肌酐酶法测定的两点法分析

肌酐酶法测定的两点法分析摘要：目的：肌酐酶酶测定的两点分析。方法：通过两种试剂进行比较。反应温 度为37C,波长为500520纳米（主）/650纳米（次）；标准为15毫升；样品也 为15毫升；试剂I： 200毫升，孵育时间为300秒；试剂II： 50毫升，第一 点读数时间为120秒，第二点读数时间为300秒。结果：酶法具有去除肌酸的干 扰能力，有线性范围宽，精度高等特点。结论：两点法对肌酐酶法测点有良好的 作用。关键字：肌酐酶法两点法对于酶法测定肌酐，目前已报告的有四种方式，其中三种均为紫外测定，一 种为比色测定。然而，在相比之下比色测定在除去肌酸的干扰能力、线性范围、 精度等具有更高的优越性；市场上出售的商品试剂盒大多采用此法。但fossa ti 原法的反应时间比较长，且要做一血清空白以除去血清中肌酸的干扰，这样不适 合进行自动分析。自动分析的一般反应时间为十分钟，为了除去肌酸的干扰必须 采用两步法，反应时间要求在五分钟内达到。根据实验。必须将几种工具酶的用 量增加到fossati原法的五到十倍。然而，在实验过程中发现几种工具酶的水解 速率均比较缓慢，反应的线性时间比较长；所以，将其改成两点法或是速率法测 定，会取得很好的实验结果。这也体现出两点法的优势。1原理第一步反应：排除肌酸干扰 第二步反应：测定肌酐2材料与方法2.1 仪器：自动分析仪 HITACHI7170，Beckman Synchron CX5 和 Ciba Coring Express Plus。分光光度计 Beckman DU-640。2.2原料试剂：原料试剂采用的工具酶比较多，如：肌酐酰氨基水解酶，肌酸脒 基水解酶，肌氨酸氧化酶，棘根过氧化物酶，抗坏血酸氧化酶，这些工具酶均为 Boehringer Mannheim公司产品。3， 5-二氯-2-羟-苯磺酸（DHBA），4-氨基安替 比林（4-AAP）和肌酐，均选用适量的剂量。2.3应用试剂：试剂I：每升磷酸盐缓冲液（150 Mmol/L,pH为7.5）中含CRTase 20 kU,SO 6 kU，POD 1 kU,ASO 1 kU,DHBA 3 Mmol,K4Fe（CN）6 20 Mmol,和 4-AAP 4 Mmol。试剂II：每升含CRNase 50 kU。参考物（177Mmol/L）:精确称取肌酐20毫 克溶于1升经透析的混合血清中。2.4测定方法：自动分析通用参数、反应类型、两点法，反应温度为37摄氏度， 波长为500520 nm（主）/650 nm（次）；标准为15毫升，样品为15毫升，试剂 I： 200毫升，孵育时间300秒；试剂II： 50毫升，第一点读数时间：120秒，第二点读数时间300秒。2.5比较方法：采用比较的方法对其进行比较，Boehringer Mannheim的肌酐酶 法测定试剂盒，按照说明书上的要求进行测定。3实验和结果3.1去除肌酸干扰的能力：选择肌酐含量为495 Mmol/L的样品一份，分别加入肌 酸 34、67、101、134 Mmol/L 用本法测定，结果分别为 497.6、495.8、492.7、 489.1 Mmol/L,说明通过第一步反应至少能够去除134 Mmol/L的肌酸。3.2反应动力学曲线：选择不同浓度的样品按测定方法中的参数将样品和试剂I 进行混匀，在37C水浴中300秒，然后加入试剂II,立即用Beckman DU-640分 光光度计自动记录动力学曲线，说明样品浓度在2740 Mmol/L(31 mg/dl)以下时 120-300秒间呈线性，数据表明，在此时间段内可以用两点法进行测定。3.3线性范围：按NCCLS(EP6-P)的评价方案，选择低值(97Mmol/L)和高值 (2749Mmol/L)样品各一份等量混合均匀产生中间值，再分别将中间值和低值、中 间值和高值等量混合均匀,共产生5个不同值，用三种分析仪分别用两点法从低 值到高值,然后从高值到低值进行测定，求得均值为Y,以理论值为X,进行回归分 析，三种仪器的回归方程如下：Hitachi 7170:Y=0.9912X+9.55,r=0.9999； Beckman CX5:Y=1.0799X-32.56， r=0.998； Ciba-Coning:Y=0.997X-39.4，r=0.9987。结果均有很宽的线性范围。3.4精密度：按NCCLS(EP5-T2)的评价方法，选择88.7和752.3 Mmol/L的样品 各一份，用Beckman DU68分光光度计每天上下午双份进行测定，测时间为10 天，结果：批内 CV 2.73%和 0.71%；批间 CV 4.43%和 2.93%；总 CV 4.92%和 2.73%。 三种仪器二个样品的批内CV： Hitachi 7170为0.38和0.34%； Beckman ACX5 为 1.44 和 1.31%以及 Ciba-Coring 为 0.58 和 0.43%。3.5回收率：选择肌酐含量82.7 Mmol/L的混合血清一份，分别加入221，442 和884 Mmol/L用本法测定，回收率在99.66%100.9%。3.6比较方法：按NCCLS(EP9-P)的评价方案，选择含量在352 655 Mmol/L间 的临床样品40份，分别用本法(Y)和BM公司的试剂盒(X)测定，结果X=411.1 Mmol/L,Y=410.2Mmol/L, Y=0.973X+10.33 Mmol/L,r=0.9995，二者息息相关。3.7参考值测定：选择健康体检样品275份(其中男183份，女92份)，年龄在 2360岁。列入统计者均无肾病史，肾功能检验均正常。在Beckman CX5分析 仪上用本法测定，结果，男子土s为98.418.9 Mmol/L之间，范围为60.6136.2 Mmol/L 之间；女子土s 为 77.816.5Mmol/L，范围在 44.8110.8Mmol/L 之间。4讨论41根据研究结果可得，肌酐酶法测定有四条反应途径，选择比色测定是由于其 灵密度高，线性范围宽，几种工具酶的稳定性比较好。4.2酶法测定肌酐的特异性远优于Jaffe氏法，血清中的内源性肌酸可用二步反 应清除，我们在反应体系中加入亚铁氰化钾和抗坏血酸氧化酶以消除Trinder 反应中的胆红素和维生素C的干扰。Jaffe法测定的是肌酐与苦味酸反应生成橘 红色的苦味酸肌酐复合物的反应速率，而该反应属于一级反应动力学。在碱性反 应环境当中，样本中的肌酐或是干扰物质苦味酸的反应速率不同，需要选择适宜 的检测时间，一般都是在25-60秒之间，避开干扰物质对反应的干扰，提高肌酐 测定的特殊性。然而，随着自动分析仪的普及，检测者对Jaffe反应进行了各类 的改进，用来提高检测结果的真实性，使检测结果更加准确。4.3除了两点法，还有肌氨酸氧化酶法，这种方法是肌酐在肌酐酶的催化下水解 生成的肌酸，在肌酸酶的催化下肌酸水解产生肌氨酸和尿素。然而，肌氨酸在肌 氨酸氧化酶的催化下氧化生成甘氨酸、甲醛和双氧水；最后偶联Trinder反应， 比色测定，然而，镁离子的存在对测定结果有明显的干扰，其他物质则没有干扰， 该种方法与Jaffe法相比，线性范围宽是Jaffe的九倍，上限达到1760“mol/L， 其精度与准确度相对Jaffe都比较高，胆红素和血红蛋白的影响都比较小4.4工作试剂保存在四摄氏度左右至少可以稳定在一个月之内，但在保存的过程 中，工具酶或是其他组织的少许变动均可影响反应速率，因此，要求每天都必须 定标。参考文献：1 程海平.血清中肌酐的检测方法及其进展J.检验医学与临床，2009,102 马鸿娟、刘胜林.两种肌酐测定在全自动生化分析仪上的应用及评价J. 哈尔滨医药，2006年06期3 唐金玉、崔四放、李海林.CEMB HCL为色原的酶法测定血清肌酐试剂盒的 评价J.包头医学院学报，2011年01期4 居漪.酶法和Jaffe速率法测定血清肌酐的方法学比较J.上海医学检验 杂志，20025 杨芳芳、杨晓东.宜昌地区血清肌酐酶法参考区间调查J.国际检验医学杂 志，2013年04期6 姚艳霞.血清肌酐测定方法学的局限性及临床应用的相对性中国实验诊断 学，2011,15（7）： 1225-1227