第6章分子生物学研究法下

第第6章章 分子生物学研究法分子生物学研究法(下下)基因功能研究技术基因功能研究技术教学目的：教学目的：1.熟悉基因表达研究技术的原理和流程。熟悉基因表达研究技术的原理和流程。2.熟悉基因敲除的原理和类型。熟悉基因敲除的原理和类型。3.熟悉基因芯片技术的原理和工作流程。熟悉基因芯片技术的原理和工作流程。4.了解利用酵母来鉴定靶基因的功能。了解利用酵母来鉴定靶基因的功能。教学重点：教学重点：各种技术的基本原理和流程。各种技术的基本原理和流程。第第6章章 分子生物学研究法分子生物学研究法(下下)基因功能研究技术基因功能研究技术 6.1 基因表达研究技术基因表达研究技术 6.2 基因敲除技术基因敲除技术 6.3 蛋白质及蛋白质及RNA相互作用技术相互作用技术 6.4 基因芯片及数据分析基因芯片及数据分析 6.5 利用酵母鉴定靶基因功能利用酵母鉴定靶基因功能 6.6 其他分子生物学技术其他分子生物学技术6.1 基因表达研究技术基因表达研究技术转录组转录组 广义上指在特定生理条件或环境下，一个广义上指在特定生理条件或环境下，一个细胞、组织或生物体中转录出来的所有细胞、组织或生物体中转录出来的所有RNA的集的集合，包括合，包括mRNA、rRNA、tRNA、sRNA。狭义上特指细胞中转录出来的所有狭义上特指细胞中转录出来的所有mRNA。通过特定生理条件下细胞内通过特定生理条件下细胞内mRNA的丰度来描述的丰度来描述基因表达水平并外推到最终蛋白质产物的丰度，基因表达水平并外推到最终蛋白质产物的丰度，是目前基因表达研究的基本思路。是目前基因表达研究的基本思路。转录组研究的基本方法包括基因芯片技术和转录转录组研究的基本方法包括基因芯片技术和转录组测序技术。组测序技术。6.1.1 转录组测序转录组测序1)表达序列标签测序表达序列标签测序(EST)原理：原理：EST是从一个随机选择的是从一个随机选择的cDNA克隆进行克隆进行5 端和端和3 端单端单向一次测序获得的短的向一次测序获得的短的cDNA部分序列，代表一个完整部分序列，代表一个完整基因的一小部分，在数据库中其长度一般从基因的一小部分，在数据库中其长度一般从20到到7000bp不等，平均长度为不等，平均长度为360120bp。EST来源于一定环境下一个组织总来源于一定环境下一个组织总mRNA所构建的所构建的cDNA文库，因此文库，因此EST也能说明该组织中各基因的表达也能说明该组织中各基因的表达水平。水平。操作流程：操作流程：组织样品组织样品mRNA的提取的提取逆转录合成逆转录合成cDNA构建构建cDNA文库文库测序。测序。2)基因表达系列分析基因表达系列分析(SAGE)原理原理:SAGE是通过快速和详细分析成千上万个是通过快速和详细分析成千上万个EST来寻找出表来寻找出表达丰富度不同的达丰富度不同的SAGE标签序列。标签序列。通过限制性酶切可以产生非常短的通过限制性酶切可以产生非常短的cDNA标签，并通过标签，并通过PCR扩增和连接，随后对连接体进行测序。扩增和连接，随后对连接体进行测序。操作流程：操作流程：以寡聚以寡聚dT为引物反转录合成为引物反转录合成cDNA，用，用锚定酶酶切锚定酶酶切。将将cDNA等分为等分为A和和B两部分，分别连接接头两部分，分别连接接头A或接头或接头B。每一种接头都含有标签酶酶切位点序列每一种接头都含有标签酶酶切位点序列.用标签酶酶切产生连有接头的短用标签酶酶切产生连有接头的短cDNA片段，混合并连接片段，混合并连接两个两个cDNA池的短池的短cDNA片段，构成双标签后，以引物片段，构成双标签后，以引物A和和B扩增。扩增。用锚定酶切割扩增产物，抽提双标签片段并克隆、测序。用锚定酶切割扩增产物，抽提双标签片段并克隆、测序。对标签数据进行处理。对标签数据进行处理。3)转录组高通量测序转录组高通量测序(RNA-Seq)原理：原理：所有的高通量测序技术都所有的高通量测序技术都能进行能进行RNA测序。测序。对对cDNA进行高通量测序，进行高通量测序，以获得来不同以获得来不同mRNA片段片段在特定样本中的含量。在特定样本中的含量。各种类型的转录本都可以各种类型的转录本都可以进行高通量检测。进行高通量检测。操作流程：操作流程：样品样品RNA准备准备cDNA文库构建文库构建DNA成簇扩增成簇扩增高通量测序高通量测序数据分析数据分析6.1.2 RNA的选择性剪接技术的选择性剪接技术RNA的选择性剪接是指用不同的剪接方式从一个的选择性剪接是指用不同的剪接方式从一个mRNA前体产生不同的前体产生不同的mRNA剪接异构体的过程。剪接异构体的过程。选择性剪接可分为：平选择性剪接可分为：平衡剪切、衡剪切、5 选择性剪切、选择性剪切、3 选择性剪切、外显子选择性剪切、外显子遗漏型剪切及相互排斥遗漏型剪切及相互排斥型剪切。型剪切。常用常用RT-PCR法研究某法研究某个基因是否存在选择性个基因是否存在选择性剪切。剪切。6.1.3 原位杂交技术原位杂交技术原位杂交技术原位杂交技术(ISH)是用标记的核酸探针，经放射是用标记的核酸探针，经放射自显影或非放射检测体系，在组织，细胞、间期自显影或非放射检测体系，在组织，细胞、间期核及染色体上对核酸进行定位和相对定量研究的核及染色体上对核酸进行定位和相对定量研究的一种手段。一种手段。原位杂交分为原位杂交分为RNA原位杂交和染色体原位杂交。原位杂交和染色体原位杂交。RNA原位杂交原位杂交 组织切片中，对特定基因的表达产组织切片中，对特定基因的表达产物物(mRNA)在细胞水平上作出定性定量分析。在细胞水平上作出定性定量分析。染色体原位杂交也称为染色体原位杂交也称为荧光原位杂交荧光原位杂交(FISH)可确可确定特定的定特定的DNA序列在染色体上的位置。序列在染色体上的位置。原理：原理：利用核酸分子单链之间有互补的碱基序列，将有放射性利用核酸分子单链之间有互补的碱基序列，将有放射性或非放射性的外源核酸或非放射性的外源核酸(即探针即探针)与组织、细胞或染色体与组织、细胞或染色体上待测上待测DNA或或RNA互补配对，结合成专一的核酸杂交分互补配对，结合成专一的核酸杂交分子，经一定的检测手段将待测核酸在组织、细胞或染色子，经一定的检测手段将待测核酸在组织、细胞或染色体上的位置显示出来。体上的位置显示出来。操作流程：操作流程：以经过标记的已知核酸分子为探针。以经过标记的已知核酸分子为探针。以细胞内与探针序列互补的特异核酸分子为靶分子。以细胞内与探针序列互补的特异核酸分子为靶分子。在一定条件下使探针与靶核酸分子在原位发生杂交。在一定条件下使探针与靶核酸分子在原位发生杂交。再对其探测。再对其探测。6.1.4 基因定点突变技术基因定点突变技术通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编码的通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编码的氨基酸序列，用于研究某个氨基酸序列，用于研究某个(些些)氨基酸残基对蛋白氨基酸残基对蛋白质结构、催化活性以及结合配体能力的影响。质结构、催化活性以及结合配体能力的影响。基因定点突变也可用于改造基因定点突变也可用于改造DNA调控元件特征序调控元件特征序列、修饰表达载体、引入新的酶切位点等。列、修饰表达载体、引入新的酶切位点等。寡核苷酸介导的基因突变指用含有突变碱基的寡聚寡核苷酸介导的基因突变指用含有突变碱基的寡聚核苷酸片断作为引物，在聚合酶的作用下启动核苷酸片断作为引物，在聚合酶的作用下启动DNA分子进行复制。分子进行复制。目前，在基因序列中进行定点突变，主要采用两种目前，在基因序列中进行定点突变，主要采用两种PCR方法，重叠延伸技术和大引物诱变法。方法，重叠延伸技术和大引物诱变法。1)寡核苷酸定点突变寡核苷酸定点突变原理：原理：合成一段寡聚脱氧核糖核苷酸作为引物，其中含有需要合成一段寡聚脱氧核糖核苷酸作为引物，其中含有需要改变的碱基，使其与带有目的基因的单链改变的碱基，使其与带有目的基因的单链DNA配对。配对。合成的寡聚核苷酸引物除短的错配区外，与目的基因完合成的寡聚核苷酸引物除短的错配区外，与目的基因完全互补。全互补。用用DNA聚合酶使寡聚核苷酸引物延伸，完成单链聚合酶使寡聚核苷酸引物延伸，完成单链DNA的复制。的复制。由此产生的双链由此产生的双链DNA，一条链为野生型亲代链，另一条，一条链为野生型亲代链，另一条为突变型子链。为突变型子链。将获得的双链分子通过转导导入宿主细胞，并筛选出突将获得的双链分子通过转导导入宿主细胞，并筛选出突变体，其中基因已被定向修改。变体，其中基因已被定向修改。操作流程：操作流程：合成一段含有需要改变碱基的寡聚核苷酸引物。合成一段含有需要改变碱基的寡聚核苷酸引物。构建含靶序列的单链重组构建含靶序列的单链重组M13DNA。用用DNA聚合酶延伸诱变寡聚合酶延伸诱变寡核苷酸引物，形成杂合双核苷酸引物，形成杂合双链链M13DNA。转染大肠杆菌，筛选携带转染大肠杆菌，筛选携带突变体克隆的突变体克隆的M13噬菌斑。噬菌斑。纯化突变体，序列序列分纯化突变体，序列序列分析验证。析验证。2)重叠延伸重叠延伸PCR诱变法诱变法原理：原理：对于两个具有部分重叠序列的对于两个具有部分重叠序列的DNA片段，在经过变性和片段，在经过变性和复性后，两个复性后，两个DNA片段之间通过同源序列形成部分杂合片段之间通过同源序列形成部分杂合的双链，在的双链，在DNA聚合酶作用下，杂合双链可互为引物和聚合酶作用下，杂合双链可互为引物和模板，引导模板，引导DNA的合成，从而形成杂合的合成，从而形成杂合DNA双链。双链。操作流程：操作流程：将将DNA模板分别与引物对模板分别与引物对1和引物对和引物对2退火。退火。通过通过PCR1和和PCR2扩增出两种靶基因片段。扩增出两种靶基因片段。FMR2和和RMF2片段在重叠区发生退火。片段在重叠区发生退火。用用DNA聚合酶补平缺口，形成长链聚合酶补平缺口，形成长链DNA，PCR3扩增。扩增。用引物用引物F2和和R2扩增出带有突变位点的全长扩增出带有突变位点的全长DNA片段。片段。3)大引物大引物PCR诱变法诱变法首先用正向突变引物首先用正向突变引物(M)和反向引物和反向引物(R1)扩增模板扩增模板DNA产生双链大引物产生双链大引物(PCR1)。将双链大引物将双链大引物(PCR1)与野生型与野生型DNA分子混合后退分子混合后退火并使之复性。火并使之复性。第二轮第二轮PCR中加入正向引物中加入正向引物(F2)，与，与PCR1中的互中的互补链配对，扩增产生带有突变的双链补链配对，扩增产生带有突变的双链DNA。由于由于F2的退火温度显著高于的退火温度显著高于M和和R1，可忽略引物，可忽略引物M和和R1在本轮反应中所造成的干扰。在本轮反应中所造成的干扰。获得定点突变获得定点突变PCR产物后，进行产物后，进行DNA序列分析以序列分析以验证突变位点。验证突变位点。PCR介导的定点突变方法的优势：介导的定点突变方法的优势：突变体回收率高；突变体回收率高；能用双链能用双链DNA作为模板，可在任何位点引入突变；作为模板，可在任何位点引入突变；可在同一试管中完成所有反应；可在同一试管中完成所有反应；快速简便；快速简便；PCR介导的定点突变方法已成为定点突变的主介导的定点突变方法已成为定点突变的主要技术。要技术。6.2 基因敲除技术基因敲除技术经典遗传学是从一个突变体的表型出发，研究其基经典遗传学是从一个突变体的表型出发，研究其基因型，进而找出该基因的编码序列。因型，进而找出该基因的编码序列。现代遗传学现代遗传学(反向遗传学反向遗传学)首先从基因序列出发，推首先从基因序列出发，推测其表现型，进而推导出该基因的功能。测其表现型，进而推导出该基因的功能。基因敲除又称基因打靶，通过外源基因敲除又称基因打靶，通过外源DNA与染色体与染色体DNA之间的同源重组，进行精确的定点修饰和基因之间的同源重组，进行精确的定点修饰和基因改造，具有专一性强、染色体改造，具有专一性强、染色体DNA可与目的片段共可与目的片段共同稳定遗传等特点。同稳定遗传等特点。6.2.1 基本原理基本原理基因敲除为完全基因敲除和条件型基因敲除。基因敲除为完全基因敲除和条件型基因敲除。完全基因敲除完全基因敲除 指通过同源重组法完全消除细胞指通过同源重组法完全消除细胞或者动物个体中的靶基因活性。或者动物个体中的靶基因活性。条件型基因敲除条件型基因敲除 指通过定位重组系统实现特指通过定位重组系统实现特 定时间和空间的基因敲除。定时间和空间的基因敲除。噬菌体的噬菌体的Cre/Loxp系统、系统、Gin/Gix系统，酵母细系统，酵母细胞的胞的FLP/FRT系统和系统和R/RS系统是现阶段常用的系统是现阶段常用的四种定位重组系统。四种定位重组系统。Cre/Loxp系统应用最为广泛。系统应用最为广泛。1)完全基因敲除完全基因敲除采用取代型或插入型载体在胚胎干细胞中根据正采用取代型或插入型载体在胚胎干细胞中根据正-负筛选原理进行完全基因敲除。负筛选原理进行完全基因敲除。正向选择基因正向选择基因neo(新霉素抗性基因新霉素抗性基因)通常被插入载通常被插入载体靶体靶DNA功能最关键的外显子中，或通过同源重功能最关键的外显子中，或通过同源重组法置换靶基因的功能区。组法置换靶基因的功能区。负向选择基因负向选择基因HSV-tk(单纯疱疹病毒胸苷激酶基因单纯疱疹病毒胸苷激酶基因)则被置于目的片段外侧，含有该基因的重组细胞则被置于目的片段外侧，含有该基因的重组细胞不能在选择培养基上生长。不能在选择培养基上生长。如果细胞中发生了随机重组，负向选择基因就可如果细胞中发生了随机重组，负向选择基因就可能被整合到基因组中，导致细胞死亡。能被整合到基因组中，导致细胞死亡。用分子筛选技术对细胞系进行验证，确定是否敲用分子筛选技术对细胞系进行验证，确定是否敲除了目的基因。除了目的基因。2)条件型基因敲除条件型基因敲除构建条件型基因敲除打靶载体，将正向选择标记构建条件型基因敲除打靶载体，将正向选择标记neo置于靶基因的内含子中，并在靶基因重要功能置于靶基因的内含子中，并在靶基因重要功能域两侧内含子中插入同向域两侧内含子中插入同向LoxP位点。位点。需要消除靶基因活性时，与带有需要消除靶基因活性时，与带有Cre重组酶基因重组酶基因的的ES细胞杂交，细胞杂交，Cre可把两个可把两个LoxP位点间的位点间的DNA片段切除，导致靶基因失活。片段切除，导致靶基因失活。Cre重组酶是细菌噬菌体重组酶是细菌噬菌体P1的的I型拓扑异构酶，催型拓扑异构酶，催化化LoxP位点间的位点间的DNA进行位点特异性重组。进行位点特异性重组。也可用也可用Cre表达质粒转染中靶表达质粒转染中靶ES细胞，通过重组细胞，通过重组将两个将两个LoxP位点间的位点间的neo抗性基因删除。抗性基因删除。6.2.2 高等动物基因敲除技术高等动物基因敲除技术胚胎干细胞胚胎干细胞(ES细胞细胞)分离和体外培养的成功奠定了分离和体外培养的成功奠定了哺乳动物基因敲除的技术基础。哺乳动物基因敲除的技术基础。真核生物基因敲除的技术路线主要包括构建重组基真核生物基因敲除的技术路线主要包括构建重组基因载体，用电穿孔、显微注射等方法把重组因载体，用电穿孔、显微注射等方法把重组DNA导导入胚胎干细胞纯系中，使外源入胚胎干细胞纯系中，使外源DNA与胚胎干细胞基与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的DNA序列整合到内源基因组中并得以表达。序列整合到内源基因组中并得以表达。显微注射命中率较高，技术难度相对大些。显微注射命中率较高，技术难度相对大些。电穿孔法命中率比显微注射低，操作使用方便。电穿孔法命中率比显微注射低，操作使用方便。6.2.3 植物基因敲除技术植物基因敲除技术T-DNA插入失活技术是目前在植物中使用最为广泛插入失活技术是目前在植物中使用最为广泛的基因敲除手段。的基因敲除手段。利用根癌农杆菌利用根癌农杆菌T-DNA介导转化，将带有报告基因介导转化，将带有报告基因的的DNA序列整合到基因组序列整合到基因组DNA上，如果这段上，如果这段DNA插入到目的基因内部或附近，就会影响该基因的表插入到目的基因内部或附近，就会影响该基因的表达，从而使该基因达，从而使该基因“失活失活”。在该基因内部或附近插入了一段已知序列的在该基因内部或附近插入了一段已知序列的DNA，可设计引物将被破坏了的靶序列可设计引物将被破坏了的靶序列PCR扩增出来。扩增出来。将靶基因两端的引物将靶基因两端的引物LP、RP及插入载体上的引物及插入载体上的引物LB在同一体系在同一体系PCR扩增，可得扩增，可得3种类型的条带。种类型的条带。6.3 蛋白质及蛋白质及RNA相互作用技术相互作用技术酵母单杂交系统是上世纪酵母单杂交系统是上世纪90年代中发展起来的研年代中发展起来的研究究DNA-蛋白质之间相互作用的新技术。蛋白质之间相互作用的新技术。该技术可识别稳定结合于该技术可识别稳定结合于DNA上的蛋白质，在酵上的蛋白质，在酵母细胞内研究真核生物中母细胞内研究真核生物中DNA-蛋白质之间的相互蛋白质之间的相互作用，并通过筛选作用，并通过筛选DNA文库直接获得靶序列相互文库直接获得靶序列相互作用蛋白的编码基因。作用蛋白的编码基因。将已知顺式作用元件构建到最基本启动子将已知顺式作用元件构建到最基本启动子(Pmin)的上游，把报告基因连接到的上游，把报告基因连接到Pmin下游。下游。6.3.1 酵母单杂交系统酵母单杂交系统将编码待测转录因子将编码待测转录因子cDNA与已知酵母转录激活与已知酵母转录激活结构域结构域(AD)融合表达载体导入酵母细胞，该基因融合表达载体导入酵母细胞，该基因产物如果能够与顺式作用元件相结合，就能激活产物如果能够与顺式作用元件相结合，就能激活Pmin启动子，使报告基因得到表达。启动子，使报告基因得到表达。6.3.2 酵母双杂交系统酵母双杂交系统核生物转录调控因子具有组件式结构特征，这些核生物转录调控因子具有组件式结构特征，这些蛋白往往由两个或两个以上相互独立的结构域构蛋白往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成，其中成，其中DNA结合结构域结合结构域(BD)和转录激活结构域和转录激活结构域(AD)是转录激活因子发挥功能所必须的。是转录激活因子发挥功能所必须的。BD能与特定基因启动区结合，但不能激活基因转能与特定基因启动区结合，但不能激活基因转录，由不同转录调控因子的录，由不同转录调控因子的BD和和AD所形成的杂所形成的杂合蛋白却能行使激活转录的功能。合蛋白却能行使激活转录的功能。先用基因重组技术将编码已知蛋白的先用基因重组技术将编码已知蛋白的DNA序列连序列连接到带有酵母转录调控因子接到带有酵母转录调控因子(GAL1、GAL4)DNA BD编码区的表达载体上。编码区的表达载体上。导入酵母细胞中使之表达带有导入酵母细胞中使之表达带有DNA结合结构域的杂结合结构域的杂合蛋白，与报告基因上游的启动调控区相结合，将合蛋白，与报告基因上游的启动调控区相结合，将作为作为“诱饵诱饵”捕获与已知蛋白相互作用的基因产物。捕获与已知蛋白相互作用的基因产物。再将已知编码再将已知编码AD的的DNA分别与待筛选的分别与待筛选的cDNA文库文库中不同插入片段相连，获得中不同插入片段相连，获得“猎物猎物”载体，转化含载体，转化含有有“诱饵诱饵”的酵母菌。的酵母菌。如果酵母细胞表达的如果酵母细胞表达的“诱饵诱饵”蛋白与蛋白与“猎物猎物”载体载体表达的某个蛋白质发生作用，不同转录调控因子的表达的某个蛋白质发生作用，不同转录调控因子的AD和和BD就会靠拢，激活报告基因表达。就会靠拢，激活报告基因表达。分离有报告基因活性的酵母菌，得到所需的分离有报告基因活性的酵母菌，得到所需的“猎物猎物”载体，就能得到与已知蛋白质作用的新基因。载体，就能得到与已知蛋白质作用的新基因。6.3.3 蛋白质相互作用技术蛋白质相互作用技术将诱饵蛋白结合于葡聚糖表面并固定于纳米级厚将诱饵蛋白结合于葡聚糖表面并固定于纳米级厚度的金属膜上。当蛋白质混合物经过时，如果有度的金属膜上。当蛋白质混合物经过时，如果有蛋白质同蛋白质同“诱饵诱饵”蛋白发生相互作用，那么两者蛋白发生相互作用，那么两者的结合将使金属膜表面的折射率上升，导致共振的结合将使金属膜表面的折射率上升，导致共振角度的改变。角度的改变。1)等离子表面共振技术等离子表面共振技术(SPR)共振角度的改变与共振角度的改变与该处蛋白质浓度成该处蛋白质浓度成线性关系。由此可线性关系。由此可检测蛋白质之间的检测蛋白质之间的相互作用。相互作用。2)免疫共沉淀技术免疫共沉淀技术(CoIP)将靶蛋白的抗体连接到将靶蛋白的抗体连接到固体基质上。固体基质上。再将可能与靶蛋白发生再将可能与靶蛋白发生相互作用的待筛选蛋白相互作用的待筛选蛋白加入反应体系中。加入反应体系中。用低离心力沉淀或微膜用低离心力沉淀或微膜过滤法在固体基质和抗过滤法在固体基质和抗体的共同作用下将蛋白体的共同作用下将蛋白复合物沉淀到试管的底复合物沉淀到试管的底部或微膜上。部或微膜上。3)GST及及GAD融合蛋白沉降技术融合蛋白沉降技术GST融合蛋白融合蛋白是将谷胱甘肽是将谷胱甘肽S转移酶转移酶(GST)与目标与目标蛋白做成融合蛋白的方式在外源表达。蛋白做成融合蛋白的方式在外源表达。利用利用GST对谷胱甘肽对谷胱甘肽偶联的琼脂糖球珠的偶联的琼脂糖球珠的亲和性，从混合蛋白亲和性，从混合蛋白质样品中纯化得到相质样品中纯化得到相互作用蛋白。互作用蛋白。GST沉降应用于确定沉降应用于确定探针蛋白与未知蛋白探针蛋白与未知蛋白以及探针蛋白与已知以及探针蛋白与已知蛋白间的相互作用。蛋白间的相互作用。GAD融合蛋白是由酵母转录调控因子融合蛋白是由酵母转录调控因子(Gal4)的转的转录激活结构域录激活结构域(GAD)与与植物色素相互作用因子植物色素相互作用因子(PIF3)构成。构成。将将GAD与与PIF3的不同区段相接成为诱饵，研究的不同区段相接成为诱饵，研究该重组蛋白在体外与光敏素该重组蛋白在体外与光敏素B(phy B)与缺失与缺失N-37位氨基酸的突变体或光敏素位氨基酸的突变体或光敏素(phy A)的相互作用。的相互作用。光敏素光敏素B能与能与PIF3发生强烈的相互作用，超过发生强烈的相互作用，超过30%的的phy B被被PIF3沉淀下来。沉淀下来。缺失缺失N-37位氨基酸的位氨基酸的phy B突变体及突变体及phy A只能与只能与PIF3发生较弱的作用，约发生较弱的作用，约5%的的phy A或约或约10%的的N-37位氨基酸缺失突变的位氨基酸缺失突变的phy B被沉淀下来。被沉淀下来。4)荧光共振能量转移法荧光共振能量转移法(FRET)FRET用于细胞内蛋白质的相互作用研究。用于细胞内蛋白质的相互作用研究。FRET荧光能量转移有三个基本条件：荧光能量转移有三个基本条件：给体与受体在合适的距离给体与受体在合适的距离(110nm)；给体的发射光谱与受体的吸收光谱有一定的重叠给体的发射光谱与受体的吸收光谱有一定的重叠(这是这是能量匹配的条件能量匹配的条件)；给体与受体的偶极具有一定的空间取向给体与受体的偶极具有一定的空间取向(这是偶极这是偶极-偶极偶极耦合作用的条件耦合作用的条件)。FRET需要有两个探针，即荧光给体和荧光受体，需要有两个探针，即荧光给体和荧光受体，要求给体的发射光谱与受体的吸收光谱有一定的要求给体的发射光谱与受体的吸收光谱有一定的重叠，而与受体的发射光谱尽量没有重叠。重叠，而与受体的发射光谱尽量没有重叠。不同蛋白的吸收和发射波长不同，可根据需要组不同蛋白的吸收和发射波长不同，可根据需要组成不同的探针对。成不同的探针对。常用的探针有常用的探针有3类：类：荧光蛋白荧光蛋白 一类能发射荧光的天然蛋白及其突变体。常一类能发射荧光的天然蛋白及其突变体。常见的有绿色见的有绿色(GFP)、蓝色、蓝色(BFP)、青色、青色(CFP)和黄色和黄色(YFP)荧光蛋白等。荧光蛋白等。有机染料有机染料 具有特征吸收和发射光谱的有机化合物组成具有特征吸收和发射光谱的有机化合物组成的染料对。包括荧光素、罗丹明类化合物和青色染料的染料对。包括荧光素、罗丹明类化合物和青色染料Cy3、Cy5等。等。镧系染料镧系染料(金属染料金属染料)一般与有机染料联用，分别作为一般与有机染料联用，分别作为FRET的给体或受体，以提高检测的准确性和信噪比。的给体或受体，以提高检测的准确性和信噪比。6.3.4 染色质免疫共沉淀技术染色质免疫共沉淀技术(ChIP)ChIP是一种在体内研究是一种在体内研究DNA与蛋白质相互作用的与蛋白质相互作用的方法。方法。ChIP不仅可以检测体内反式因子与不仅可以检测体内反式因子与DNA的的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修动态作用，还可以用来研究组蛋白的各种共价修饰与基因表达的关系。饰与基因表达的关系。ChIP流程流程(见见P226图图6-30)：在活细胞状态下固定蛋白质在活细胞状态下固定蛋白质-DNA复合物。复合物。超声或酶切处理将其随机切成染色质小片段。超声或酶切处理将其随机切成染色质小片段。通过抗原抗体的特异识别反应，沉淀该复合物。通过抗原抗体的特异识别反应，沉淀该复合物。富集与目的蛋白质结合的富集与目的蛋白质结合的DNA片段。片段。对目的对目的DNA片段进行纯化和片段进行纯化和PCR检测。检测。6.3.5 RNA干涉技术及其应用干涉技术及其应用RNA干涉干涉(RNAi)技术是利用双链小技术是利用双链小RNA高效、特高效、特异性降解细胞内同源异性降解细胞内同源mRNA从而阻断靶基因表达，从而阻断靶基因表达，使细胞出现靶基因缺失的表型。使细胞出现靶基因缺失的表型。双链双链RNA是是RNAi的触发物，引发与之互补的单的触发物，引发与之互补的单链链RNA(ssRNA)的降解。的降解。经过经过Dicer(一种具有一种具有RNAase III活性的核酸酶活性的核酸酶)的的加工，细胞中较长的双链加工，细胞中较长的双链RNA(30个核苷酸以上个核苷酸以上)首先被降解形成首先被降解形成2125个核苷酸的小分子干扰核糖个核苷酸的小分子干扰核糖核酸核酸(siRNA)，并有效地定位目标，并有效地定位目标mRNA。siRNA是引发转录后基因沉默中序列特异性是引发转录后基因沉默中序列特异性RNA降解的重要中间媒介，它具有特殊的结构特征，降解的重要中间媒介，它具有特殊的结构特征，即即5 端磷酸基团和端磷酸基团和3 端的羟基，其两条链的端的羟基，其两条链的3 端各端各有两个碱基突出于末端。有两个碱基突出于末端。由由siRNA中的反义链参与指导合成被称为中的反义链参与指导合成被称为RNA诱诱导的沉默复合体导的沉默复合体(RISC)的核蛋白体，再由的核蛋白体，再由RISC介导切割目的介导切割目的mRNA分子中与分子中与siRNA反义链互补反义链互补的区域，从而实现干扰靶基因表达的功能。的区域，从而实现干扰靶基因表达的功能。哺乳动物细胞内，较长的双链哺乳动物细胞内，较长的双链RNA(dsRNA)会导会导致非特异性基因沉默，只有致非特异性基因沉默，只有2125个核苷酸的个核苷酸的siRNA才能有效引发特异性基因沉默。才能有效引发特异性基因沉默。非哺乳动物可用较长非哺乳动物可用较长dsRNA直接诱导产生直接诱导产生RNAi。6.4 基因芯片及数据分析基因芯片及数据分析核酸杂交技术是基因芯片应用的基础。核酸杂交技术是基因芯片应用的基础。基因芯片基因芯片(DNA chip)，又称，又称DNA芯片，是指将许芯片，是指将许多特定的寡核苷酸片段或基因片段作为探针，有多特定的寡核苷酸片段或基因片段作为探针，有规律地排列固定于支持物上。规律地排列固定于支持物上。然后与待测的标记样品的基因按碱基配对原理进然后与待测的标记样品的基因按碱基配对原理进行杂交，再通过激光共聚焦荧光检测系统等对芯行杂交，再通过激光共聚焦荧光检测系统等对芯片进行扫描。片进行扫描。6.4.1 基因芯片技术原理基因芯片技术原理并配以计算机系统对每一探针并配以计算机系统对每一探针上的荧光信号进行比较和检测，上的荧光信号进行比较和检测，而迅速得出所要的信息。而迅速得出所要的信息。6.4.2 基因芯片的点制过程基因芯片的点制过程基因芯片的实质是高度集成的寡核苷酸阵列。基因芯片的实质是高度集成的寡核苷酸阵列。制作简易基因芯片时，用机械臂把制作简易基因芯片时，用机械臂把DNA片段点在片段点在玻璃片或尼龙膜上，经过物理吸附作用达到固化。玻璃片或尼龙膜上，经过物理吸附作用达到固化。也可以直接在玻璃板表面进行化学合成，从而得到也可以直接在玻璃板表面进行化学合成，从而得到寡聚核苷酸芯片。寡聚核苷酸芯片。将芯片与待研究的将芯片与待研究的cDNA或其它样品杂交，经过计或其它样品杂交，经过计算机扫描和数据处理，便可以观察到大规模的基因算机扫描和数据处理，便可以观察到大规模的基因群在不同组织或同一组织不同发育时期或不同生理群在不同组织或同一组织不同发育时期或不同生理条件下的表达调控情况。条件下的表达调控情况。1)简易基因芯片简易基因芯片2)大规模基因芯片大规模基因芯片简易芯片一般基因数量少简易芯片一般基因数量少(一般不超过一般不超过2000)，主，主要用于研究小部分特定基因的表达状态。可用手要用于研究小部分特定基因的表达状态。可用手工制作或者机械手点样。工制作或者机械手点样。大规模基因芯片通常涉及基因组规模与数量大大规模基因芯片通常涉及基因组规模与数量大(一一般大于般大于10000个基因个基因)，分别采用接触式点样，非，分别采用接触式点样，非接触式点样或者半导体技术制备样品。接触式点样或者半导体技术制备样品。基因芯片技术包括四个主要步骤：芯片制备、样基因芯片技术包括四个主要步骤：芯片制备、样品制备、杂交反应、信号检测和结果分析。品制备、杂交反应、信号检测和结果分析。基因芯片的工作流程：基因芯片的工作流程：经大规模经大规模PCR扩增获得独立扩增获得独立cDNA片段。片段。用机械手将用机械手将PCR产物点在合适的介质上，变性、固定。产物点在合适的介质上，变性、固定。从不同器官或组织中分离从不同器官或组织中分离mRNA，反转录生成，反转录生成cDNA。用不同的荧光染料标记不同的用不同的荧光染料标记不同的cDNA样本。样本。将标记后的将标记后的cDNA与点好的芯片进行杂交。与点好的芯片进行杂交。激光扫描芯片杂交结果，计算机处理。激光扫描芯片杂交结果，计算机处理。分析芯片杂交数据。分析芯片杂交数据。PCR扩增扩增靶基因标记靶基因标记原位合成原位合成合成点样合成点样芯片杂交芯片杂交杂交检测杂交检测数据分析数据分析实际应用实际应用提出问题提出问题芯片设计芯片设计芯片制作芯片制作试样处理试样处理表达差异分析表达差异分析多态性分析多态性分析再测序再测序生物信息学生物信息学数学优化数学优化数据库数据库标准化标准化6.4.3 基因芯片数据分析基因芯片数据分析数据可靠性分析：数据可靠性分析：通过两次平行杂交反应，将每个基因在两个反应中的表通过两次平行杂交反应，将每个基因在两个反应中的表达水平做成对应散点图，只要绝大多数基因的杂交结果达水平做成对应散点图，只要绝大多数基因的杂交结果都在都在45斜线附近，就说明实验结果是可靠的。斜线附近，就说明实验结果是可靠的。用多个管家基因作为内对照，管家基因的反应信号在两用多个管家基因作为内对照，管家基因的反应信号在两种组织中不变，可确定其他基因表达信号的相对值。种组织中不变，可确定其他基因表达信号的相对值。生物学意义分析生物学意义分析分析芯片杂交数据，研究差异表达基因的生物学意义。分析芯片杂交数据，研究差异表达基因的生物学意义。将差异表达定位于不同的生物化学代谢途径，研究基因将差异表达定位于不同的生物化学代谢途径，研究基因芯片数据中可能具有生物学意义的代谢途径。芯片数据中可能具有生物学意义的代谢途径。6.5 利用酵母鉴定靶基因功能利用酵母鉴定靶基因功能酵母菌是单细胞真核生物，具有与动植物细胞相酵母菌是单细胞真核生物，具有与动植物细胞相似的结构特征。似的结构特征。酿酒酵母有稳定的单倍体和二倍体细胞，是最早酿酒酵母有稳定的单倍体和二倍体细胞，是最早完成基因组完成基因组DNA全序列测定的真核生物。全序列测定的真核生物。导入酵母细胞中的导入酵母细胞中的DNA即能以自主复制的分子形即能以自主复制的分子形式存在，也可被整合到基因组的方式存在。式存在，也可被整合到基因组的方式存在。酵母中转化酵母中转化DNA的整合重组主要通过同源重组方的整合重组主要通过同源重组方式进行，整合效率较高。式进行，整合效率较高。6.5.1 酵母的遗传学和分子生物学简介酵母的遗传学和分子生物学简介酵母单倍体和二倍体的重大差异：酵母单倍体和二倍体的重大差异：二倍体细胞直径大约是单倍体的二倍体细胞直径大约是单倍体的1.3倍。倍。二倍体细胞呈长形或卵圆形，单倍体通常接近圆形。二倍体细胞呈长形或卵圆形，单倍体通常接近圆形。二倍体细胞按极性方向出芽，单倍体按轴线方向出芽。二倍体细胞按极性方向出芽，单倍体按轴线方向出芽。酵母细胞有三种交配型：酵母细胞有三种交配型：单倍体单倍体 MATa；MAT二倍体二倍体 MATa/MATa与与MAT交配形成交配形成MATa/。MATa/不能与不能与MATa或或MAT交配。交配。二倍体酵母细胞在营养缺乏的条件下能通过减数分二倍体酵母细胞在营养缺乏的条件下能通过减数分裂形成单倍体的孢子。从单个孢子来源的所有细胞裂形成单倍体的孢子。从单个孢子来源的所有细胞都带有一套相同的染色体都带有一套相同的染色体DNA。6.5.2 酵母基因转化与性状互补酵母基因转化与性状互补利用整合型质粒利用整合型质粒(Yip)可以对酵母基因组中可以对酵母基因组中的任意基因进行精确的敲除的任意基因进行精确的敲除(置换置换)。带有致死位点和可能的外源功能互补基因的带有致死位点和可能的外源功能互补基因的酵母二倍体细胞在饥饿条件下形成四分体孢酵母二倍体细胞在饥饿条件下形成四分体孢子，通过四分体分析技术进行观测和研究。子，通过四分体分析技术进行观测和研究。如果引入的外源基因具有互补突变点的功能，如果引入的外源基因具有互补突变点的功能，含有突变基因的单倍体可以存活，否则就不含有突变基因的单倍体可以存活，否则就不能存活。能存活。6.5.3 外源基因在酵母中的功能鉴定外源基因在酵母中的功能鉴定将外源基因克隆于酵母表达载体上，转化野生将外源基因克隆于酵母表达载体上，转化野生型或突变酵母菌株，通过观察酵母的表型变化型或突变酵母菌株，通过观察酵母的表型变化或分析细胞中化学成分的变化即可推测该基因或分析细胞中化学成分的变化即可推测该基因的生物学功能。的生物学功能。酵母细胞中有与动植物细胞接近的蛋白质转录酵母细胞中有与动植物细胞接近的蛋白质转录后修饰系统，许多在大肠杆菌中不能产生功能后修饰系统，许多在大肠杆菌中不能产生功能蛋白质的动植物基因在酵母中表达后往往具有蛋白质的动植物基因在酵母中表达后往往具有生物学功能。生物学功能。6.6 其他分子生物学技术其他分子生物学技术凝胶滞缓凝胶滞缓(EMSA)技术是用于体外研究技术是用于体外研究DNA与蛋与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术。基本原理：基本原理：在凝胶电泳中，由于电场的作用，裸露的在凝胶电泳中，由于电场的作用，裸露的DNA朝正电朝正电极移动的距离与其分子量的对数成反比。极移动的距离与其分子量的对数成反比。如果如果DNA分子与某种蛋白质相结合，导致分子量增大，分子与某种蛋白质相结合，导致分子量增大，在凝胶中的迁移作用受到阻滞，在特定电压和时间内在凝胶中的迁移作用受到阻滞，在特定电压和时间内朝正电极移动的距离也就相应缩短了。朝正电极移动的距离也就相应缩短了。6.6.1 凝胶滞缓实验凝胶滞缓实验方法：方法：同位素标记待测的同位素标记待测的DNA片段片段细胞提取物细胞提取物DNA-蛋白质复合物蛋白质复合物探针探针DNA温育温育PAGE电泳电泳放射自显影放射自显影进行进行DNA凝胶分析凝胶分析 6.6.2 噬菌体展示技术噬菌体展示技术噬菌体是细菌病毒的总称。噬菌体可被分为溶菌噬菌体是细菌病毒的总称。噬菌体可被分为溶菌周期和溶源周期两种不同的类型。周期和溶源周期两种不同的类型。只具有溶菌生长周期的噬菌体称为烈性噬菌体。只具有溶菌生长周期的噬菌体称为烈性噬菌体。具有溶源周期的噬菌体称为温和噬菌体。具有溶源周期的噬菌体称为温和噬菌体。基本原理：基本原理：将编码将编码“诱饵诱饵”蛋白的蛋白的DNA片段插入噬菌体基因组，片段插入噬菌体基因组，与编码噬菌体外壳蛋白的基因相融合。与编码噬菌体外壳蛋白的基因相融合。重组噬菌体侵染宿主细菌后，复制形成大量带有杂合重组噬菌体侵染宿主细菌后，复制形成大量带有杂合外壳蛋白的噬菌体颗粒，直接用于捕获靶蛋白库中与外壳蛋白的噬菌体颗粒，直接用于捕获靶蛋白库中与“诱饵诱饵”相互作用的蛋白质。相互作用的蛋白质。噬菌体展示技术的基本流程：噬菌体展示技术的基本流程：6.6.3 蛋白质磷酸化分析技术蛋白质磷酸化分析技术细胞的生长发育、周期调控、基因表达、蛋白质细胞的生长发育、周期调控、基因表达、蛋白质合成、神经活动、肌肉收缩等都离不开蛋白质特合成、神经活动、肌肉收缩等都离不开蛋白质特异性磷酸化或去磷酸化。异性磷酸化或去磷酸化。由蛋白激酶和蛋白磷酸酯酶所催化的蛋白质可逆由蛋白激酶和蛋白磷酸酯酶所催化的蛋白质可逆磷酸化过程，是生物体内普遍而重要的调控方式，磷酸化过程，是生物体内普遍而重要的调控方式，控制着众多的生理生化反应和生物学过程。控制着众多的生理生化反应和生物学过程。蛋白激酶催化蛋白激酶催化ATP或或GTP的的-磷酸基团转移到底磷酸基团转移到底物蛋白的丝氨酸、酪氨酸、苏氨酰残基上，使底物蛋白的丝氨酸、酪氨酸、苏氨酰残基上，使底物蛋白磷酸化。物蛋白磷酸化。蛋白磷酸酯酶催化磷酸化的底物蛋白去磷酸化。蛋白磷酸酯酶催化磷酸化的底物蛋白去磷酸化。蛋白质磷酸化分析技术主要是对底物磷酸化和蛋蛋白质磷酸化分析技术主要是对底物磷酸化和蛋白激酶活性进行检测。白激酶活性进行检测。用双向电泳及质谱分析检测底物蛋白磷酸化。用双向电泳及质谱分析检测底物蛋白磷酸化。细胞内的蛋白激酶多达上千个，体内检测某个蛋细胞内的蛋白激酶多达上千个，体内检测某个蛋白激酶活性非常困难。白激酶活性非常困难。用体外激酶活性分析法检测蛋白激酶的活性。用体外激酶活性分析法检测蛋白激酶的活性。体外激酶活性分析技术主要包括获得底物蛋白和体外激酶活性分析技术主要包括获得底物蛋白和待测蛋白激酶，进行蛋白质体外磷酸化反应。待测蛋白激酶，进行蛋白质体外磷酸化反应。体外激酶活性分析法能可靠地鉴定某个蛋白激酶体外激酶活性分析法能可靠地鉴定某个蛋白激酶对底物的磷酸化作用，筛查激酶的特异性底物。对底物的磷酸化作用，筛查激酶的特异性底物。6.6.4 蛋白质免疫印迹与抗体制备蛋白质免疫印迹与抗体制备印迹法印迹法(blotting)是指将样品转移到固相载体上，而是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。1975年，年，Southern建立了将建立了将DNA转移到硝酸纤维素转移到硝酸纤维素膜膜(NC膜膜)上，并利用上，并利用DNA-RNA杂交检测特定的杂交检测特定的DNA片段的方法，称片段的方法，称Southern印迹法印迹法。后来对后来对RNA的印迹分析称的印迹分析称Northern印迹法印迹法。对单向电泳后蛋白质的印迹分析称对单向电泳后蛋白质的印迹分析称Western印迹法印迹法。对双向电泳后蛋白质的印迹分析称对双向电泳后蛋白质的印迹分析称Eastern印迹法印迹法。1)蛋白质免疫印迹蛋白质免疫印迹(Western blotting)蛋白质免疫印迹的基本原理：蛋白质免疫印迹的基本原理：将通过将通过PAGE分离的蛋白质转移到分离的蛋白质转移到NC膜或膜或PVDF膜上。膜上。然后与能特异性识别待检蛋白的抗体进行反应。然后与能特异性识别待检蛋白的抗体进行反应。洗涤去除没有结合的特异性抗体后。洗涤去除没有结合的特异性抗体后。加入标记的、能识别特异性抗体的种属特异性抗加入标记的、能识别特异性抗体的种属特异性抗体，反应一段时间后再次洗涤去除非特异性结合体，反应一段时间后再次洗涤去除非特异性结合的标记抗体。的标记抗体。加入适合标记物的检测试剂进行显色或发光等，加入适合标记物的检测试剂进行显色或发光等，观察有无特异性蛋白条带的出现。观察有无特异性蛋白条带的出现。蛋白质免疫印迹的基本步骤：蛋白质免疫印迹的基本步骤：固定：固定：蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)并并从胶上转移到硝酸纤维素膜上。从胶上转移到硝酸纤维素膜上。封闭：封闭：保持膜上没有抗体的结合场所，使场所处于保持膜上没有抗体的结合场所，使场所处于饱和状态，用以避免特殊性抗体单独结合到膜上。饱和状态，用以避免特殊性抗体单独结合到膜上。一抗杂交：一抗杂交：初级抗体初级抗体(第一抗体第一抗体)是特异性的。是特异性的。二抗杂交：二抗杂交：第二抗体或配体试剂对于初级抗体是特第二抗体或配体试剂对于初级抗体是特异性结合并作为指示物。异性结合并作为指示物。底物显色：底物显色：被适当保温后的酶标记蛋白质区带，产被适当保温后的酶标记蛋白质区带，产生可见的、不溶解状态的颜色反应。生可见的、不溶解状态的颜色反应。2)抗体制备抗体制备利用抗原刺激机体，使其产生免疫反应，由机体利用抗原刺激机体，使其产生免疫反应，由机体的浆细胞合成并分泌能与抗原特异结合的一组的浆细胞合成并分泌能与抗原特异结合的一组免免疫球蛋白疫球蛋白，称为，称为抗体抗体。用单一抗原决定簇刺激机体，由一个用单一抗原决定簇刺激机体，由一个B淋巴细胞淋巴细胞克隆接受该抗原所产生的抗体称为克隆接受该抗原所产生的抗体称为单克隆抗体单克隆抗体。由多种抗原决定簇产生的一组针对各个抗原决定由多种抗原决定簇产生的一组针对各个抗原决定簇的混合抗体称为簇的混合抗体称为多克隆抗体多克隆抗体。抗体制备过程：抗体制备过程：准备抗原，准备抗原，选择动物，选择动物，动动物免疫，物免疫，效价检测，效价检测，采集血清、纯化抗体，采集血清、纯化抗体，对于抗体进行纯度及特异性鉴定。对于抗体进行纯度及特异性鉴定。6.6.5 细胞定位及染色技术细胞定位及染色技术真核细胞具有复杂的亚细胞结构。真核细胞具有复杂的亚细胞结构。每种细胞器都有一组特定的蛋白。每种细胞器都有一组特定的蛋白。蛋白质在细胞内的定位是分子生物蛋白质在细胞内的定位是分子生物学研究的重要话题。学研究的重要话题。常用的定位方法是免疫荧光法和荧光蛋白标记法。常用的定位方法是免疫荧光法和荧光蛋白标记法。绿色荧光蛋白绿色荧光蛋白(GFP)由由238个氨基酸残基组成，最大个氨基酸残基组成，最大吸收峰为吸收峰为395 nm(紫外紫外)，并有一个，并有一个479 nm的副峰的副峰(蓝蓝光光)；发射光谱最大峰值为；发射光谱最大峰值为509 nm(绿光绿光)。GFP的第的第65、66、67位氨基酸分别是丝氨酸、脱氢位氨基酸分别是丝氨酸、脱氢酪氨酸、甘氨酸，构成其生色团的核心。酪氨酸、甘氨酸，构成其生色团的核心。GFP融合蛋白的构建：融合蛋白的构建：应用亚克隆技术，将目的基因与应用亚克隆技术，将目的基因与GFP基因构成融基因构成融合基因。合基因。通过愈伤组织转化法、基因枪、显微注射、电激通过愈伤组织转化法、基因枪、显微注射、电激转化等方法转化到合适的细胞。转化等方法转化到合适的细胞。利用目的基因的表达调控机制，如启动子和信号利用目的基因的表达调控机制，如启动子和信号序列来控制融合基因的表达。序列来控制融合基因的表达。最终得到的融合蛋白，并对目的蛋白进行定位。最终得到的融合蛋白，并对目的蛋白进行定位。要尽可能的不影响目的蛋白的定位和功能。要尽可能的不影响目的蛋白的定位和功能。目的基因目的基因gfp 基因基因融合基因融合基因转化转化表达表达检测检测提提 要要应用转录组测序、原位杂交和基因芯片等技术来研应用转录组测序、原位杂交和基因芯片等技术来研究单个或多个基因在生物体某个特定发育阶段或不究单个或多个基因在生物体某个特定发育阶段或不同环境下的表达模式。同环境下的表达模式。应用基因定点突变、基因敲除、应用基因定点突变、基因敲除、RNA干涉等技术抑干涉等技术抑制全部或部分基因的表达，通过靶基因缺失后的表制全部或部分基因的表达，通过靶基因缺失后的表型变化和来研究基因的功能。型变化和来研究基因的功能。应用酵母的单杂交、双杂交、四分体等技术来研究应用酵母的单杂交、双杂交、四分体等技术来研究蛋白质之间以及蛋白质与蛋白质之间以及蛋白质与DNA之间的相互作用。之间的相互作用。通过活体和离体蛋白质之间相互作用的研究，为认通过活体和离体蛋白质之间相互作用的研究，为认识信号转导、蛋白质修饰加工等提供技术支持。识信号转导、蛋白质修饰加工等提供技术支持。思思 考考 题题P243第第2、5、6、11题。题。