及病例中相差悬殊（93%）,从而 限制了外周血在肿瘤分子检测时的应用。目前已有多篇文献证实可利用从血浆游 离DNA检出突变，但需要使用ARMS法等灵敏度非常高的检测方法。采集外周血提取血浆游离DNA进行检测，取样时应使用一次性密闭EDTA抗 凝真空采血管，采集610ml全血，冷藏运输，6小时内分离血浆，提取游离DNA, 保存到-80C冰箱中，并避免反复冻融。如外周血需长时间运输，建议用商品化 的游离DNA样本保存管，在常温条件下，cfDNA在全血中可稳定保存7天。采样质量的评价肿瘤细胞是否存在，是开展肿瘤个体化治疗基因检测的重要前提。如果要确 认肿瘤细胞存在，与病理诊断医生密切合作是非常必要的。采样评价内容包括：细胞组成、肿瘤细胞的数量，是否按照要求进行处理与 运输。评价方法包括肉眼观察、显微镜下观察和浓度分析等。肿瘤组织切片等应经病理医师审阅，取一张切片HE染色后显微镜下观察， 确保肿瘤细胞存在，并记录肿瘤组织含量，标注肿瘤细胞密集区域。样本采集中的防污染样本采集最好采用一次性材料，不用处理便可直接使用；制备不同患者病理切片样本时，需更换新刀片，并清除操作器皿上先前样本 的残留；采集中要特别注意防止污染，防止混入操作者的毛发、表皮细胞、痰液等； 如使用玻璃器皿，必须经高压灭菌，以使可能存在的DNase失活； 如提取RNA样品，必须采用RNase抑制剂措施和无RNase材料。样本运送和保存原则上按照个体化医学检测质量保证指南要求进行。实验室应建立详细的样本运送标准操作规程（SOP），对临床医生提供样本采 集手册，要求物流人员填写相关运送记录表，确保运送过程中样本的安全性和过 程的可控性。需要转送的样本：用于RNA检测的样本，如果未经稳定化处理，则必须速冻 后，放在干冰中运送。经过适当稳定化处理的样本可在常温下运送，如用于DNA扩增检测的EDTA 抗凝全血样本及用于RNA扩增检测的经稳定化处理的样本。5. 分析中质量保证实验室设计要求原则上按照个体化医学检测质量保证指南要求进行。在符合国家卫生 计生委要求的个体化医学检测实验室和通过审核验收的临床基因扩增检验实验 室完成。检测方法5.2.1 Sanger 测序法5.2.1.1技术原理Sanger测序法即双脱氧链终止法(Chain Termination Method),利用一种 DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为 止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核 苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于 ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T 或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相 对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共 同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大 小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。5.2.1.2技术特点该方法是DNA序列分析的经典方法，最直接的、可检测已知和未知突变的一 种方法。由于该方法可直接读取DNA的序列，因此被认为是基因分型的金标准。主要优点：测序长度较长，可发现新的变异位点，包括一些新的少见的突变 形式及突变的确切类型，如点突变、片段缺失。局限性：灵敏度不高，突变等位基因需要超过20%才能检出。对样本中肿瘤 细胞的含量和比例要求较高，一般要求肿瘤细胞含量不低于50%，如果肿瘤细胞 比例低于50%，则假阴性出现的概率会显着增加；不适用于活检或细胞学样本。5.2.2 焦磷酸测序法(Pyrosequencing)5.2.2.1技术原理焦磷酸测序技术是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应。 当测序引物与模板DNA退火后，在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷 酸腺苷双磷酸酶等4种不同酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP聚合时释放 的焦磷酸基团(PPi)与一次荧光信号的释放偶联起来，通过检测荧光的释放和 强度，达到实时测定DNA序列和定量分析序列变化的目的。5.2.2.2技术特点焦磷酸测序技术是一种新型的酶联级联测序技术，其重复性和精确性可与Sanger测序相媲美，而测序速度则大大提高，非常适合对已知的短序列进行重 测序分析。主要优点：检测灵敏度为10%，相对Sanger测序法高，对体细胞突变和甲 基化等可实现定量检测；分型准确可靠，通量较高，实验设计灵活，可发现新的 突变或遗传变异。局限性：测序长度较短，不能对长片段进行分析。检测灵敏度中等，难以检 出低于10%的突变。不适用于活检或细胞学样本。5.2.3新一代测序 (next generation sequencing， NGS)5.2.3.1技术原理NGS又称大规模平行测序(MPS)，包含多种可以一次性产生大量数字化基因 序列的测序技术，是继Sanger测序的革命性进步，采用平行测序的理念，能够 同时对上百万甚至数十亿个DNA分子进行测序，实现了大规模、高通量测序的目 标。不同厂家的产品测序原理不同，主要分为边合成边测序(Sequencing by synthesis，SBS)x基于 “DNA 簇”和可逆性末端终结(Reversible Terminator) 大规模平行测序、4色荧光标记寡核苷酸的连续连接反应测序和半导体芯片测 序。5.2.3.2技术特点高通量测序技术不仅可以进行大规模基因组测序，还可用于基因表达分析、 非编码小分子RNA的鉴定、转录因子靶基因的筛选和DNA甲基化等相关研究。主要优点：高通量测序技术有三大优点是传统Sanger测序法所不具备的。第 一，它利用芯片进行测序，可以在数百万个点上同时阅读测序。第二，高通量测 序技术有定量功能，样品中DNA被测序的次数反映了样品中这种DNA的丰度。第 三、利用传统Sanger测序法完成的人类基因组计划总计耗资27亿美元，而现在 利用高通量测序技术进行人类基因组测序，测序成本只需1千美金。局限性：检测灵敏度和测序深度相关，一般来说，NGS在肿瘤体细胞突变检 测时，检测灵敏度为10% ；已知的与肿瘤相关驱动基因数量有限，疾病表型和基 因型的关系还有赖于生物信息的解读，目前NGS应用于肿瘤细胞突变检测的标准 化和质量控制尚未形成共识。5.2.4扩增阻滞突变系统(ARMS) -PCR法5.2.4.1技术原理扩增阻碍突变系统(amplification refractory mutation system, ARMS) 是PCR技术应用的发展，也称等位基因特性PCR (allele-specific PCR,AS-PCR) 等，用于对已知突变基因进行检测。该法通过设计两个5端引物，一个与正常 DNA互补，一个与突变DNA互补，对于纯合性突变，分别加入这两种引物及3 端引物进行两个平行PCR,只有与突变DNA完互补的引物才可延伸并得到PCR扩 增产物。如果错配位于引物的3端则导致PCR不能延伸。5.2.4.2技术特点ARMS-PCR是目前实验室常用的基因突变检测方法。主要优点：ARMS-PCR法检测灵敏度高，可检测肿瘤细胞中突变比例为1%甚 至更低的突变基因。局限性：只能检测已知的突变类型，不能发现一些新的、未知的突变；如果 检测的突变位点或类型较多，则随着引物数目增加出现非特异性结合的概率也相 应增加；当检测位点较多时，对DNA样本量的需求增加。5.2.5高分辨率熔解曲线(HRM)法5.2.5.1技术原理高分辨率熔解曲线(high-resolution melting, HRM)是一种基于PCR新型 技术，用于检测基因变异包括未知的基因变异、单核苷酸多态性以及基因甲基化。 HRM是基于在加热过程中双链变性为单链的原则。DNA双链体的熔解温度差异反 应了基因的变异。双链DNA片段在其特定的温度熔解，熔解的温度由片段的CG 含量、序列组成、长度以及一个和多个杂合碱基决定。用DNA嵌合的染料可以看 到任何双链片段的熔解峰图，在有荧光嵌合染料的情况下PCR扩增片段，扩增后 的产物通过一个快速的可控的加热处理开始熔解。荧光水平在升温的过程中实时 监测，染料随着双链DNA的熔解，荧光信号逐渐减少。5.2.5.2技术特点由于HRM分析不受碱基突变位点和种类的限制，可用于突变扫描、基因分型、 序列匹配、DNA甲基化等方面的研究。主要优点：检测灵敏度1%,特异性高，重复性好；封闭体系，减少污染的 可能性；扩增和检测同时进行，无需PCR后进行处理。局限性：通过熔解曲线的图不能判断某一特异性的变异体，下游分析中检测 需要有测序等补充。5.2.6 数字 PCR（Digital PCR）5.2.6.1技术原理数字PCR是一种核酸分子绝对定量技术。相较于qPCR，数字PCR能够直接 数出DNA分子的个数，对起始样品绝对定量。通过将一个样本分成几万到几百万 份，分配到不同的反应单元，每个单元包含一个或多个拷贝的目标分子（DNA模 板），在每个反应单元中分别对目标分子进行PCR扩增，扩增结束后对各个反 应单元的荧光信号进行统计学分析。数字PCR技术不断发展，Bio-Radx LIFE Technologies、Fluidigm及RainDance等厂家相继推出技术较为成熟的数字PCR 产品。5.2.6.2技术特点数字PCR目前的应用包括：稀有等位基因检测、基因表达绝对定量、核酸标 准品绝对定量、二代测序文库绝对定量等。主要优点：灵敏度可达%，高特异性，可检测复杂背景下的靶标序列；可高 度耐受PCR反应抑制剂；不必依赖对照品或标准品，可对目标拷贝数直接进行精 确的鉴定，分析微小的浓度差异；实验数据分析便捷，每个微滴的检测结果以阴 性、阳性判读，数据分析自动化；可统计突变率，通过统计分析可得出靶点的突 变率。局限性：数字PCR仪通量较低，目前通常能检测的信号为FAM和HEX。一般 单个反应2重反应效果最佳；数字PCR优点是灵敏度高，但是对于DNA浓度大的 样本处理就没有优势，而且核酸浓度高时，每个微滴里面包含的拷贝数不符合泊 松分布；数字PCR虽然不依赖标准曲线，但是每次反应之间存在差异，短期内不 能代替qPCR，也不能代替其他金标准而作为首选方法。QX200等数字PCR仪目前 仅用于科研用途，数字PCR走向临床检验还需要一段时间。5.2.7荧光原位杂交（FISH）5.2.7.1技术原理荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH是通过荧光标记 的DNA探针与细胞核内的DNA靶序列杂交，并在荧光显微镜下观察分析其结果的 一种分子细胞遗传学技术。它的基本原理是：如果被检测的染色体或DNA纤维切 片上的靶DNA与所用的核酸探针是同源互补的，二者经变性-退火-复性，即可形 成靶DNA与核酸探针的杂交体。将核酸探针的某一种核苷酸标记上报告分子如生 物素、地高辛，可利用该报告分子与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学反 应，经荧光检测体系在镜下对待测DNA进行定性、定量或相对定位分析。5.2.7.2技术特点FISH主要可对基因缺失、基因融合、基因扩增进行检测。主要优点：可多种荧光标记，显示DNA片段及基因之间的相对位置与方向， 空间定位精确；灵敏、特异性好，可同时分析分裂期和间期的多个细胞，并进行 定量；可以检测隐匿或微小的染色体畸变及复杂核型。局限性：FISH检测对操作和判读技术要求较高，诊断医师必须经过严格的 FISH操作和结果判读培训，只有经FISH操作经验丰富的医师判定的结果才具有 可靠性；目前FISH检测的成本昂贵、通量低。5.2.8免疫组化(IHC)5.2.8.1技术原理免疫组化(Immunohistochemistry，IHC)分析利用抗体和抗原之间的结合 的高度特异性，借助于组织化学的方法将抗原抗体结合的部位和强度显示出来， 以其达到对组织或细胞中的相应抗原进行定性、定位或定量的研究。5.2.8.2技术特点IHC作为筛查工具优于FISH，具有经济快捷的优点，尤其适用于大量样本的 检测分析。影响IHC结果的因素主要包括抗体的选择、检测前组织的固定，观察 者解释方面的差别等。5.2.9 荧光定量:逆转录 PCR(Q-RT-PCR)5.2.9.1技术原理逆转录 PCR ( reverse transcription PCR)或者称反转录 PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)，是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。 由一条RNA单链转录为互补DNA(cDNA)称作“逆转录”，由依赖RNA的DNA聚合 酶（逆转录酶）来完成。随后，DNA的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖DNA 的DNA聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的PCR。原先的RNA模板被RNA酶 H降解，留下互补DNA。5.2.9.2技术特点荧光定量PCR是检测拷贝数变化的一种快速且经济的技术方法，该方法技术 可用于RNA表达水平检测该技术主要优点是检测快速、通量高、灵敏度好，主要 不足是对肿瘤组织提取RNA的质量要求较高，在检测基因表达量时判读标准尚未 统一。FISH、IHC和Q-RT-PCR三种方法在检测ALK基因重排时的优缺点分析见 表1。表1：FISH、IHC和Q-RT-PCR检测ALK基因重排的优缺点比较IHCFISHQ-RT-PCR检测对象蛋白DNARNA特异性+发现的融合类型已知、未知已知、未知已知通量+费用+5.2.3检测方法选择策略实验室应优选国际和国内“金标准”的检测方法，同类方法中优先选择结果 稳定性、重复性好、特异性高的技术，同时也应考虑样本量，检测项目的多少等, 综合选择合适的方法。由于肿瘤组织的异质性，检测的组织样本中混有大量正常组织、石蜡样本提 取的DNA质量和数量有限，就检测灵敏度而言，目前 ARMS-PCR焦磷酸测 序Sanger测序。在检测肿瘤基因突变时，不能一味追求检测方法的灵敏度，灵敏度高的检测 方法对整个实验过程中的质控要求更为严格，需防止因污染而产生假阳性。在肿瘤靶基因表达检测时，由于肿瘤样本的不可再生性，需谨慎选择使用的 方法，如选用荧光定量PCR要求提取的总RNA量达1g以上，如果肿瘤组织过小， 提取的RNA量可能达不到检测要求，此时应考虑选用对样本量要求低的检测方法。5.2.4检测项目本指南根据检测靶分子（DNA或RNA）类型及基因表达调控机制类型的不同， 将肿瘤个体化治疗检测项目分为基因突变、基因表达、融合基因、基因甲基化检 测四个类型。所述检测项目均为目前在肿瘤临床诊疗中，经过严格的循证医学实 验，且具有明确的临床应用价值，详见附录1。实验室在开展肿瘤个体化检测项 目时，应评估所开展的检测项目的科学性，并遵循实验室的质量管理相关规定。DNA提取方法与质量控制DNA提取之前的病理质量控制非常重要，它决定了最终检测结果的可靠性。 样本进行检测前均先行常规病理检查和诊断（HE染色），必须经有经验的病理医 师确定肿瘤细胞的百分比（肿瘤细胞/整张切片所有细胞，必要时应采取富集肿 瘤细胞的方法，如手工刮取或显微切割法。选取以肿瘤细胞为主的、没有明显的 坏死、黏液和炎性改变的组织进行检测。肿瘤细胞比例尚无统一标准，理想情况下，石蜡样本中肿瘤细胞的比例不应 低于50%,新鲜样本不低于25%,对于ARMS等敏感性较高的方法，肿瘤细胞的含 量和比例可以低一些。具体视所采用的DNA提取方法和突变检测方法的敏感度等 而定。对于新鲜和冻存的手术组织样本，可采用常规的商品化DNA提取试剂盒。对 于活检样本，推荐使用能提取石蜡包埋组织微量DNA的试剂盒。对于商品化核酸 提取试剂盒，临床实验室在使用前，必须对其核酸提取纯度和效率进行评价。 纯化的靶核酸的完整性可使用凝胶电泳将样本的核酸提取物与核酸标准品比较 测定。核酸提取的产率：可在A260读数测定，DNA可溶于TE溶液中，建议浓度控制在 50100ng/ul,总量 2040 |ig 或以上。核酸纯度：可通过提取物A260/A280比率判定，DNA的比值为，RNA的比值为。若 DNA比值高于，说明制剂中RNA尚未除尽。RNA、DNA溶液中含有酚和蛋白质将导 致比值降低。RNA提取方法与质量控制RNA提取常比较困难，尤其是保存年限较长的肿瘤组织，RNA降解非常严重。 造成RNA降解的原因有两个方面：RNA核糖残基的2和3位置带有羟基，易 被水解；生物体内和外部环境中存在大量RNA酶，并且RNA酶不易失活，高温后 仍然能够正确折叠恢复活性。因此从样本的储存、RNA的提取及保存，都需要格 外小心，防范RNase对RNA的降解作用。RNA提取的经典方法是胍盐提取结合酚-氯仿抽提，石蜡样本或活检样本可使 用商品化RNA提取试剂盒纯化。细胞或组织的彻底匀浆是RNA提取过程中关键的 步骤，它能够防止RNA的损失和降解。匀浆的方法应根据细胞或组织的类型来选 择。核酸提取的产率：RNA可溶于无RNase的纯水中，建议浓度控制在100ng/ul 以上，总量达30 口 g以上。纯化后的RNA应测定0D260/0D280比值，RNA：V0D260/0D280V（V时表明 有蛋白质或酚污染； 时表明可能有异硫氰酸残存），进行琼脂糖凝胶电泳观察 有无DNA污染和RNA的完整程度。试剂的选择、储存及使用注意事项临床检测试剂必须为CFDA批准的试剂，或具有严格标准操作规程（S0P） 的自配试剂（LDT）。所采用的测定方法特异性好，灵敏度、准确度、精密度符合国家卫生计生委 临床检验中心、IFCC、WH0等推荐的方法性能。所用标准品或标准参考物符合国 家卫生计生委临床检验中心推荐的标准和要求。核酸扩增质量控制临床PCR检测方法不但要求特异性好、灵敏度高、还要求具有高的可重复性、 准确性，尽量降低假阳性、假阴性和非特异性扩增。临床样本扩增时，经常出现 假阳性和假阴性，导致检测结果得出错误结论，有时可造成严重后果。在核酸提取中，应至少带有1份已知弱阳性质控样本。其最后的检测结果， 应是核酸提取和扩增检测有效性的综合反映。同时，还应至少带一份已知阴性质 控样本，扩增测定的结果可以判断核酸提取过程中是否发生污染。如靶核酸为DNA,为判断DNA扩增的有效性，可使用1份已制备好的弱阳性 靶DNA样本，直接与靶核酸同时扩增检测。如靶核酸为RNA，则除了可用上述弱 阳性cDNA判断DNA扩增有效性外，还可用已制备好的弱阳性RNA质控来判断反 转录的有效性。另外，须设立阴性对照样品。阴性对照样品检测为阴性时，表明 试验全部过程的试剂没有受到核酸污染。在阴性对照样品和阳性对照样品检测结 果成立的前提下，才能对检测样品扩增结果进行判定。设备维护和校准实验室仪器的保养与维护是实验室实验技术员的重要组成部分，仪器的保养 与维护关系到仪器的适用率、数据的准确率。仪器设备安装及技术性能验收需由项目负责人、仪器设备使用人、实验室技 术人员共同完成,验收内容按采购合同中技术需求部分以服务协议书的要求逐项 进行，并且建立仪器设备档案。仪器设备应定期开展校准计量，未经计量检定、计量检定不合格或未验收的 对测试有重要影响的仪器设备不得投入使用。实验室日常工作中，应重视仪器设备的清洁及维护，做到日维护、周维护、 月维护，并及时记录。人员培训检测人员应该有相关的教育背景、相应的工作经验，接受过专业培训。培 训主要有内部和外部培训，内部培训包括所使用的试剂方法原理、仪器设备操作 维护及校准、质量控制等，外部培训包括国家卫生计生委临床检验中心和国家卫 生计生委个体化医学检测培训基地等机构组织开展的各种技术培训。方法的性能验证方法学引进初期需对检测系统测定项目各参数的实验或评估性验证，包括精 密度、准确度、线性范围、临床可报告范围、特异性、检测下限、抗干扰能力等。所有项目的方法验证应形成详细的资料备存，资料需详细描述方法验证的目 的、过程、检测结果、分析判断及验证结论。验证的结果及结论须经实验室负责 人签字后才能用于临床检测。根据项目的特性，一些方法验证指标不需进行或未 进行时，需在报告中书面解释原因。推荐用打印的文稿并在专用文件夹保存。具体的性能验证方法，如使用的是经CFDA批准的试剂，可参照试剂盒说明 书上相应的性能指标部分进行验证，看是否能在其实验室内复现说明书所显示的 上述性能指标。如为自制试剂或自建方法，则参考LDT技术指南进行性能评价， 建立上述性能指标。以下方法可供参考。【准确度】1）参加国家卫生计生委临检中心组织的室间质评，从室间质评统计结果评价实 验室检测结果的偏倚或符合情况，从而评价和验证实验室检测结果的准确性。2）方法比较实验：当引进新方法与原有方法进行比较时，最少样本数为20例， 用两种方法同时测定同样的样品。如结果有不符合时，应采用第三种方法或试剂 进行确认。3）检测已知值的标准物质，对于样本来源存在问题的检测方法，可以对已知值 的样本稀释成不同浓度再检测，以评估其准确度。【灵敏度】1）分析灵敏度：就是确定检测方法的检测下限：将一份已知定值的标准品，用 野生型的基因组稀释突变型基因组，设定不同的突变含量，一直稀释到检测下限 以下为止，平行检测3管，3管全部检出且其线性|r IN的最低稀释浓度即为 该方法的检测下限。（可根据实际情况在最低稀释浓度附近进行10倍以下的稀 释）2）临床灵敏度：主要是验证方法的假阴性率。从三甲医院或专业权威检测机构 收集2050例样本，进行检测分析，其灵敏度应满足临床检测要求，灵敏度= TB/（TB+FN）X100 （TB二true positive、FN二false negative）；有 CFDA 批文 的检测试剂，收集20例阳性样本进行验证；没有CFDA批文的检测试剂或自己实 验室研发的LDT试剂，收集50例阳性样本进行验证，并应进行室间比对。【特异性】1）特异性的验证主要是确认该方法的假阳性率，特异性 二TN/（TN+FP）X100 （TN二true negative、 FN二false positive）02）从三甲医院或专业权威检测机构收集2050例阴性样本，进行检测分析，其 特异性应满足临床检测要求。有CFDA批文的检测试剂，收集20例阴性样本进行 验证；没有CFDA批文的检测项目或自己研发的项目，收集50例阴性样本进行验 证06. 分析后质量保证检测结果的记录1）检测结果的报告应准确、清晰、明确、客观和及时，杜绝虚假报告。2）仪器原始数据要仔细分析，根据质控品判断PCR扩增的有效性，只有当质控 品的扩增结果符合项目SOP有关条件时，才可发出报告，否则应重新测定。3）患者档案及测定结果一并录入“检验管理系统”。报告内容至少应包括：实验 室名称、患者姓名、性别、年龄、测定项目、检测方法、检测结果、参考范围、 用药建议及样本号、样本类型、检测日期、实验操作者、审核者、报告日期、实 验室联系方式等。否则视为无效或虚假报告单。失控结果的记录与分析如发现质控数据违背了控制规则，操作员应填写失控记录或失控报告单，上 交实验室主管，由专业主管做出是否发出与失控质控品同批患者样本检测报告的 决定。失控信号一旦出现就意味着与失控质控品同批患者样本报告可能作废。此 时，首先要尽量查明引起失控的原因，如为假失控，可由实验室指定的资深人员 决定、签字后发出报告。如为真失控，最好是纠正原因后，全部样本重新检测， 质控品测定合格后再签字发出。报告及解释1）报告的编写需要有严谨有效的流程，以确保检验信息的完整、有效、及时、 正确，并保护患者的隐私。检测结果以检测报告单的形式发放，需提供纸质版检 测报告，有条件的检测实验室可以电子版的形式发放报告，并建立网络查询系统， 送检医生通过登陆网站进行检测结果的查询。2）检验报告单的应具有患者基本信息、样本情况（采集、送检及检测时间、样 本性质及状态等）、检测项目、检测方法、结果、结果的意义、用药建议、检测 可能的局限性、检测单位联系方式、检测人员与报告审核人员签字，审核者应当 是主管技师以上的工作人员、本专业实验室负责人、中级及以上的病理医师，审 核者对检验报告的质量负责。3）结果解释的责任属于临床实验室，应根据所检测的人群解释结果。临床解释 的责任属于临床医生，其应根据检测结果和临床信息向患者解释检测结果。综合 临床分子诊断的实验数据和临床信息，为医师和患者描述此结果对疾病诊断的含 义，为个体化用药提出建议。记录保留患者和样本信息：接收样本后，在“样本接收记录本”中记录患者和样本信 息，对不符合检测要求的样本在“样本拒收登记本”上记录，并及时通知患者。样本检测申请单最后保存于扩增区，至少1年以上；其它实验记录保存于各 自实验操作区内，至少保存1年以上。检测过程实验记录保存于扩增区的专 用文件柜内，以备查找。扩增过程中由荧光扩增仪产生的数据文件必须保存在非 系统分区的专门文件夹中，定期做备份。检测后基因咨询实验室建立科学的、系统的检验结果解释方案，提供结果的解释意见。报告 单上提供咨询服务的方式和途径，如客户服务专线，配置专业的咨询服务人员； 方便临床医生和患者随时反馈意见和提出咨询。样本（及核酸）保留与处理肿瘤个体化治疗基因检测报告发出后的样本应尽可能较长期保存。实验室应 制定样本储存制度对样本进行保存，建立样本储存的规章制度，做好样本的标识 并按规定存放，保存好样本的原始标码，建立配套的样本存放信息管理系统。样本的处理和相关材料的处理要符合医疗废物管理条例、医疗卫生机构 医疗废物管理办法及国家、地区的相关要求。检测与临床数据收集与分析检测结果收集、整理分析和数据的管理也是保障临床基因检测质量的关键环 节。临床的检测结果应定期统计分析，如基因突变的阳性率，如果发现阳性率高 于资料报道值，应引起重视，考虑是否存在假阳性情况，如果阳性率偏低，应结 合检测方法的局限性考虑假阴性的可能，并进行针对性的改进。7. 肿瘤个体化治疗检测的质量保证标准操作程序原则上按照个体化医学检测质量保证指南的要求进行。肿瘤个体化治 疗的检测SOP，应包括试剂准备、样本采集、样本接收与预处理、核酸提取、检 测方法、结果分析和报告、仪器操作、实验室安全措施等临床检验的所有环节。 SOP的编写应注意通俗易懂、注重细节、清晰明了、图文并茂。实验室工作人员 应严格遵循SOP中的步骤要求进行操作，应每年定期根据实验室的运行状况进行 SOP审核修订，对于文件的修订、废止、改版或更新，要按照规定的要求，合理 且规范进行，并防止无效或作废版本文件使用。质控品检测质控品的建立是为了提高实验室检测结果的可靠性和可重复性，一般情 况下，针对发现罕见的基因突变、实验运行异常、新批次的试剂与上一批次试剂 的比对、储存条件或反应温度发生改变后的样本和试剂、验证整体测试可靠性的 样本等，都应合理设置质控品。7.2.1质控品类型阳性对照：以含有目的片段的DNA（或质粒）作为模板进行扩增，证明PCR 试剂是否有效、扩增过程是否正确。但阳性样品扩增效率高，应严格控制其浓度 和存放位置，避免其成为潜在的污染源。例如，检测基因突变时，应根据选用的 检测方法，选择该方法最低检测限的阳性样本。阴性对照：以不含有目的片段的阴性样品作为模板进行扩增，用于证明扩增 过程中无假阳性现象。空白对照：以纯水作为模板进行扩增，用于证明扩增过程中无假阳性现象。PCR抑制物对照：在与阳性对照相同的反应体系中，加入相同数量的待测样 品DNA，如果未扩增出目的片段，证明此待测样品DNA中存在PCR抑制物。空白提取对照：空白提取对照扩增结果为阳性，说明DNA提取试剂或过程中 可能受到污染。阳性提取对照：阳性提取对照扩增结果为阴性，说明提取过程可能有误。如 果DNA阳性对照扩增结果为阴性，或者DNA阴性对照和空白对照扩增结果为阳性， 则说明PCR试剂或扩增过程存在问题。基因检测单核苷酸多态性（SNP）时，需要设置多个阳性对照用于检测野生 型纯合子基因型、杂合子基因型，突变纯合子基因型。质控应尽可能模拟临床样 本，如基质或采样方法与待测样本相同。室内质量控制原则上按照个体化医学检测质量保证指南的要求进行。建议按照以下原 则设定室内质量控制:（1）如果只检测1个基因突变，定性测定有一份接近CUT-OFF（24倍）的弱 阳性和一份阴性质控样本即可。质控品的设置数量随检测样本数的增加而按比例 适当增加，例如临床样本数量达到5060份，则可将阳性和阴性质控样本的数量 翻倍。质控品应随机放置在临床样本中间随同临床样本一起同时处理。（2）当同时检测多个突变基因时，可以根据实验室自身的条件，可只设立 能最灵敏地反映检测问题的2个或3个突变基因的阴阳性质控，下次检测改用跟 上次不同的基因突变的阴阳性对照，依次类推，循环往复。另外，质控样本在扩 增仪中的位置不应持续性的固定在同一个孔，而应在每次扩增检测时，进行相应 的顺延，尽可能在一定时间内可以监测到每一孔的扩增有效性。如果每次质控品的检测结果均成立，说明结果可信，报告可以发出；反之， 就要对这种情况出现的原因进行分析。在找不到合理的解释的情况下，须将不符 合的基因突变和其相应的对照重新检测。此外，临床样本中每次检测阳性和阴性结果的出现频率，以及同一基因型或 基因突变出现频率或连续出现频率等，均可作为提示实验室“污染”的质控指标。室间质量评价临床检测实验室应参加室间质评（EQA），详细、如实地记录参与EQA的全 过程，根据反馈结果了解本实验室的能力、自查存在的问题，及时寻求改进方法， 解决问题，完善实验室质量控制体系。PCR污染控制由于肿瘤基因突变检测时必须设置阳性质控品，阳性样本加样时、PCR扩增 的产物可能成为PCR实验室的主要污染来源，而PCR的敏感性和效率特别高，所 以少量的扩增产物污染样本或反应管即可出现假阳性。尤其是PCR扩增产物和质 粒分子很容易造成实验室的污染，导致假阳性现象发生。通过规范实验室设计、 规范试剂耗材管理、规范实验室操作和技术处理来控制污染。常见的PCR污染有样品间交叉污染、PCR试剂的污染、PCR扩增产物污染、 气溶胶污染和实验室中克隆质粒的污染。污染控制：规范实验室设计、规范试剂耗材管理、规范实验室操作和技术处 理，如PCR扩增实验中使用dUTP，而不用dTTP。附录A：常见的检测项目基因突变检测项目A.1.1 EGFR基因突变检测【基因简介】EGFR是原癌基因c-erbB1的表达产物，是表皮生长因子受体（HER） 家族成员之一。HER 家族由 EGFR/HER1/erbB1、HER2/neu/erbB2、HER3/erbB3 及 HER4/erbB4四个分子构成，在细胞的生长、增殖和分化等生理过程中发挥重要 的调节作用。【常见突变】EGFR的突变主要发生在胞内酪氨酸激酶（TK）区域的前四个外显 子上（1821），目前发现的TK区域突变有30多种。缺失突变主要发生在外显 子19上，最常见的是del E746-A750，替代突变最常见的是发生在外显子21上 的L858R，复制或插入突变发生在外显子20上。发生在外显子20上的替代突变 T790M为耐药突变，研究还发现L858Q、D761Y、T854A等耐药突变。【EGFR基因突变和EGFR-TKI敏感性】EGFR-KTI的有效性也因突变类型而不同， 外显子19缺失突变的有效率为81%，L858R的有效率为71%，G719X的有效率为 56%。吉非替尼初期有效的全部患者，在后期均产生耐药。其中50%患者是在19 外显子缺失或L858R点突变等的敏感突变的基础上，又发生了第790位密码子苏 氨酸向蛋氨酸的突变（T790M）。研究发现有约13%的患者在TKI治疗前即存 在T790M，即原发耐药，这种情况下TKI治疗难以有效。【检测样本类型】经10%中性福尔马林固定、石蜡包埋的非小细胞肺癌肿瘤组 织。【检测方法】推荐ARMS或Sanger测序法进行EGFR突变检测，可考虑采用新一 代测序技术同时进行肺癌驱动基因的检测。【临床意义】（1）预测药物疗效：EGFR是HER/ErbB家族信号通路的首要分子, 吉非替尼、厄洛替尼等小分子TKI进入细胞内，直接作用于EGFR胞内的激酶区, 干扰ATP合成，抑制酪氨酸激酶的活性，阻断激酶的自身磷酸化及底物的磷酸化, 彻底阻断异常的酪氨酸激酶信号传导，从而阻止配体介导的受体及下游信号通路 的激活，阻滞细胞在G1期，促进凋亡，抑制新生血管形成、侵袭和转移，达到 治疗的作用。小分子TKI的疗效与EGFR基因突变密切相关，是TKI疗效预测因 子。（2）预后评价：根据是否使用EGFR-TKI对肺癌切除后患者进行预后分析， EGFR敏感性突变并服用TKI的患者至少在单因素分析中有预后良好的趋势。但 是，EGFR基因突变与女性、非吸烟者等这些传统的预后良好因子有交叉，只分 析基因突变进行预后评价几乎是不可能的。【用药建议】（1）吉非替尼、厄洛替尼等小分子酪氨酸激酶抑制剂的疗效与EGFR 基因发突变密切相关，特别是当第19外显子缺失、第21外显子突变（L858R） 和第18外显子突变（G719X）的患者，使用吉非替尼、厄洛替尼等小分子TKI 可获益。（2）约13%未经TKI治疗的NSCLC患者第20外显子存在T790M突变，但经TKI 治疗后超过50%后耐药的患者出现T790M突变阳性，导致TKI治疗失败。也有报 道认为L747S、D76IY、T854A突变阳性时，患者也会对吉非替尼、厄洛替尼等小 分子酪氨酸激酶抑制剂耐药。【局限性】临床实践表明，并不是所有携有EGFR突变的NSCLC患者都对酪氨酸 激酶抑制剂有效，EGFR-TKI的有效性因突变类型而不同，如对外显子19缺失突 变的肿瘤患者有效率为81%， L858R的有效率为71%，G719X的有效率为5