美国病理学会对于二代测序临床诊断的实验室标准

美国病理学会（CAP）对于二代测序临床诊断的实验室原则相对于桑格测序来说，二代测序的较高的通量和每个碱基所消耗较低的成本，使得其迅速应用于临床检测领域。尽管在1988年美国病理学会（CAP）没有给出这项技术在临床诊断上的实验室原则规范。但在过去的几年，可以提供二代测序检测服务的实验室相应的不断增长。目的：针相应用二代测序技术的临床诊断给出一种检查清单用以原则化实验操作平台和生物信息数据分析平台。由于基于NGS的临床检测是一种新的诊断技术，并且相对于一代测序其更为复杂，因此目前亟需针对这些检测制定新的原则规范。设计：针对NGS制定必要的规章制度，增进这项技术更好地应用于临床检测。在CAP成立了NGS工作组委员会，以对检测清单的项目内容进行仔细研究。成果：在CAP分子病理学检测清单中总共涉及针对实验操作平台和生物信息数据分析平台的18项实验室认证规定清单。结论：这项经CAP委员会认真考虑后所给的报告陈述了对于制定新的检测清单的重要性。其中涉及文献、批准、质保、验证、异常日记、监控升级、各个版本解释及报告、附带的发现、数据储藏、可追溯性模板、数据传送保密性等的解决。DNA测序即二代测序技术（NGS）由七十年代的化学测序法和桑格测序法逐渐演化而来。NGS与一代测序重要的不同是其可以并行的对数以百万的DNA短片段同步测序而非仅有一种DNA片段。在九十年代中期基于荧光毛细管凝胶电泳的自动化桑格测序的产生使得DNA测序普遍应用于临床诊断。而NGS更高的通量远远超过自动化桑格测序。二代测序的较高的通量和每个碱基所消耗较低的成本，使得其迅速应用于临床检测领域，尽管NGS各方面分析都更为复杂。涉及数据获得和储藏的案例远超过于1988年临床检查科改善后的实验室修正案，对于后续数据计算具有较大挑战性。NGS检测的领域波及遗传病、实体瘤、恶性血液病、传染性疾病，人类白细胞抗原分析，非侵害性产前诊断，胎儿染色体异常检测。但在过去的几年，可以提供二代测序检测服务的实验室相应的不断增长。尽管在1988年美国病理学会（CAP）没有给出这项技术在临床诊断上的实验室原则规范。为应对这种需求，CAP成立了NGS工作组委员会，以在这项技术发展初期制定第一套临床检查原则。考虑到基于NGS的测序技术是在原有技术上对仪器、测序反映试剂、生物信息分析等的改善，工作组致力于制定一套用于规范NGS临床检测的工作框架管理原则以更好地采纳基于NGS的检测技术。二代测序技术由两部分构成，实验操作平台和生物信息分析平台。实验操作平台一般涉及所有的如下流程：病人样品采集解决，核酸提取，片段化，分子标签，外显子组或基因组靶序列富集，接头连接，扩增，文库准备，上样，序列读出。序列是通过对数以百万的DNA片段的读取全自动化的产生。化学实验反映后便是大规模的计算和生物信息分析。通过多种的算法将测到的短的序列去比对匹配人类参照基因组序列。通过图谱比对后，与参照基因组不同的核苷酸变异被辨认出来。另一种独立进程是去逐个的或组合的根据其相应的临床体现去分析与临床有关的变异类型。对于个别病人案例，已经被确认的变异参照其正常基因功能受损的注释内容进行评估，如早产转录因子、截断蛋白、非同义突变对蛋白功能的影响或剪接位点的变化。为了对疾病和有害突变的关系做出明智的决定，需要根据病人的临床症状结合基因组研究成果。作图比对、变异辨认、变异注释以及一定限度上的临床解释涉及了生物信息分析的所有工作框架。CAP NGS工作组考虑到化学实验反映平台与生物信息分析平台是相分离的，因此制定的原则也是分开的。一部分实验室运用国外的设备去进行一部分的二代测序检测。一种实验室提供从实验操作平台到生物信息分析，她们临床检测的验证可以整合起来。在CAP分子病理学检测清单中总共涉及针对实验操作平台和生物信息数据分析平台的18项实验室认证规定清单。NGS检测项目清单涉及对于流程文献建立、批准、质保、验证、异常日记、监控升级、各个版本解释及报告、附带的发现、数据储藏、版本可追溯性、数据传送保密性等的解决。犹如这份报告中描述同样，工作组的目的就是为NGS检测服务提供最初的基本鉴定合格需求。可以预见的就是只要基本的检测验证规范需求到位后，随后便会有附加的其他专门规程。这些在注释部分对其进行进一步解决。这项经CAP委员会认真考虑后所给的报告陈述了对于制定新的检测清单的重要性。此外，这份报告可以作为CAP NGS检测清单的补充，因此内容上与检测清单需求紧密相连。NGS实验原则操作流程文献实验室需要建立一种原则操作流程文献。一种详实的原则操作流程文献是临床实验室质量评价的重要部分。所有的DNA/RNA样品准备、片段化、文库准备、分子标签、样品混合、合成测序有关实验操作必须建立原则操作流程文献，这样才干对每一步及随后的操作进行追踪。这涉及所有的措施、试剂、仪器、仪器软件、之前的版本等。此外，对于质控原则也需要进行描述。某些案例在背面重点提出。NGS靶序列实验（例如多基因模块或外显子测序）可以在测序前对感爱好的基因区域进行捕获，有关捕获区域的具体信息以及富集环节都应以文献的形式进行具体描述。对于解决不同类型样品的临床实验室，如血液、石蜡包埋的福尔马林固定的样本，都应当针对不同样品制定相应的SOPs。用于将病人样本合并的反映试剂和规程必须具体阐明，并且其中应涉及测序接头信息。用于对运营好坏的评价的质控参数的权衡也需要文献化。常用的度量如目的区域内Reads数的比例，质量符合规定的碱基比例，覆盖度的阈值，平均测序深度。实验室必须明文规定好样品制备和测序的接受或拒收原则。最重要的是明确和总结不可以进行分析的区域（如测序深度不充足）。NGS实验操作平台验证实验室对NGS实验平台进行验证，当有所修变化动时，要对整个流程再次进行验证，保证流程中每一部分的体现符合规定。如在分子诊断领域或临床实验室的其她领域，所有的实验室研发的测试，对NGS程序性能分析必须在内部进行验证后才可应用于临床。二代测序实验平台涉及诸多环节，非常复杂。每一环节应分别根据经验综合决定最佳条件和参数设立。这些东西设立好后，必须进行从开始到结束的所有测试的性能验证，涉及实验平台和生物信息分析平台。在验证期间需要拟定的重要性能有分析的敏感性、特异性、精确度（接近真实值的限度），精确度（反复性和可靠性），检测极限。对于任何分子实验，针对不同的样品类型（血液、唾液、组织），必须独立的进行效验。二代测序检测是旨在对于基因组的多种大的区段进行具体查看。因此，NGS容许检测到新的，以及已知的序列变异。由于无法证明所有的理论上也许的变异，因此必须将methods-based（其他检测措施）和analyte-specific（特定分析物）相结合，作为验证措施来鉴定检测的性能。通过对已刊登的与NGS平台精确性有关的文章的征询，将有助于对自己实验室验证性工作的认知。在大多数状况下，考虑到桑格测序是金原则，可以通过其拟定变异位点。然而，在某些状况下变异位点验证信息也可以通过寡核苷酸微阵列基因分型数据获得。针对于NGS检测，多种专业机构已经发布了有关分子检测验证的指南以供读者参照。NGS工作组对于验证性需求中的最小样品数进行了广泛深刻的讨论。对于不断发展的NGS技术以及在诊断实验室多种多样的应用，这种讨论为时过早。并且存在的问题是设定最小样品数对于NGS诊断来说也许会导致其验证局限性。工作组同步也注意到对于已经报道的文章里NGS的验证的样品数量有明显不同（20-80），这表白，individual laboratories are on a validation learning curve.。对于NGS验证需要运营的样品总数量重要取决于检测的区域大小（从技术特性上来说较大的检测区域将会检测到更多的变异位点）。根据特异变异位点的数量进行评估，根据也许的规定，通过等位基因频率范畴，去鉴定检测的限度，根据样品运营次数和数量去设定其精确度。出于记录方面考虑，NGS工作组总结到有关样品数量不能全面或普遍的应用于二代测序的众多实验中（如扩增子相对于靶序列捕获，较少基因量相对于外显子组和全基因组，遗传疾病相对于肿瘤相对于传染病）。因此我们给出多种脚本（如样品对methods-based的解决，对样品反复性和可靠性的评价，以及临床样本用于评估诊断特异性敏感度），每一项都将会需要样品，而其数量会随着实验背景不同而有所变化。如下我们会突出强调对需求量及某些性能分析参数验证的原则。通过使用methods-based评估分析的敏捷度，目的在于最大化突变序列数量，相对于金原则增长分析的可信度。这些数值会外推到所有的碱基。对于这种methods-based，致病性变异分析是无关的，由于这不受技术检测能力影响。然而尽量多的运用基因组中的不同区段去鉴定基线非常重要，由于序列的背景是一种重要的影响因素。此外实验室应当分别对所有的与检测有关的变异类型进行性能分析鉴定（如SNV，InDel，CNV，构造变异，homopolymers）。合适的拟定变异类型的最大数量的措施也许会涉及内部不同研发测试的累积分析，前提是用相似的鉴定工具。此外，几种可获取的公共数据库可以提供外显子组或全基因组变异位点的辨认，觉得临床检测服务。此外疾病避免控制中心和国家生物技术信息中心合伙成立网站，以以便两个测序基因组以及临床靶序列数据的获取。这些数据库提供了变异位点的大量设立，这将有助于得到技术性能规范。然而当NGS检测中包具有除了某些更广泛性的methods-based措施外，一种特异型分析的验证是有必要的。由此，阳性对照对于NGS检测所熟识的基因有关的变异位点（如CFTR基因p.F508缺失变异）引起的疾病极为重要的。特异性分析一般需要阴性样品进行计算，去定义负数部分。在整个实验部分methods-based措施可用于特异性计算分析，如假阳性率的鉴定。在临床样本中它对于鉴定假阳性数量同样具有作用。注意到特异型分析在I类错误类型的比例，涉及碱基辨认错误，错位引起的错误，变异辨认错误。鉴定检测限对于一种具有异质基因类型的样品（如肿瘤样品、用于产前诊断的妈妈血液，镶嵌样品）查询的实验是非常重要的。考虑到桑格测序过去始终是在验证期间的金原则，但其敏捷度低于NGS，因此对NGS的敏捷度验证具有一定挑战性。样品混合实验（已知等位基因频率的稀释）应当至少用到3个样品（生物学反复）。对于单通道测序仪，内部运营的差别性可以通过用相似样本的不同条形码检测（技术反复）。同源序列如假基因可以干扰变异位点辨认的精确性，这对对的的去分析受影响的基因形成了巨大的挑战。预先生物信息同源性分析将会有助于拟定来自同源序列也许的干扰。此外，图谱质量可以用于拟定有疑问的区域。如果这种基因涉及在NGS测试中，实验室必须设计一种措施保证被辨认到的变异不是假基因序列，并证明这个措施的精确度。当测序池中具有条码接头样品，实验室必须证明整个平台中样品身份的保持。重新验证和认证的限度依赖于所引进的变化的大小及其潜在的影响。例如某些微小的变化，引进新的捕获试剂并已经得到全面的验证，可以通过预期达到的功能进行验证。在这个例子中如果实验室测序一种此前测试过的一种样品并证明其重要运营参数未变化并获得了一致的成果，就可觉得这种变化是可接受的。相反的，一种较大的变化，如引进了一种新的测序平台，或不同的靶序列富集措施，那就需要进行全面的从新验证。NGS实验平台质量管理体系NGS实验平台遵循一种文献化的质量管理体系。CAP承认实验室必须发展并遵循一种质量管理筹划。CAP所有的共同的检测清单合用于多专科实验室，涉及质量管理的各个部分和性能检测措施。NGS实验平台质控管理程序加入到NGS检测清单部分，突出NGS实验室执行的特别需求。没有两个质量管理规程是相似的。每一种都是根据实验室的范畴、诊断市场、专业知识而形成的，并给与实验室主任宽泛行动自由去设计质量保障体系。质量管理规程的大纲设计必须设计好，并符合设计类文献。对于NGS实验室，一种好的质量保障大纲应涉及如下特性：1. 质量保障体系应遵从工作流程。体系评价应在二代测序、分析检测、序列报告分析发生之迈进行。2. NGS质量体系应当与整个机构的质量保障体系相协调，如果这个机构比较大，如医院、医疗中心，NGS的质量体系应适从于整个大的体系中。3. 体系应当可以解决在检测过程中浮现的一般性问题。这些问题不仅可以影响检测成果，并且使得临床应用与实验室自身政策规程不一致。体系文献中应涉及对每次校正的记录、效果、操作准则、流程的修正，以避免问题的复发。4. 质量管理体系宗旨是保证检测具有临床意义。由于没有敏捷度更高的检测进行比较，因此这对于NGS这样的检测尤为重要。检测批示和分析判断的合适性应有科学的医学证明。5. 规程中应鼓励实验室工作人员对于实验室质量检测的意见进行交流。对工作人员的投诉及建议进行调研必须成为质量保障体系中的一部分。NGS成果验证实验室应有一项规定来文献注明报告中的变异位点的检测验证。虽然NGS技术的精确性在不断提高，但还是普遍觉得基于NGS的测序实验会产生假阳性和假阴性的成果。当验证性实验与否要进行时，CAP选择给开展基于NGS测序的实验室一定的灵活性。如检测如何执行，与否建议对额外的家庭成员进行后续补充检测，哪些可以基于二代测序哪些不可以等。例如，某些实验室觉得在实验中测序深度达到原则时（如基于单基因的二代测序达到1000乘），或具有较高的可信度，变异位点就没有必要验证确认。然而，某些实验室觉得需要另一种可替代的措施对报告中的变异位点进行验证确认，以达到抱负的置信度。此外某些实验室也许会在预定的试用期进行验证确认，过后根据成果再对与否进行验证性实验进行评估。每一种进行NGS测序的实验室必须有一项规程，用来文献解说验证性检测工作，或为什么不需要进行验证性工作。基于NGS临床检测及变异位点报告的实验室必须可以文献证明其符合她们的验证性实验规定，或可以展示出对NGS实验不间断的监控证据，以保证在验证期间所达到的基准可以始终保持。CAP也但愿在决定用何种措施进行进行验证性实验上予以灵活性。尽管桑格测序也许是最为普遍的验证措施。CAP这样做是为了检查科根据变异类型和频率灵活的选择合适的验证性检测措施。实验室记录用于实验的措施、仪器、试剂以及需要分析的样品可以通过实验记录进行确认追溯。对于文献证明复杂的实验程序和数学算法及对二代测序分析性能解释，实验运营的综合完整记录是必不可少的。因此，首要的工作框架应涉及对已归档的信息的保存，涉及每个病人样品分析所用的平台，及实验所用的试剂、引物、测序反映，以便可以追溯。这些记录必须涉及靶序列检测的完毕状况及其测序深度。同步也有必要记录分析的细节，涉及任何报道或网站对于有关参数的描述，或检测和报告解决中某些其她信息。虽然所有的分析细节不必涉及在病人的报告中，但是实验室保存每位病人分析有关的具体信息的文献系统是极为核心重要的。异常记录实验室保存来自于NGS实验平台SOP偏差的病人样本的异常记录。实验室必须文献记录下任何源自SOP的偏差，并对偏差及产生的成果进行解释。样品预期的偏差也许涉及对收到的样品或构建的文库未达最佳原则，以及测序文库的浓度未达最佳原则。异常状况也许会与样品质量以及分析过程有关，在样本登记时，需要对样品作出评价以便判断这例样品与否适合进行检查。如果对某一例样品质量有一丝紧张，应记录在工作单中，并就其与监管者或实验室主任进行交流。实验室主任也许会继续进行检测，但会将这问题传达给主治医师，并就此进行讨论交流。这种状况的一种案例就是没有在最佳的条件下进行样品运送。对于这例样品的解决决定一般是只有当提取的DNA充足时才会进行下一步的检测。在实验操作过程中，与具体环节有关的问题应报告给实验室主管或主任。然后才干对检测能否完毕进行评估。当故障排出之后，如果质控运营及样品成果合适，成果可以被实验室主管解读，检测成果是令人满意的。检测问题的方方面面都应完整的记录在异常文献里，涉及故障排除，解决方案，以及有关的交流（谁与谁及日期），这些必须并入到月质量保障报告中。有时，实验室SOP自身需要进行修改以改善措辞，使得工序流程更清晰，或者是清除小的误差完善操作流程。在这种状况下，所推荐的修改至少应有两个人的支持，涉及开发此项目的实验室主管和及实验工程师或有关专家。在此类修改中，必须通过实验室主任核准，签字签名，注明日期。本质上这并不是一种异常记录，而是一种对实验描述的改正。监控升级用以产生NGS数据的仪器，测序化学反映，试剂或试剂盒等，其相应的监控、执行、文献记载的升级，实验室需加以规范。实验室必须意识到升级，保证没有在用废弃掉的措施。实验室必须出具有关政策方案去监管和执行仪器，测序化学反映，试剂或试剂盒等的升级。已经验证的可以提高片段扩增及测序的质量、再现性、精确性的某些新的措施不断地更新发展，这项规范应解决NGS测序的实验室去如何保证她们所用的样品文库制备实验是最新的。这项规范也应阐明监管升级所用的措施以及何时执行一种有关的升级并在临床应用迈进一步验证。例如实验室的规范应在指定的间隔期（如一季度、半年、一年）进行监控并执行升级，以增强优化实验性能。此外，执行完升级后也许会需要对整个实验平台或有关的实验环节进行重新验证，相应的设定期间间隔期会更以便。生物信息分析过程对于NGS数据的分析，多种开源代码和商业的生物信息学算法和软件都是可获得的。虽然这些分析工具在不断改善，她们在诊断分析性能方面均有其强项和弱项。在操作上，合用于NGS数据的生物分析过程可以总结为3个重要环节。第一步是产生一种涉及核酸序列的可读文献，每个核苷酸都标定一种与精确性有关的数值（碱基质量分值）。产生的序列文献运用特定仪器软件分析几种基本参数，如运营时的信噪比。序列文献一般以FASTQ文献格式生成，涉及每个读取的碱基种类，自身的标记以及每个核苷酸相应的质量分值。FASTQ文献已经变成广泛承认的格式用以NGS领域的信息交流。下一步重要是根据参照序列，对读取的序列进行比对，对于一种典型的人类参照基因组序列，去拟定病人的序列与参照序列之间的不同。鉴定的变异类型涉及SNV、InDel、CNV以及其他的构造变异。拟定的变异根据相应基因或蛋白的功能注释到提供信息中。此外实验室执行或筹划研发的独立程序，对特定变异与给出的疾病的临床有关性予以评价。最后，在递交的临床报告中，通过注释的变异位点解读病人的临床表型。对于基因模块和外显子组或全基因组测序，大量变异位点的的排查可以通过对较高的基因型频率来筛减，最后只关注于极有也许对病人有危害并与病症有关的的稀有变异。当以家庭为单位对外显子组或全基因组进行分析时，根据受影响与不受影响的家庭成员，优先考虑变异类型在家族中的共分离。根据人类基因组突变体数据库（如HGMD、OMIM等）与变异有关的疾病的有关信息对变异类型进行级别划分，形成临床报告。开发一种涉及生物信息以及对变异位点进行研究注释的综合型诊断流水线，需要整合多种算法和软件应用。就自身来说，实验室必须根据经验选择算法以及软件工具应用到每个分析诊断中。其中多种中间过程需要已知的病人样本和培训数据进行设立，去检测算法和软件的性能。已经制定好的生物信息分析工具和参数设立，实验室需执行生物信息分析验证，通过大量的设定的样本鉴定分析的敏捷度、特异性和反复性（不同运营，不同仪器，不同操作人员之间的一致性）。用以验证的样品涉及此前已经确认过的变异类型。这些变异可以验证生物信息工具及其参数的性能体现（例如，如果对变异的检测是独立的分析，应有较高的特异性和敏捷度，或如果是二次分析进行筛选的实验，需相对较高的敏捷度），按照每个实验室的规定和报告的临床原则，调节或更换工具并进一步进行评价。当一种令人满意的生物信息程序经验证并达标后，NGS实验成果向临床的转化需要实验室将生物信息分析的过程的所有方面进行记录描述，并对此制定一种质量管理体系。对生物信息分析的规定在下面的讨论中将着重解说。NGS生物信息分析原则操作流程文献实验室应通过SOP的形式对于生物分析中NGS成果的分析注释及报告等流程进行文献化。实验室必须对在NGS成果的分析注释及报告中所用到的算法、软件、数据资料库进行文献化。生物信息分析流程的每一构成部分的文本必须记录并可以追溯（版本控制）。对于每一构成部分，实验室会用到一种基线，默认安装，在发布的个体的生物信息学工具或运营算法方面，运用可替代的配备参数定制途径。无论哪种状况，实验室必须以文献形式记录所有的与默认设立不同的自定义内容或者明确指明所用到的参数、途径、数值等。大部分的生物信息分析通过与参照序列进行比对，参照序列的版本号及组装的具体信息都需要明确指出。当描述生物信息途径时，实验室应当以文献的形式记录所有的数据分析，涉及每一步输入和输出的文献。对于每一步的正常体现，实验室应当也制定和记录质控参数。例如，首要环节，一种实验室会决定采纳一套原则，如特定仪器质量过滤后，通过的可读序列数量。变异位点辨认的原则是必不可少的，用到的参数阈值涉及测序深度，变异位点质量评分，等位基因读取比率。在后期数据筛选的流程和根据也需要体目前SOP文献中。NGS生物信息分析流程验证实验室对生物信息分析的验证生效以及当有变动时对整个分析流程或流程的一部分性能进行从新验证生效。从新认证的限度范畴由修变化动内容而定。正如实验流程同样，在确立一种涉及序列分析可读文献的生物信息分析流程时，实验室会经历一种自身不断修正的过程。对于可以完毕从测序实验到生物信息分析的整个流程的实验室，生物信息分析途径的验证生效应当涉及整体的验证。一旦实验室形成并经验性的拟定了最佳操作，并对流程完毕了充足的检测，下一步就是再运用品有变异位点的样品产生的序列执行并文献化，进行全面的验证。对于内部研发的软件工具或供应商提供的已经锁定的软件工具（如对基本工具没有进行任何修改），这些环节是必不可少的。对于实验测序平台，需要对充足的样品数量进行分析，去评价其诊断分析的敏捷性，特异性和反复性。样本数量的评估应由实验自身决定。某些参数如基因数量的评估，基因区域的评估，以及需要检测的变异类型最后都应确认控制的数量，良好的特性样品（例如人类基因组单体型图样本或已知的固有的细胞系或设计的变异），或之前诊断过的样品。众所周知，假基因以及与靶序列高度同源的序列的浮现对与精确的序列图谱映射，序列比对，及有关的变异辨认均有干扰。在一种给定的临床诊断实验中，需要对干扰的限度进行鉴定。尽管在生物信息分析上高度同源序列的设立调节的挑战，也许会解决掉，但是实验室仍需要设立一种独立的可替代性分析措施去应对这一领域的问题。NGS工作组觉得全面详尽的定义假阳性和假阴性相应的错误率是不可行的。然而实验室应当在变异类型上对典型的实例的错误率进行评估。通过对照样品、特性样品可以对这些错误率进行评估。假阳性的错误率可以通过可替代性的测序措施进行拟定。假阴性的错误率很难拟定，由于其来源于多种状况，涉及在给定靶区域内测序深度的局限性，变异的辨认的缺少也许由于质量评分设立较低，序列读取的方向分布（正向、反向）无法满足质控原则。在用一种可替代措施验证变异辨认的过程中，通过度析靶序列的侧翼区域去拟定这个变异辨认流程能否发现所有也许的变异。例如，当用桑格测序确认一种变异时，可以设计引物对，不仅对变异区域进行测序，并且对侧翼序列进行测序，然后就能检测与否存在变异，查找与生物信息分析途径鉴定成果的相应关系。在文库制备时，应用分子编码已成为NGS中的常用做法。实验室需要拟定标签序列在混合池中的特异性，并且确认在分析的过程中，可以精确的辨认辨别标签序列。在索引分析和样品合并时，接受或回绝一条读长需要设立一原则。例如某些实验室只接受具有索引的读长，且索引序列与建库时所用索引是一致的。对于具有索引序列的读取量的百分数的监测可以测试出来源于其他索引序列污染的存在。这个测试与检测限有关，如在肿瘤样品中确认体细胞突变，生物信息分析途径需要其参数进行评估。可以通过减少具有变异位点的样品浓度验证其检测极限。对于确认变异位点的生物信息分析途径的验证都是专用的，除了分析具有杂合基因型的特殊样品的检测极限外，以上讨论都是与之广泛有关的。当应用外显子或全基因组测序以确认有关的候选基因时，基于此，实验室必须额外的对生物分析途径进行验证。例如，在遗传疾病的状况下，实验室通过对具有多种（隐性、显性、有害变异、致病性变异）序列分析读取设立。一旦生物信息分析途径通过验证符合实验室的规定，并已经实行，当分析途径有任何变化时，需要对其重新验证。可以使其重新生效的实际措施是运用分析验证过的序列文献用新参数对其重新简朴地分析。这种措施也许会产生相似的、或更少的、或更多的变异位点，这些成果需要进一步验证。对于外显子组或全基因组的序列，生物分析途径的变化也能产生一种新的假定的候选基因名单。作为生物分析途径验证或从新验证的法规资料将会涉及验证生效记录和临床应用的备用证明文献。NGS信息分析流程-质量管理体系对于NGS信息分析途径，实验室应有一份文献化的质量控制体系。实验室必须根据相应的质控原则来监测NGS数据分析的常规性工作。对临床样品分析时，与预期的质量控制指标的偏离需要调查，并给出解决。某些样品涉及如下这些状况：NGS数据分析的生物信息输出也许会显示通过质量评分规定的序列读取数量的局限性。另一种状况，根据人类基因组突变频率的有关信息，拟定的变异的数量也许会脱离实际盼望值。此外的样品具有偏高的索引序列读取的数量，以至于无法专门的分离。这种偏差表白技术上存在误差，或操作过程的失误。一种合适的质量控制系统提供工作流程，去查明导致差错的也许的因素，并制定合适的补救措施。如与预期成果相偏差，实验室应记录下来，并以文献的形式记录取来拟定因素和修正的有关措施。遵从的证据（法规资料）不仅应涉及质量控制监测指标的文献编制，还应有有关偏差及相应研究和补救措施的记录描述。生物信息流程的更新实验室有一种政策针对监控，文献编制，补丁版本的执行，升级和其他生物信息分析途径的更新。检测项目规定实验室制定并遵循一项程序，对生物分析途径的各部分制定和实行更新。二代测序生物分析途径常常会用到开源代码软件的多种程序包，解决内容、报告分析方面的数据库。由于这一领域的不断改善演变，实验室必须有一项政策监控更新，版本补充。这项政策应当注明更新的日期。例如，实验室在有关发布后就执行更新，或在一定的间隔期（一季度，半年，一年）后进行更新，这由更新的性质和有关急切性决定。由于在这些更新后需要对生物信息分析流程重新验证生效，后一种措施使得更新与重新验证合并，这将是更有效的。最后实验室保存记录，并能清晰地以文献的形式记录定期的监管执行更新。应着重强调的是，与否更新，何时更新，是由实验室主任决定。数据储存实验室有一种规定，与生物信息分析途径产出的数据，中间的数据，以及最后的数据储存有关。实验室必须确立并执行有关数据储存的一项规定。NGS产生的大的数据文献以及有关的数据分析，涉及流动细胞成像文献，序列碱基辨认和相应质量评分序列读取文献，以及随后分析中产生的中间文献。一般在一段较长时间内保存所有的文献是不实际的，因此清单规定授权实验室确立一项有关数据储存的规定，指定的数据文献保存时间，及最后报告之后哪些文献需要保存。NGS工作组建议，如果可行的话，实验室保存具有质量评分的序列文献（如FASTQ文献）或保存一种可以再生的文献档案（如BAM文献）。这些格式将会容许在后来重新分析。对于全基因组或其他较大的序列数据，保存FASTQ文献或原则档案格式较长时间将会耗费较高的费用，然而，新的压缩格式提供了一种近期的解决方案。这些文献要保存多长时间是一种复杂的问题，与文献大小，实验室文献储存能力，法医学考虑，地方、地区、国家对数据储存的规定。最后必须强调数据文献的储存时间与地方、地区、国家对数据储存的规定保持一致。版本的可追溯性运用NGS数据文献，生物信息分析途径的特定的版本对于每个病人的报告都是可以追溯的。用于NGS数据分析的特定版本的构成部分，从哪获得，有关的配制（命令行参数或其他配制项）都可以被追溯。之前已经提到，对于应用生物信息分析流程去分析NGS数据，特别是重要基于开源代码的软件时，其常常由多种程序包、脚本、数据库构成。单个的软件包或脚本性能，内置的或外部的数据库对于整个生物信息分析的性能具有重要的影响。因此，运用特定的生物分析流程对每个病人的数据进行分析，并生成报告是极为重要的。对于内部产生的脚本和软件包，如有改动也应以文献形式记录，但是这些不必要出目前病人的报告中。总的来说，应用特定实验室指定的分析流程（如：NGS流程V1.0.1）作为参照是可以被接受的。对于单个的组件和配备的组合，特定实验室指定的流程应当是独一无二的。因此，软件程序包、脚本、或内部外部的数据库的不同的版本的变化，需要一种新的独特的特定实验室并对其重新验证。异常记录实验室运用生物信息分析流程分析过程中，对病人案例的偏离SOP的异常日记进行保存维护。在生物信息分析流程分析过程中，与SOP有任何的差别都应当以文献从形式记录在异常日记中，涉及软件包、脚本、版本号、数据库、命令行或有关参数的变化。在生物信息分析流程分析过程中，任何运营失败都应记录在异常日记中，涉及问题，成果调查，所进行的修改，互相的交流，实验室主任的签订，委派人员等。异常日记规定与病人的报告保持联系，实验室主任可以选择任何有关的SOP偏差与征询医师进行交流。异常日记的文献化也应并入到质量保障月报告中。某些偏差，例如由于网络、电脑或储存失败需从新运营的，或需要不同的参数运营一种特定的环节，必须文献记录其成果输出和解释。例如，一种实验室也许会需要在特定工具里变化设立以充足的对一种病例的某一变异或基因区域进行充足的分析。偏差的因素的描述，以及产生偏差的特殊部分应记录在异常日记中。每一种偏差应链接到相应病人案例中，由实验室主任给出恰当的评价。由于有担保，这种偏差可以涉及在最后的报告中，或具体的与征询医师进行交流。在进行生物信息分析时与漏洞或故障有关的偏差需要记录在异常日记中。漏洞、受影响的案例，提出的矫正措施，必须通过实验室主任审核批准，签字，注明日期。也许由于硬件或软件或操作失误导致生物信息分析完全的失败，也应当记录在异常日记中，并以文献形式记录浮现的错误。NGS数据传送的保密性实验室应有一项规程，在NGS数据在内部或外部的储存、传送时保持时，应保证病人信息的保密和安全。二代测序产生的大量的数据，特别是基因测序，具有病人的姓名，出生日期，用药数量记录或其她的受保护的健康信息，用以对病人的身份鉴定。实验室必须建立严格的程序保证病人的私人信息受到保护。实验室必须强化某些有关基因组信息传送给医疗保健机构或第三方机构（如提供云计算资源或实验室服务类的机构）的规程。规程中应涉及数据加密，安全数据传送，访问时的顾客身份辨认鉴定。实验室应当遵循健康保险携带和账户行为能力的原则规定，例如与外部供应商建立商业合同，涉及严格的充足的评估合适的措施保障病人临床基因组数据发送和接受的机密性。序列变异位点的解释报告对变异位点的解释和报告应遵循专业机构推荐的指引方针。随着NGS技术的采用，临床实验室正在扩大她们的检测项目名单，如从单基因到基因模块再到外显子组，再到全基因组。显而易见的，实验室将对多种核心的在此前报道中引起疾病的变异位点进行NGS测序。目前，大部分的基因变异的实验报告都是遵循人类基因组变异协会命名法以及来自美国遗传医学协会（ACMG）的变异分类指引方针。术语命名的参照最初由Antonarakis和Dunnen在发布，但目前已经发生明显地变化及附加上某些内容。因此，建议实验室采用这些参照指南的最新网络版本。ACMG的变异分类的参照方针目前正在修订，新版本将涉及变异位点的解释的参照内容。建议应用ACMG的对于遗传疾病的分类系统作为参照，以提高变异位点分类的一致性。疾病和基因特异性修饰将应当记录在案。对于其她临床基因组检测（肿瘤或病原体诊断），实验室应当对变异分类持有最佳的判断，并采纳既有的参照指南。在某些文献中存在混淆的地方，如何使用副本文字进行变异的编号缺少一致性，在临床报告中也是如此。如由基因MUTYH产生的多种转录本，运用复杂的命名法去描述基因中的突变位点。其中两个重要的转录本是hMYHa1（NM-012222.2）和hMYHa3（NM-.1），由546和535个氨基酸构成的多肽。由于第3外显子的可变剪切导致hMYHa3比hMYHa3少33个核苷酸，修剪掉第3外显子5端11个氨基酸（GMIAECPGAPA）。大多数文献命名突变体时用的是hMYHa3，然而某些文献运用全长转录本hMYHa1进行命名。当对基因MUTYH出具检测报告时，或来自不同实验室对其的报告进行比较时，注明应用哪一种转录本进行命名是极为重要的。实验室已经将这两个最常用的转录本命名为p.Tyr165Cys和p.Gly382Asp。在临床报告中，当有名称变化时，实验室应当有一套机制去监管此类事情，并予以高度的注重。因此为了避免混淆，报告中要注释所用转录本的检索号及相应的蛋白排列。在一种样本中，对序列变异的观测的精确解释对于临床检测是极为重要的，由于它整合了变异对于功能基因所有也许的破坏和病人的临床表型，以拟定与否是这个变异引起的疾病。在过去的几年里，不同的名词术语已经应用到临床报告中，这意味着测序成果在不断变化，涉及致病性的，有害的，疾病有关联的，并带有possible，probably，likely，VUS和VOUS（未知的临床意义，未拟定的临床意义）修饰词。原则的序列变异参照已经推荐给遗传类疾病，但对于肿瘤和传染性病原体诊断仍然是不牢固的。对于遗传疾病，最普遍的应用的分类分为5个类别，（1）致病性的，（2）也许致病性的，（3）不拟定的临床意义，（4）也许良性的（5）良性的。当描述序列变异导致的临床影响时，实验室应引起注重，并仔细的考虑疾病因果关系的证据，一般人群中的频率，以及有关功能性研究。从大的工程项目（外显子组变异服务器，千人基因组筹划等）里免费的获得外显子组或全基因组测序数据后，实验室应当运用有关的数据库和计算机工具（如表所示）去注释序列变化对疾病的影响限度。对于大规模的检测，如外显子测序或全基因组测序，一种基因对疾病的因果关系的证据的评价，以及对变异类型、遗传形式的理解是非常重要的。例如没有拟定在发病中有具体作用的一种基因的功能性缺失变异，不可以假设其引起疾病。附带性遗传研究报告与临床诊断目的无关的附带性遗传研究报告，实验室应对此进行规范。当进行单基因、基因模块、外显子、全基因组测序测序时，临床上会产生重要的遗传研究发现，但与检测的体现型无关。这种现象同样也会出目前对某种特定疾病进行特定分析的状况中。其也许会涉及辨认与常染色体显性疾病，隐性疾病携带状态，普遍已知的药物反映等位基因标记有关的变异。着手运用NGS的临床检测，应当意识到这种偶尔的研究发现的潜力，并且对于与否以及如何报告这些这些实验检测应当有有关规定。近来发布的ACMG推荐规范，去报告医学上可操作的偶尔发现，其中涉及一种最低量的基因名单，如果发现已知的突变位点，就应出具其报告。实验室可以选择遵循ACMG的推荐，但并不是盼望一定要报告在这些基因中的发现。实验室就偶尔的发现，可以制定自己的规范。如果实验室的规范不对偶尔性发现进行报道，或者限制对一特定疾病报告偶尔的发现，对于此实验室应当清晰在检测报告中声明。当决定与否透漏给病人某一遗传信息时，道德准则也应考虑进来。公开附带性发既有关的安全级别由疾病的严重限度、临床可控限度、或其他风险效益因子决定。例如，常用的疾病风险等位基因，2型糖尿病，相较于遗传信息表白倾向于医学上可以或不可以治愈的恶性肿瘤或孟德尔遗传病而言，具有相对较低的风险，或药理学风险信息具有不同后果严重限度。所有的这些方面在将信息反馈给病人时都应当考虑到。NGS检测的转诊（外包）政策实验室应制定有关政策，用以规范在NGS检测转诊时，选择参照实验室或其他服务供应机构。转诊可以涉及整个的NGS检测进程或仅仅是实验室操作进程和生物信息分析进程的某一种。带有数据分析挑战性的复杂的NGS临床检测导致了老式实验检测模式的转变。尽管大多数临床实验室内部进行所有的NGS检测进程，目前已有不断增多的实验室将检测的部分进程外包给外部的公司。例如，CLIA实验室不进行大量的数据分析能力，将生物信息分析流程外包给外部公司。另一方面，生物信息供应商或有关机构具有较高的数据分析解决能力，但是不具有CLIA实验设施，将实验室操作进程外包给外部实验室。随着这种临床工作流程分工成为一种趋势，NGS工作组决定对的NGS检测单加入一种应对转诊规定的规定。CAP实验室检查规定单41350写明，实验室主任对于选择外部参照实验室或服务商负有责任。实验室主任应保证外部实验室操作进程或生物信息分析服务的性能质量。在某些具体的方面，实验室主任应考虑选择外部参照实验室或服务商以保证（1）可以完毕临床检测的周期对于临床需求来说是可接受的；（2）外部实验室提供的实验室操作进程是经CLIA验证的或可以满足CAP规定的原则；（3）外部生物信息分析成果的质量和精确性已通过高原则的验证。备注在过去相称短的一段时间，NGS已经由基本临床研究转化到临床诊断。应用NGS进行多基因模块、外显子组、全基因组测序的临床诊断实验室正在不断增长。CAP拟定了采用NGS的临床实验室需要制定针对于NGS的认证规定。本文突出简介了由NGS工作组制定的资格承认规定的内容，并清晰地解说工作组在发展这种临床需求的视角。NGS领域仍在继续迅速的演变提高，反映在仪器、试剂、分析工具及软件的升级。工作组以NGS资格认证规定的视角，应用基本的临床诊断规定，促培临床实验室采用NGS的责任，保证病人的安全。这些原则涉及流程环节的文献化，通过合适的验证示范证明实验室规程，制定质量管理体系。考虑到事实上技术的迅速变革，以及基于NGS检测类型、分析规模的不同，NGS工作组针对不同的NGS临床检测制定了某些常规规定，并容许实验室灵活的规范各自的措施途径以满足规定，此外同步提供了相称多的监管原则。应用于本文中的与命名、解释、及附带性成果报道合用于应用NGS技术进行遗传疾病检测。在之前解决有关单基因遗传病检测的认证需求时，事实上已经非常明确的制定了实验室原则。特别是有关命名术语，变异位点的解释，意外发现等，在之前都已有发布。工作组选择稍晚的对NGS的规定进行简介，以便有益于更好地技术革新，并在专业领域水平上形成共识。在推出一种有关的认证规定前，有关体细胞变异注释的指引手册需要制定出来。出于对体细胞变异解释指引手册的规定，NGS多基因模块和外显子检测已经被着重提出。基于NGS的分子肿瘤的认证规定涉及样品分析前的评价，以及对NGS检测成果的影响。分析前的某些指标，如福尔马林固定，石蜡包埋等对于成果的影响并没有被拟定，因此委员会觉得太具体的制定这些特殊规定为潮流早。由于基于NGS的诊断学不断进化和成熟，NGS工作组觉得NGS的认证规定需要回访并修订。随着资格认证的发布出版，CAP在执行时随后有许多来自于实验室的问题。特别是实验室定期的谋求有关需求的阐明，形成的问题为工作组提供反馈，指引讨论关注与改善和澄清这些规定。此外，NGS工作组结识到最初制定的认证规定不能覆盖所有临床实验室NGS追求的应用。操作上，NGS工作组通过了整整一年的时间进行电话会议和面对面会议。讨论作为这些活动的一部分，重点关注于修正扩大认证规定。随着CAP认证规定的周期性修订和出版，NGS工作组有能力正式的提交修订和扩展NGS认证规定。目前的认证规定已经通过一次正式的修订，额外的修订和扩大正在进行。工作组对反馈和此领域的经验进行进一步的商量，将来的NGS有关认证版本会不断的被修改和更新。