免疫组织化学及相关技术：第三章（1） 细胞凋亡及其形态学检测方法

免疫组织化学及相关技术免疫组织化学及相关技术 第三章第三章 细胞凋亡（细胞凋亡（Apoptosis）及其形态学检测方法及其形态学检测方法 基础医学院基础医学院 组胚教研室组胚教研室 p 细胞死亡细胞死亡 =细胞凋亡？细胞凋亡？(cell death)(apoptosis)(cell death)(apoptosis)p 细胞坏死细胞坏死 =细胞凋亡？细胞凋亡？(necrosis)(apoptosis)(necrosis)(apoptosis)p 程序性细胞死亡程序性细胞死亡PCDPCD (programmed cell death)(programmed cell death)=细胞凋亡细胞凋亡 (apoptosis)(apoptosis)？What is Apoptosis？How did that happen？How did that happen？PCD(programmed cell death):细胞启动内部死亡程序，有利必须，主动死亡。细胞启动内部死亡程序，有利必须，主动死亡。p八种模式生物之一：线虫八种模式生物之一：线虫pPRIZED：Brenner,Sulston and Horvitz shared Physiology or Medicine Nobel Prize（2002）p“for their discoveries of how healthy cells carry orders to kill themselves.The discoveries involve a process called programmed cell death,which is necessary for tissue and organ development.”p线虫线虫 （发育过程细胞数目变化（发育过程细胞数目变化1090-131=959cells）结合荧光显微技术的结合荧光显微技术的CLSMCLSM 形态学研究表明：形态学研究表明：Normal Apoptosis 细胞凋亡过程细胞凋亡过程 细胞凋亡（细胞凋亡（Apo+ptosisApo+ptosis）p定义：为维持内环境稳定，由定义：为维持内环境稳定，由基因控制基因控制的的细胞自细胞自主的有序主的有序的死亡。的死亡。p细胞发生凋亡时，形态就像树叶或花的自然凋落细胞发生凋亡时，形态就像树叶或花的自然凋落一样。借用希腊文一样。借用希腊文“Apo+ptosisApo+ptosis”。p与细胞坏死不同。细胞凋亡不是一件被动的过程，与细胞坏死不同。细胞凋亡不是一件被动的过程，而是而是主动过程主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用；它并不是病理条件下，自体以及调控等的作用；它并不是病理条件下，自体损伤的一种现象，而是为更好地适应生存环境而损伤的一种现象，而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。主动争取的一种死亡过程。Programmed Cell Death(PCD)Programmed Cell Death(PCD)是一个是一个功能性概念功能性概念多用于发育生物学，指多细胞生物体中某些细胞的死多用于发育生物学，指多细胞生物体中某些细胞的死亡是预定、并受到严格控制的正常组成部分，即亡是预定、并受到严格控制的正常组成部分，即在发在发育中预定时间空间的细胞死亡方式：育中预定时间空间的细胞死亡方式：如蝌蚪变态过程如蝌蚪变态过程、指间蹼的消失、视网膜发育以及免疫系统的正常发、指间蹼的消失、视网膜发育以及免疫系统的正常发育等。散在、逐个地从正常组织中死亡和消失，机体育等。散在、逐个地从正常组织中死亡和消失，机体无炎症反应，对整个机体发育是有利和必须的。无炎症反应，对整个机体发育是有利和必须的。细胞凋亡细胞凋亡是一个是一个形态学概念形态学概念，指与细胞坏死不同，指与细胞坏死不同的、受到基因控制的、细胞主动死亡形式。的、受到基因控制的、细胞主动死亡形式。ApoptosisApoptosis与与PCDPCD的区别？的区别？细胞凋亡细胞凋亡是对环境刺激或缓和损伤产生的是对环境刺激或缓和损伤产生的有序有序变化变化的的主动死亡主动死亡过程。表现为过程。表现为细胞皱缩细胞皱缩，细胞膜完细胞膜完整整，形成，形成膜包凋亡小体膜包凋亡小体，内含正常形态细胞器，最，内含正常形态细胞器，最后被吞噬清除。整个过程后被吞噬清除。整个过程无细胞内容物泄露无细胞内容物泄露，不引，不引起炎症反应。常单个或少数凋亡细胞散在分布。起炎症反应。常单个或少数凋亡细胞散在分布。细胞坏死细胞坏死是因受到强烈理化或生物因素作用引是因受到强烈理化或生物因素作用引起的细胞起的细胞无序变化无序变化的病理性的病理性被动死亡被动死亡过程。表现为过程。表现为细胞胀大，细胞膜破裂细胞胀大，细胞膜破裂，形态破碎杂乱，形态破碎杂乱，细胞内容细胞内容物泄露，物泄露，核变化较慢，核变化较慢，DNADNA降解不充分，常引起局部降解不充分，常引起局部严重炎症反应。坏死细胞常大片分布。严重炎症反应。坏死细胞常大片分布。ApoptosisApoptosis与与NecrosisNecrosis的区别？的区别？细胞死亡的方式细胞死亡的方式pNecrosisNecrosis细胞坏死（被动死亡）细胞坏死（被动死亡）pPCDPCD程序性细胞死亡（主动死亡）程序性细胞死亡（主动死亡）nApoptosisApoptosis（凋亡）：形态特征？检测方法？（凋亡）：形态特征？检测方法？nAutophagyAutophagy（自噬）：（自噬）：nParaptosis Paraptosis（副凋亡）：由线粒体和内质网（副凋亡）：由线粒体和内质网肿胀造成的胞浆空泡化肿胀造成的胞浆空泡化,胞膜完整。胞膜完整。nAnoikisAnoikis（失巢凋亡）：（失巢凋亡）：新进展：失巢凋亡（新进展：失巢凋亡（AnoikisAnoikis）p由于细胞与细胞外基质或相邻细胞脱离接触而由于细胞与细胞外基质或相邻细胞脱离接触而诱发的细胞死亡。诱发的细胞死亡。p失巢凋亡作为一种特殊的程序化细胞死亡形式，失巢凋亡作为一种特殊的程序化细胞死亡形式，在机体发育、组织自身平衡、疾病发生和肿瘤在机体发育、组织自身平衡、疾病发生和肿瘤转移中起重要作用。转移中起重要作用。p对失巢凋亡的深入研究逐步揭示了其分子机制：对失巢凋亡的深入研究逐步揭示了其分子机制：通过传统的细胞凋亡途径诱导细胞死亡。通过传统的细胞凋亡途径诱导细胞死亡。Bcl-Bcl-2 2和某些和某些Bcl-2Bcl-2相关蛋白广泛参与细胞失巢凋亡相关蛋白广泛参与细胞失巢凋亡的调节，多种蛋白激酶信号分子参与失巢凋亡的调节，多种蛋白激酶信号分子参与失巢凋亡的信号转导。的信号转导。新进展：自噬（新进展：自噬（autophagyautophagy）p自噬是凋亡之外的另一种程序性细胞死亡方式。自噬是凋亡之外的另一种程序性细胞死亡方式。p细胞内细胞内“自己吃自己自己吃自己”：将胞质中大分子物质（如蛋白质、：将胞质中大分子物质（如蛋白质、RNARNA、过量储存的糖原等）和一些细胞内源性底物（包括由各、过量储存的糖原等）和一些细胞内源性底物（包括由各种原因引起的衰老、破损细胞器）用单位膜包裹，形成囊泡种原因引起的衰老、破损细胞器）用单位膜包裹，形成囊泡再大量降解，实现再循环，以维持细胞自身的稳定。这个过再大量降解，实现再循环，以维持细胞自身的稳定。这个过程对于细胞成分更新、保持旺盛的生理状态至关重要。程对于细胞成分更新、保持旺盛的生理状态至关重要。p细胞自噬参与绝大多数长半衰期蛋白质的降解。在进化过程细胞自噬参与绝大多数长半衰期蛋白质的降解。在进化过程中高度保守，从酵母、果蝇到脊椎动物和人都可以找到参与中高度保守，从酵母、果蝇到脊椎动物和人都可以找到参与自噬的同源基因。自噬的同源基因。pLC3 LC3 是哺乳动物中酵母是哺乳动物中酵母ATG8(Aut7/Apg8)ATG8(Aut7/Apg8)基因的同源物，定基因的同源物，定位于位于前自噬泡和自噬泡（自噬体）膜表面，是细胞自噬体的前自噬泡和自噬泡（自噬体）膜表面，是细胞自噬体的通用标记物。自噬相关分子通用标记物。自噬相关分子Beclin1Beclin1 。LC3、Beclin-1与与autophage一、一、细胞凋亡的形态学特征细胞凋亡的形态学特征 二、细胞凋亡的调控二、细胞凋亡的调控 (简略）简略）三、细胞凋亡的形态学检测方法三、细胞凋亡的形态学检测方法四、其他检测细胞凋亡的方法四、其他检测细胞凋亡的方法五、细胞凋亡检测方法的选择五、细胞凋亡检测方法的选择本章主要内容本章主要内容一、细胞凋亡的形态学特征一、细胞凋亡的形态学特征213465细胞细胞坏死坏死细胞细胞 凋亡凋亡pSEMSEMp特点：细胞迅速皱缩，体积减小，细胞连接消失；特点：细胞迅速皱缩，体积减小，细胞连接消失；表面卷曲，质膜皱折或起泡，但仍然完整。表面卷曲，质膜皱折或起泡，但仍然完整。一、细胞凋亡的形态学特征一、细胞凋亡的形态学特征pTEMTEMp特点：染色质凝缩并边集，新月形或环形；特点：染色质凝缩并边集，新月形或环形；进而核碎裂，核膜反折包卷形成致密团块；进而核碎裂，核膜反折包卷形成致密团块；最后芽生形成凋亡小体。最后芽生形成凋亡小体。一、细胞凋亡的形态学特征一、细胞凋亡的形态学特征 正常细胞与凋亡细胞比较正常细胞与凋亡细胞比较 坏死与凋亡的异同坏死与凋亡的异同A A、细胞凋亡与坏死在生物化学特征上的比较细胞凋亡与坏死在生物化学特征上的比较 细胞凋亡细胞凋亡细胞坏死细胞坏死生理因素诱导的主动性坏死生理因素诱导的主动性坏死胚胎、变态发育胚胎、变态发育非生理因素造成的意外被动性死亡非生理因素造成的意外被动性死亡毒素、缺血毒素、缺血需要能量需要能量不需要能量不需要能量需要大分子合成需要大分子合成不需要核酸和蛋白质的合成不需要核酸和蛋白质的合成有新基因从头转录有新基因从头转录mRNAmRNA增多增多没有新基因转录没有新基因转录mRNAmRNA丢失丢失染色质片段化降解为染色质片段化降解为DNADNA染色质染色质DNADNA被随机降解为弥散片段被随机降解为弥散片段 坏死与凋亡的异同坏死与凋亡的异同B B、细胞凋亡与坏死在形态学上的差别、细胞凋亡与坏死在形态学上的差别 细胞凋亡细胞凋亡细胞坏死细胞坏死单细胞丢失单细胞丢失细胞成群丢失细胞成群丢失细胞膜发泡，膜仍然完整细胞膜发泡，膜仍然完整细胞膜不完整细胞膜不完整细胞膜内陷，将细胞分割成凋细胞膜内陷，将细胞分割成凋亡小体亡小体细胞肿胀、溶解细胞肿胀、溶解细胞皱缩细胞皱缩细胞溶解细胞溶解不发生炎症不发生炎症发生严重炎症反应发生严重炎症反应溶酶体完整、增多溶酶体完整、增多溶酶体裂解溶酶体裂解染色质均一凝集染色质均一凝集染色质凝集成块，不均一染色质凝集成块，不均一细胞自噬与细胞凋亡的异同细胞自噬与细胞凋亡的异同细胞凋亡细胞凋亡细胞自噬细胞自噬单细胞丢失单细胞丢失单细胞丢失单细胞丢失细胞膜发泡，膜仍然完整细胞膜发泡，膜仍然完整细胞膜完整细胞膜完整细胞膜内陷，将细胞分割成细胞膜内陷，将细胞分割成凋亡小体凋亡小体细胞部分结构被胞质内双层膜包裹细胞部分结构被胞质内双层膜包裹形成自噬体形成自噬体染色质均一凝集染色质均一凝集染色质不凝集染色质不凝集形成核碎片形成核碎片不形成核碎片不形成核碎片apotosisnecrosisDeath by apoptosis is a neat，orderly process.autophagepRelated genes:促进：促进：ced3、Caspase3、Fas、p53、Bax 抑制：抑制：Bcl2、IAP等等pMolecular pathways:(1)Extrinsic pathway:Fas signaling pathway （membrane receptor-mediated pathway of apoptosis）(2)Intrinsic pathway：Mitochondrial pathway二、细胞凋亡的机制（简略）二、细胞凋亡的机制（简略）Qiagen公司公司pFas pathway of ApoptosispFAS（死亡结构（死亡结构域）域）FasL结合结合 激活激活Caspase8二、细胞凋亡的机制二、细胞凋亡的机制 （简略）（简略）pMitochondrial-mediated pathway of Mitochondrial-mediated pathway of apoptosis apoptosis（细胞凋亡调控中心）（细胞凋亡调控中心）p信号信号-线粒体跨膜电位改变线粒体跨膜电位改变-膜通透性改变膜通透性改变-相关凋亡蛋白、相关凋亡蛋白、细胞色素细胞色素C C释放释放-引发凋亡引发凋亡pCytCCytC释放是引发细胞凋亡的关键释放是引发细胞凋亡的关键 王晓东：王晓东：20042004年当选为美国科学院年当选为美国科学院 有史以来最年轻的院士。有史以来最年轻的院士。QiagenQiagen公司公司phttp:/ (二二)荧光显微镜术荧光显微镜术 (三三)透射电镜技术透射电镜技术（1 1）未染色：未染色：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞凋亡细胞的体积变小、变形，细胞 膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。小体。贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。（2 2）染色后：染色后：常用常用HEHE染色、姬姆萨染色等。凋亡染色、姬姆萨染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质细胞的染色质浓缩、边缘化，核膜裂解、染色质分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。分割成块状和凋亡小体等典型的凋亡形态。(一一)普通光镜技术普通光镜技术/倒置显微镜术倒置显微镜术 1.1.苏木精苏木精-伊红染色（伊红染色（HEHE染色）染色）取材：射线照射小鼠取胸腺或取材：射线照射小鼠取胸腺或Peyers patch，why？AB脑皮质，脑皮质，CD海马海马CA1区。区。深低温停循环组（深低温停循环组（B、D）损伤程度明显重于单纯体外循组（损伤程度明显重于单纯体外循组（A、C）。）。嗜红染色肿胀的神经元。嗜红染色肿胀的神经元。核固缩和（或）核碎裂的萎缩神经元核固缩和（或）核碎裂的萎缩神经元。2.2.甲基绿甲基绿-派洛宁染色派洛宁染色 甲基绿使甲基绿使DNADNA特异性着绿色，派洛宁使特异性着绿色，派洛宁使RNARNA染红色染红色 区分标准：区分标准：正常正常 凋亡（体积小）凋亡（体积小）坏死坏死 甲基绿甲基绿-DNA-DNA：核绿色：核绿色+核核+，固缩，固缩 核核+，固缩，固缩 哌喏宁哌喏宁-RNA-RNA：胞质红色：胞质红色+胞质（胞质（mRNAmRNA）+胞质胞质-3.3.GiemsaGiemsa染色染色 用于血液和造血组织来源的细胞或白血病等有粒细胞的染色。用于血液和造血组织来源的细胞或白血病等有粒细胞的染色。Wright Giemsa（天青（天青+伊红）伊红）3.3.GiemsaGiemsa染色染色 一般用于血液和造血组织来源的细胞或白血病细胞一般用于血液和造血组织来源的细胞或白血病细胞等有粒细胞的染色。等有粒细胞的染色。4 4其他染色方法其他染色方法 5 5注意事项注意事项（1 1）甩片时细胞浓度要适当，过密或过稀均会影响观）甩片时细胞浓度要适当，过密或过稀均会影响观察效果察效果（无甩片机的情况下，可做细胞涂片，力求均匀）。（无甩片机的情况下，可做细胞涂片，力求均匀）。（2 2）甩片后固定比先固定后再甩片效果为好。）甩片后固定比先固定后再甩片效果为好。原因原因 ：p 固定后细胞收缩严重，造成所有细胞固定后细胞收缩严重，造成所有细胞 体积变小，体积变小，会影响对细胞凋亡的形态学观察。会影响对细胞凋亡的形态学观察。p 固定后的细胞与载玻片的粘附力下降，容易脱片。固定后的细胞与载玻片的粘附力下降，容易脱片。(二二)荧光显微镜技术荧光显微镜技术 /共聚焦扫描显微镜术共聚焦扫描显微镜术原理：原理：荧光素标记组织细胞中的某些成分，荧光素标记组织细胞中的某些成分，激发光下观察荧光的分布部位和数量，激发光下观察荧光的分布部位和数量，判断细胞的生活状态。判断细胞的生活状态。关键：关键：什么物质在凋亡过程中发生了变化；什么物质在凋亡过程中发生了变化；什么荧光素能与之结合标记。什么荧光素能与之结合标记。1.PI1.PI染色染色原理：原理：碘化丙锭（碘化丙锭（PIPI）是能与细胞内）是能与细胞内DNADNA和和RNARNA的特异性结合荧光染料。结合后于荧光显微镜下观的特异性结合荧光染料。结合后于荧光显微镜下观察察 细胞核细胞核DNA+PIDNA+PI为黄色，为黄色，细胞质细胞质RNA+PIRNA+PI为红色。为红色。结果评判：结果评判：细胞凋亡时，由于核浓缩或断裂，凋细胞凋亡时，由于核浓缩或断裂，凋亡的细胞核小且荧光染色深，细胞核或细胞质内可亡的细胞核小且荧光染色深，细胞核或细胞质内可见浓染致密的颗粒块状荧光。见浓染致密的颗粒块状荧光。PI染色显示凋亡细胞染色显示凋亡细胞 注意事项：注意事项：（1 1）PIPI是荧光染料，储存时应放入棕色瓶内是荧光染料，储存时应放入棕色瓶内 （2 2）由于）由于PIPI是强的致癌剂，故操作过程应带手套，是强的致癌剂，故操作过程应带手套，一旦污染应用大量清水冲洗，所用器械也应妥善处一旦污染应用大量清水冲洗，所用器械也应妥善处理。理。（3 3）荧光强度会逐渐衰减，观察时应注意。）荧光强度会逐渐衰减，观察时应注意。2.2.其他荧光染色其他荧光染色 原理：原理：其他常用其他常用DNADNA特异性染料有特异性染料有Hoechst,Hoechst,DAPIDAPI（为半通透性，用于常规固定细胞的染色）。（为半通透性，用于常规固定细胞的染色）。这些染料与这些染料与DNADNA的结合是非嵌入式的，主要结合在的结合是非嵌入式的，主要结合在DNADNA的的A-TA-T碱基区。紫外光激发时发明亮蓝色荧光。碱基区。紫外光激发时发明亮蓝色荧光。结果评判：结果评判：细胞凋亡过程中核染色质的形态学改细胞凋亡过程中核染色质的形态学改变可分为三期：变可分为三期：期期的细胞核呈波纹状（的细胞核呈波纹状（rippledrippled）或呈折缝样）或呈折缝样（creasedcreased），部分染色质出现浓缩状态；），部分染色质出现浓缩状态；aa期期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；bb期期的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。的细胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。其他荧光染色其他荧光染色 吖啶橙吖啶橙 /溴化乙锭双染（溴化乙锭双染（AO/EBAO/EB)（绿色）（红色）早期凋亡：核绿色,固缩圆形晚期凋亡：核橘红色，斑块状坏死细胞：膜破，均质红色(三三)透射电镜技术（透射电镜技术（TEMTEM）观察细胞内部结构，观察细胞内部结构，分辨率为分辨率为0.1-0.2nm,0.1-0.2nm,可放大几万可放大几万-几十万倍。几十万倍。0.2nm0.2um透射电镜（透射电镜（TEMTEM）原理与成像图片）原理与成像图片TEM：淋巴细胞：淋巴细胞1 1器材器材:超薄切片机，透射电子显微镜超薄切片机，透射电子显微镜2 2材料和试剂材料和试剂:25%25%戊二醛，锇酸戊二醛，锇酸,70%,70%乙醇配制的醋酸双氧铀，乙醇配制的醋酸双氧铀，氧化丙烯，氧化丙烯，Epon812Epon812，枸橼酸铅。，枸橼酸铅。3 3操作步骤操作步骤:注意锇酸剧毒注意锇酸剧毒(三三)透射电镜技术（透射电镜技术（TEMTEM）结果评判结果评判：p凋亡细胞体积变小，凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。细胞质浓缩。p凋亡凋亡期：细胞核内期：细胞核内染色质高度盘绕，出染色质高度盘绕，出现许多称为气穴现象现许多称为气穴现象的空泡结构；的空泡结构；paa期细胞核的染色质期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；高度凝聚、边缘化；p细胞凋亡晚期，细胞细胞凋亡晚期，细胞核裂解为碎块，产生核裂解为碎块，产生凋亡小体。凋亡小体。(三三)透射电镜技术（透射电镜技术（TEMTEM）4.4.结果分析：结果分析：凋亡小体形成凋亡小体形成凋亡小体被巨噬细胞吞噬凋亡小体被巨噬细胞吞噬TEM区分细胞凋亡和自噬区分细胞凋亡和自噬（一）凝胶电泳法（一）凝胶电泳法 最常用的判别凋亡的方法之一。最常用的判别凋亡的方法之一。细胞凋亡典型的生化标志是核酸内切酶导致核小细胞凋亡典型的生化标志是核酸内切酶导致核小体间连接区的双链体间连接区的双链DNADNA随机断裂，由于其所产生的随机断裂，由于其所产生的DNADNA片段的大小均为寡核小体片段的大小均为寡核小体DNADNA长度长度(180-200bp)(180-200bp)的整倍的整倍数，因而在琼脂糖凝胶电脉中呈现规则的数，因而在琼脂糖凝胶电脉中呈现规则的“梯子梯子”形形(DNA ladder)(DNA ladder)。充分非必要条件：充分非必要条件：DNA ladderDNA ladder的出现可作为判别的出现可作为判别细胞凋亡的特异性指标，细胞凋亡的特异性指标，但若未检出不能排除凋亡的但若未检出不能排除凋亡的可能（有的凋亡出现广泛单链可能（有的凋亡出现广泛单链DNADNA缺口而无缺口而无DNA DNA ladderladder）。）。四、其他检测细胞凋亡的方法四、其他检测细胞凋亡的方法（一）凝胶电泳法（一）凝胶电泳法操作步骤操作步骤:（1 1）单细胞悬液的制备：）单细胞悬液的制备：（2 2）提取总）提取总DNADNA：（3 3）琼脂糖凝胶电泳：）琼脂糖凝胶电泳：p正常细胞正常细胞 基因组基因组DNADNA，大片段，大片段凝胶电泳法结果分析：凝胶电泳法结果分析：Lane1:0.075GyX射线射线 照射后照射后8hLane2:0.075GyX射线射线 照射后照射后12hLane3:假照组假照组Lane4:2GyX射线照射射线照射 后后8h Lane5:2GyX射线照射射线照射 后后12hLane6:Marker 1 2 3 4 5 6 p凋亡细胞凋亡细胞 180-200bp DNA ladder180-200bp DNA ladder凝胶电泳法结果分析：凝胶电泳法结果分析：p坏死细胞坏死细胞 随机断裂，随机断裂，DNA smearDNA smear凝胶电泳法结果分析：凝胶电泳法结果分析：结果分析：？结果分析：？Apoptosis induced Apoptosis induced by Cyt Cby Cyt CLane 1:0hLane 1:0h 2:1h 2:1h 3:2h 3:2h 4:3h 4:3h 5:4h 5:4h 6 6：controlcontrol 7 7：MarkerMarker 凝胶电泳法新发展：凝胶电泳法新发展：LM-PCR Ladder(LM-PCR Ladder(连接介导的连接介导的PCRPCR检测检测)p当凋亡细胞较少以及样品量很少（如活体组织切片）当凋亡细胞较少以及样品量很少（如活体组织切片）时，直接琼脂糖电泳可能观察不到核时，直接琼脂糖电泳可能观察不到核DNADNA的变化。的变化。通过通过LM-PCR,LM-PCR,连上特异性接头，专一性地扩增梯度连上特异性接头，专一性地扩增梯度片段，从而灵敏地检测凋亡时产生梯度片段。片段，从而灵敏地检测凋亡时产生梯度片段。pLM-PCR LM-PCR 检测是半定量的，因此可进行不同样品间检测是半定量的，因此可进行不同样品间凋亡程度的比较。凋亡程度的比较。p类似的改进：？类似的改进：？如果细胞量很少，还可在分离提纯如果细胞量很少，还可在分离提纯DNADNA后，用后，用32P-ATP32P-ATP和脱和脱氧核糖核苷酸末端转移酶（氧核糖核苷酸末端转移酶（TdTTdT）使）使DNADNA标记，然后进行电标记，然后进行电泳和放射自显影，观察凋亡细胞中泳和放射自显影，观察凋亡细胞中DNA ladderDNA ladder的形成。的形成。原理：原理：凋亡细胞因内源性核酸酶激活而产生单股或双凋亡细胞因内源性核酸酶激活而产生单股或双股断链股断链DNADNA。在细胞或组织中加入外源性核苷酸，通过某种在细胞或组织中加入外源性核苷酸，通过某种酶的催化，外源性核苷酸将与凋亡细胞的单股或双酶的催化，外源性核苷酸将与凋亡细胞的单股或双股断链股断链DNADNA相结合，再通过一定的显示系统使之显示相结合，再通过一定的显示系统使之显示出来，从而鉴别凋亡细胞。出来，从而鉴别凋亡细胞。不考虑所用的催化酶时，统称为原位末端标记不考虑所用的催化酶时，统称为原位末端标记(ISEL)(ISEL)。(二二)原位末端标记法原位末端标记法（in situ end-labeling，ISEL）p末端脱氧核苷酸转移酶末端脱氧核苷酸转移酶介导的介导的dUTPdUTP缺口末端标记缺口末端标记 （terminal deoxynucleotidyl transferaseterminal deoxynucleotidyl transferase，TdTTdT）（TUNELTUNEL法法 ）pDNADNA聚合酶聚合酶I I或或KlenowKlenow大片段大片段介导的原位缺口平移介导的原位缺口平移 （in situ nick translation,INSTin situ nick translation,INST法）法）(二二)原位末端标记法原位末端标记法（in situ end-labeling，ISEL）1.TUNEL1.TUNEL法法pTUNELTUNEL：末端脱氧核苷酸转移酶介导的：末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTPdUTP缺口缺口末端标记末端标记(terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick end labeling)。p基本原理基本原理：TdTTdT能将外源性的能将外源性的FITC FITC、生物素、生物素或或地高辛地高辛标记的标记的dUTPdUTP连接到凋亡细胞核的连接到凋亡细胞核的DNADNA断链断链的的3 3-羟基羟基(3(3-OH)-OH)末端（末端（DNADNA断链可是单股断链，断链可是单股断链，也可是双股断链）。因此，也可是双股断链）。因此，TUNELTUNEL法可检测凋亡法可检测凋亡细胞核中的单股和双股细胞核中的单股和双股DNADNA断链，用于组织切片断链，用于组织切片及培养细胞的及培养细胞的原位检测原位检测。F I T CF I T C 标 记 的标 记 的dUTPdUTP与细胞内与细胞内DNADNA断裂处结合断裂处结合 用结合了过氧化物用结合了过氧化物酶酶(POD)(POD)的抗荧光的抗荧光素抗体与之反应素抗体与之反应用用PODPOD的底物的底物DABDAB显色显色TUNELTUNEL反应原理反应原理 1 1器材器材:恒冷箱切片机或石蜡切片机，光学显恒冷箱切片机或石蜡切片机，光学显微镜，冰箱，温箱。微镜，冰箱，温箱。2 2主要材料和试剂主要材料和试剂:昆明小鼠，昆明小鼠，OCTOCT包埋液，包埋液，TUNELTUNEL试剂盒，乙醇，多聚甲醛，甲醇，试剂盒，乙醇，多聚甲醛，甲醇，TritonX-TritonX-100100等。等。3 3操作步骤操作步骤（略）（略）（1 1）组织标本制备：）组织标本制备：（2 2）将组织切片从冰箱中取出，室温干燥）将组织切片从冰箱中取出，室温干燥30min30min。入新鲜配制的。入新鲜配制的4%4%多聚甲醛（多聚甲醛（pH7.4 PBS pH7.4 PBS 配制）。配制）。室温固定室温固定30min30min。（3 3）PBSPBS洗洗3 3次，次，5min/5min/次。次。TUNELTUNEL实验简介实验简介（4 4）0.3%H2O20.3%H2O2甲醇甲醇30min30min，封闭内源性过氧化物酶。，封闭内源性过氧化物酶。（5 5）入）入0.1%0.1%Triton X-100Triton X-100枸橼酸钠枸橼酸钠缓冲液中缓冲液中 冰浴冰浴2min2min。（6 6）PBSPBS漂洗漂洗3 3次，次，5min/5min/次。次。（7 7）加）加TUNELTUNEL反应混合液反应混合液3737反应反应11.5 h11.5 h。（8 8）PBSPBS漂洗漂洗3 3次，次，5min/5min/次。次。（9 9）加）加PODPOD反应液反应液3737，30 min30 min。（1010）PBSPBS漂洗漂洗3 3次，次，5min/5min/次。次。（1111）DABDAB显色显色5 5 10 min10 min（1212）甲基绿（或苏木精）复染核，脱水，透明，）甲基绿（或苏木精）复染核，脱水，透明，封片，镜检封片，镜检TUNELTUNEL实验简介实验简介TUNELTUNEL法显示法显示2Gy X2Gy X射线全身照射射线全身照射12h12h后，小鼠胸腺后，小鼠胸腺皮质中可见大量皮质中可见大量TUNELTUNEL阳性的凋亡细胞。阳性的凋亡细胞。TUNELTUNEL实验结果分析实验结果分析-1-1TUNELTUNEL实验结果分析实验结果分析-2-2p荧光易衰减荧光易衰减p不能长期保存不能长期保存p先荧光观察，先荧光观察，再再DABDAB显色观察，显色观察，可长期保存可长期保存TUNELTUNEL实验结果分析实验结果分析-3-3FITCFITC标记标记dUTPdUTPTUNELTUNEL实验结果分析实验结果分析-4-4（巨噬细胞标记）（巨噬细胞标记）TUNELTUNEL实验结果分析实验结果分析-4-4TUNELTUNEL应用应用（1 1）石蜡切片：石蜡切片：需经需经0.15mol/L PBS0.15mol/L PBS配制的配制的20g/ml20g/ml蛋白酶蛋白酶 K K消化消化，时间要得当，消化时间过长，非特异性染色增，时间要得当，消化时间过长，非特异性染色增 加，细胞结构破坏；消化时间过短，细胞膜达不到应加，细胞结构破坏；消化时间过短，细胞膜达不到应 有的通透性，影响标记效果。一般以消化有的通透性，影响标记效果。一般以消化10-20min10-20min 为宜。为宜。（2 2）阳性对照：阳性对照：经过固定和通透处理的样品用经过固定和通透处理的样品用DNaseIDNaseI 处理使之产生处理使之产生DNADNA断端，其他同。断端，其他同。（3 3）阴性对照：阴性对照：阴性对照片在第（阴性对照片在第（7 7）步（即加）步（即加TUNELTUNEL反应混反应混 合液的步骤）加不含合液的步骤）加不含TdTTdT的标记反应液，余同。的标记反应液，余同。（4 4）TUNELTUNEL反应混合液反应混合液：需在：需在使用前立即制备使用前立即制备，不能储存不能储存 配好的此液体必须放在配好的此液体必须放在冰浴冰浴中。中。（5 5）PODPOD反应液：反应液：一旦融化，需一旦融化，需44保存，不能反复冻存。保存，不能反复冻存。TUNELTUNEL实验注意事项实验注意事项（6 6）区分假阳性：区分假阳性：若组织细胞坏死时亦可出现若组织细胞坏死时亦可出现DNADNA断裂断裂,TUNEL,TUNEL法检测亦可出现阳性反应法检测亦可出现阳性反应,故必须结合凋亡细胞故必须结合凋亡细胞的形态学特征与细胞坏死加以判断。的形态学特征与细胞坏死加以判断。结合形态学特征：结合形态学特征：细胞凋亡时，往往呈现单个或少数几个细胞细胞凋亡时，往往呈现单个或少数几个细胞孤立地分布在组织中；具有凋亡的核特征，即核孤立地分布在组织中；具有凋亡的核特征，即核凝缩，可见一个或多个染色质团块，即凋亡小体凝缩，可见一个或多个染色质团块，即凋亡小体核片段；周围或局部无炎症反应征象，核片段；周围或局部无炎症反应征象，这是细胞这是细胞凋亡区别于坏死的最主要特征。凋亡区别于坏死的最主要特征。TUNELTUNEL实验注意事项实验注意事项pI N S TI N S T：D N AD N A 聚 合 酶聚 合 酶 I I 或或 K l e n o wK l e n o w 大 片 段 介 导大 片 段 介 导 的 原 位 缺 口 平 移（的 原 位 缺 口 平 移（i n s i t ui n s i t u n i c k n i c k translation,translation,简称简称INSTINST）p基本原理基本原理:细胞凋亡时产生细胞凋亡时产生DNADNA断裂断裂,有一粘性末有一粘性末端端,一条含有游离的一条含有游离的3 3-羟基末端羟基末端,另一条含有伸出的另一条含有伸出的5 5-末端。利用末端。利用KlenowKlenow大片段的大片段的5 53 3聚合酶活性聚合酶活性,可可将外源性的游离核苷酸（带有生物素标记）从将外源性的游离核苷酸（带有生物素标记）从3 3-羟羟基末端起始经基末端起始经5 53 3方向连接在断端上方向连接在断端上,再通过带有再通过带有HRPHRP的卵白素与之结合的卵白素与之结合,经经DABDAB显色显色,即可观察到细胞即可观察到细胞是否存在有核苷酸掺入的是否存在有核苷酸掺入的DNADNA断端。断端。2.INST2.INST法法INSTINST法基本原理图法基本原理图 INSTINST法优缺点法优缺点p并不比形态学判断细胞凋亡更敏感。并不比形态学判断细胞凋亡更敏感。p主要优点：主要优点：（1 1）可检测早期凋亡，特异性敏感性高。）可检测早期凋亡，特异性敏感性高。（2 2）该法最大优点是便于检测，）该法最大优点是便于检测，可进行组织、可进行组织、细胞原位检测。细胞原位检测。特别在凋亡细胞较少，且散在特别在凋亡细胞较少，且散在分布于组织中，周围组织含有较多有核细胞，分布于组织中，周围组织含有较多有核细胞，以及肿瘤组织核分裂相细胞数较多时，以及肿瘤组织核分裂相细胞数较多时，ISNTISNT检检测法可将凋亡细胞核染成棕色，便于识别。测法可将凋亡细胞核染成棕色，便于识别。下课啦！下课啦！Thank you!