生物化学A（上）-6酶

蛋白质-酶2016年3月28日1血红蛋白(Hemoglobin)2u 血红蛋白具有四个亚基组成的四级结构，每个亚基中间有一个疏水局部，可携带一个血红素并携带一分子氧，因此1分子Hb共结合四分子氧。u Hb各亚基的三级结构与Mb极为相似。u Hb亚基之间通过八对盐键，使四个亚基紧密结合而形成亲水的球状蛋白。肌红蛋白(Mb)和血红蛋白(Hb)的氧解离曲线3 协同效应(cooperativity)v定义：一个寡聚体蛋白质的一个亚基与其配体结合后，能影响此寡聚体中另一个亚基与配体结合能力的现象，称为协同效应协同效应。v如果是促进作用则称为正协同效应正协同效应 (positive cooperativity)v如果是抑制作用则称为负协同效应负协同效应(negative cooperativity)4 未结合未结合O2时，时，Hb的的1/1和和2/2呈对角排列，结构较为紧密，呈对角排列，结构较为紧密，称为紧张态（称为紧张态（T态态），），T态态Hb与与O2的亲和力小。随着的亲和力小。随着O2的结合，的结合，4个亚基羧基末端之间的离子键断裂，其二级、三级、四级结构个亚基羧基末端之间的离子键断裂，其二级、三级、四级结构也发生变化，使也发生变化，使1/1和和2/2的长轴形成的长轴形成15度的夹角，结构显度的夹角，结构显得相对松弛，称为松弛态（得相对松弛，称为松弛态（R态态）Hb(T态态)HbO2(R态态)1122155v定义：变构效应亦称别构效应，是指一个蛋白质与它的配体结合后，蛋白质的构象发生变化,使它更适合于功能的需要，这一类变化称为别构效应。v 别构蛋白（allosteric protein）：是指具有别构效应的蛋白质或酶.如血红蛋白v 别构剂：亦称效应剂,是指凡能触发蛋白质分子发生别构效应的物质。如O2 变构效应（allosterism effect）6协同效应提高血红蛋白的供氧能力7Hill Coefficient（Hill 系数）vThere is cooperation between the multiple binding There is cooperation between the multiple binding sites.The degree of cooperation is quantified by sites.The degree of cooperation is quantified by this coefficient.this coefficient.vIt is a measure of that degree to which one bound It is a measure of that degree to which one bound site promotes the binding of further sites.site promotes the binding of further sites.vFor Hb the hill coefficient can have a value from 1 For Hb the hill coefficient can have a value from 1 to 4.For Hb,it is usually 3.to 4.For Hb,it is usually 3.vFor Myoglobin,the Hill Coefficient value is 1,For Myoglobin,the Hill Coefficient value is 1,indicating no cooperation.indicating no cooperation.8HbO2Hb+nO2=(pO2)n(pO2)n+P50lg1-=n lg pO2 lg P50The Hill equationThe hill coefficient n is a measure of the degree of cooperativity.9v当nH=1，配体结合没有协同性；v当nH1，配体结合正协同；v当nHpI，带负电荷；pH k2时，此时酶和底物的分离远比产生酶和产物的速度快得多；KM KES=k-1/k1=ES/ES即当k-1 k2时，KM 等于ES复合物的解离常数;在这个条件下：KM高，结合弱；KM低，结合强。KM是酶的特征性常数之一=Kmk1k2k-1+108米氏常数KM的意义（续）Km值越小,底物与酶的亲和力越强,反应越迅速109110定义：Vmax是酶完全被底物饱和时的反应速度，与酶浓度成正比。意义：Vmax=k2 E0v如果酶的总浓度已知，可从Vmax计算酶的转换数(turnover number)，即动力学常数k2。Vmax的意义111kcat 和 specificity constantkcat :当酶被底物充分饱和时，单位时间内每个酶分子催化底物转变为产物的分子数。也叫 turnover number转换数kcat/Km:专一性常数,用来比较不同酶作用于同一底物,或同一种作用于不同底物的催化效率;数值接近109为佳。112酶的转换数Turnover number(kcat)v意义：可用来比较每单位酶的催化能力The Kcat is a direct measure of the conversion of substrate to product under optimum conditions,i.e.saturated enzyme.The number of substrate molecules turned over per enzyme molecule per second,hence“turnover number”.The overall rate of a reaction is limited by its slowest step.Hence,the Kcat will be equal to the rate constant for the slowest step.In the case of the Michaelis-Menten system this will be k2 E+S ESE+Pk1k-1k2113114specificity constant:kcat/KMvThe ratio kcat/KM is a convenient measure of enzyme efficiencyvA good enzyme has a high kcat/KM ratiovThis could result from:Large kcatSmall KM115同一个酶对不同的底物可以有不同的米氏常数胰凝乳蛋白酶116同一个酶对不同的底物可以有不同的米氏常数胰凝乳蛋白酶117118v=Vmax S KM+S=KM 1 1 1 v S Vmax+Vmax.Taking the reciprocal of both sides can giveThis is in the general form y=m x+ci.e.a plot of 1/v against 1/S will give straight lineThis is a Lineweaver-Burk plot119Lineweaver-Burk plot(双倒数作图)1/v=Km/Vmax*1/S+1/Vmax 1/V1/S-1/KM1/VmaxKM/Vmaxslope=Lineweaver-Burk plot120Eadie-Hofstee plotHanes plot请从米氏方程推导121Cornish-Bowden plotDixon plot122123三聚物模式(ternary complex)乒乓式(ping-pong)两种不同模式的双底物反应124双底物反应的米氏方程当P1,P2=0 时太复杂了！Forget it!125二、酶浓度对反应速度的影响当SE，反应速度与酶浓度成正比。关系式为：V=K2 E0 V E 126v双重影响v最适温度(optimum temperature)：酶促反应速度最快时的环境温度v低温的应用三、温度对反应速度的影响酶酶活活性性0.51.02.01.50 10 20 30 40 50 60 温度温度 C 127四、pH对反应速度的影响 最适pH(optimum pH)：酶催化活性最大时的环境pH0酶酶活活性性 pH胃蛋白酶胃蛋白酶 淀粉酶淀粉酶 胆碱酯酶胆碱酯酶 246810128五、抑制剂对反应速度的影响酶的抑制剂(inhibitor)凡能使酶的催化活性下降而不引起酶蛋白变性的物质统称为酶的抑制剂。区别于酶的变性抑制剂对酶有一定选择性，而变性的因素对酶没有选择性129抑制作用的类型不可逆性抑制(irreversible inhibition)可逆性抑制(reversible inhibition)：v竞争性抑制(competitive inhibition)v非竞争性抑制(non-competitive inhibition)v反竞争性抑制(uncompetitive inhibition)130不可逆性抑制作用*概念抑制剂通常以共价键与酶活性中心的必需基团相结合，使酶失活，不能用透析、超滤等方法予以除去。*举例有机磷化合物 羟基酶解毒-解磷定(PAM)重金属离子及砷化合物 巯基酶解毒-二巯基丙醇(BAL)131有机磷化合物对羟基酶的抑制+E-OHROPOXROROPOO-ERO+HXE-OHORPOORNCH3CHNOH+NCH3CHNO+有机磷化合物磷酰化酶羟基酶酸解磷定132重金属离子及砷化合物毒性路易士气失活的酶巯基酶失活的酶酸BAL二巯基丙醇巯基酶 BAL与砷剂结合物AsHC CHClESS+H2C SHHCH2C OHSHESHSH+H2C SHCH2C OHSAsHC CHClESHSHClAsCl+HCCHClAsHCCHClESS+2HCl133可逆性抑制作用n概念：抑制剂以非共价键与酶或酶-底物复合物可逆性结合，使酶的活性降低或丧失；抑制剂可用透析、超滤等方法除去。n竞争性抑制n非竞争性抑制n反竞争性抑制 1341.竞争性抑制作用 抑制剂与底物的结构相似，能与底物竞争酶的活性中心，从而阻碍酶底物复合物的形成，使酶的活性降低。135竞争性抑制136vI与S结构类似，竞争酶的活性中心；v抑制程度取决于抑制剂与酶的相对亲和力及S；v动力学特点：Vmax不变，表观Km。竞争性抑制的特点抑制剂抑制剂 无抑制剂无抑制剂 1/v 1/S VSmaxVIK(1)SmKiiKI111m(1)VVKSVmaxmax137琥珀酸琥珀酸脱氢酶FADFADH2延胡索酸CH2CCOOH琥珀酸COOHCH2COOH丙二酸COOHH2举例1：丙二酸对琥珀酸脱氢酶的抑制138举例2：磺胺药对细菌二氢叶酸合成酶的抑制Glu +H2NCOOH +FH2FH4H2NSO2NHRP A B AFH2合成酶二氢蝶呤氨甲蝶呤磺胺药FH2还原酶1392.非竞争性抑制抑制剂与酶活性中心外的必需基团结合，底物与抑制剂之间无竞争关系。140非竞争性抑制141非竞争性抑制的特点v抑制剂与酶活性中心外的必需基团结合；v抑制程度取决于I；v动力学特点：Vmax，表观Km不变。抑制剂抑制剂 1/v 1/S 无抑制剂无抑制剂 iiKI11I1m(1)(1)VVKSVKmaxmax1423.反竞争性抑制抑制剂仅与酶和底物形成的中间产物结合，使ES的量下降。143反竞争性抑制144v抑制剂只与ES结合；v抑制程度取决与I及S；v动力学特点：Vmax，表观Km。反竞争性抑制的特点抑制剂抑制剂 1/V 1/S 无抑制剂无抑制剂 145各种可逆性抑制作用的比较 作用特征竞争性抑制非竞争性抑制反竞争性抑制与I结合的组分EE、ESES表观Km增大不变减小Vmax不变降低降低146不同类型抑制作用的米氏方程147I竞争性抑制反竞争性抑制非竞争性抑制148六、激活剂对反应速度的影响激活剂(activator)使酶由无活性变为有活性或使酶活性增加的物质 必需激活剂(essential activator)非必需激活剂(non-essential activator)149七、酶活性测定和酶活性单位酶的活性单位：在规定条件下，酶促反应在单位时间（s、min或h）内生成一定量（mg、g、mol等）的产物或消耗一定数量的底物所需的酶量。150酶活性单位v国际单位(IU)在特定的条件下，每分钟催化1 mol底物转化为产物所需的酶量为一个国际单位v催量单位(katal)催量(kat)是指在特定条件下，每秒钟使mol底物转化为产物所需的酶量kat与IU的换算：1 IU=16.6710-9 kat151152细胞内酶活性的调控 1v根据外界环境的变化，细胞可以增强或减弱酶的生产（即酶相关基因的转录和翻译）。这属于一种基因调控，被称为酶的诱导和抑制。例如，当环境中出现如青霉素这样的抗生素时，部分细菌可以对抗生素产生抗性，其原因就在于细菌体内的-半乳糖苷酶被诱导而大量生产，这种酶可以水解青霉素分子上关键的-乳胺环。另一个例子是在人体肝脏中存在一类酶对于药物代谢非常重要的酶，细胞色素P450氧化酶；对这一类酶的诱导或抑制，会导致药物相互作用。153细胞内酶活性的调控 2v通过在不同的细胞组分中进行不同的代谢途径，酶可以被分隔。例如，脂肪酸的合成是由细胞溶质、内质网和高尔基体中的一系列酶所完成，而脂肪酸的降解（以提供能量）是在线粒体中由另一系列酶通过-氧化来完成。154细胞内酶活性的调控 3v酶可以被抑制剂与激活剂所调控。例如，一个代谢途径中的终产物常常是这一途径中第一个酶的抑制剂，从而调控这一代谢途径的产物量。这种调控机制被称为负反馈机制，因为终产物的合成量是受其自身浓度调控。负反馈机制可以根据细胞的需要，有效地调节中间代谢物的合成速率，从而使细胞的能量和物质的分配更为高效，并防止多余产物的合成。控制酶的作用，可以在生物体内维持一个稳定的内部环境（即体内平衡）。155细胞内酶活性的调控 4v翻译后修饰也可以调控酶的活性。如磷酸化、肉豆蔻酸化和糖基化。例如，细胞接受胰岛素信号后，对包括糖原合成酶在内的多个酶进行磷酸化，帮助控制糖原的合成或降解，使得细胞可以对血糖的变化产生反应。另一个翻译后修饰的例子是多肽链的剪切。胰凝乳蛋白酶，胰脏中产生无活性的胰凝乳蛋白酶原，到达胃后被激活。156细胞内酶活性的调控 5v还有一些酶可通过定位到不同环境后而被激活，如从还原态的环境（细胞质）到氧化态环境（细胞周质空间），从高pH环境到低pH环境等。流感病毒的红血球凝集素蛋白就是一个例子：当它接触到宿主细胞囊泡的酸性环境时，它的构象立刻发生变化，导致其获得激活。157v调节对象 关键酶v调节方式酶活性的调节（快速调节）酶含量的调节（缓慢调节）酶 的 调 节158关键酶一般位于代谢途径的起始或分支处；催化单向不可逆反应；活性较低，活性最低者又称为限速酶；是可调节酶。159v调节对象 关键酶v调节方式酶活性的调节（快速调节）酶含量的调节（缓慢调节）酶 的 调 节160一、酶活性的调节Allosteric enzymes)161（一）酶原与酶原的激活酶原(zymogen)有些酶在细胞内合成或初分泌时只是酶的无活性前体，此前体物质称为酶原。酶原的激活在一定条件下，酶原向有活性酶转化的过程162酶 原分子构象发生改变形成或暴露出酶的活性中心 一个或几个特定的肽键断裂，水解掉一个或几个短肽在特定条件下酶原激活的机理163164v避免细胞产生的酶对细胞进行自身消化，并使酶在特定的部位和环境中发挥作用，保证体内代谢正常进行。v有的酶原可以视为酶的储存形式。在需要时，酶原适时地转变成有活性的酶，发挥其催化作用。酶原激活的生理意义165变构调节(allosteric regulation)一些代谢物可与某些酶分子活性中心以外的部位可逆地结合，使酶构象改变，从而改变酶的催化活性，此种调节方式称变构调节。v变构酶(allosteric enzyme)v变构部位(allosteric site)v变构效应剂(allosteric effector)变构激活剂变构抑制剂（二）变构酶166变构酶的特点 通常具有四级结构，存在协同效应；含有催化亚基和调节亚基(或催化部位和调节部位)。S-v关系曲线为S形。167变构酶的S形曲线168变构激活变构激活变构抑制变构抑制 S S V V 无变构效应剂无变构效应剂 协同效应169Sequential&concerted models170变构效应剂(allosteric effector)v变构抑制剂(Allosteric inhibitor)v变构激活剂(Allosteric activator)171（三）酶的共价修饰调节共价修饰(covalent modification)在其他酶的催化下，酶蛋白肽链上的一些基团可与某种化学基团发生可逆的共价结合，从而改变酶的活性，此过程称为共价修饰。v常见类型磷酸化与脱磷酸化（最常见）乙酰化和脱乙酰化甲基化和脱甲基化腺苷化和脱腺苷化SH与SS互变172酶蛋白酶蛋白SerThrTyrOH酶蛋白酶蛋白SerThrTyrOPATPADPPiH2O蛋白激酶蛋白激酶蛋白磷酸酶蛋白磷酸酶酶的磷酸化与脱磷酸化173共价修饰调节的特点1.受共价修饰的酶存在有（高）活性和无（低）活性两种形式；2.具有瀑布效应（级联效应）；3.是体内经济、有效的快速调节方式。174瀑布效应175二、酶含量的调节（一）酶蛋白合成的诱导和阻遏诱导作用(induction)阻遏作用(repression)（二）酶降解的调控176三、同工酶 同工酶(isoenzyme)是指催化相同的化学反应，但酶蛋白的分子结构、理化性质乃至免疫学性质不同的一组酶。177乳酸脱氢酶(LDH1 LDH5)1781 1酶酶活活性性心肌梗死酶谱心肌梗死酶谱正常酶谱正常酶谱肝病酶谱肝病酶谱2 23 34 45 5心肌梗死和肝病病人血清LDH同工酶谱的变化179酶 与 疾 病180Cardiovascular diseases 心血管疾病Hemophilia A/B 血友病Alzheimer disease 老年痴呆Cancer metastasis 癌细胞转移Arthritis 关节炎Parasite disease:malaria/T cruzain 疟疾Influenza A&AIDS 甲型流感与爱滋病181酶 的 应 用日常生活中的应用182应用所用酶用途烹饪业 真菌（一般为酵母）-淀粉酶（在烘烤过程中可以被破坏）催化面粉中的淀粉分解为蔗糖。在这一过程中，酵母会产生一氧化碳。可用于馒头、面包以及其他一些中西式糕点的制作。蛋白酶制作饼干的过程中，通常用它来降低面粉中蛋白质的含量。木瓜蛋白酶将肉嫩化，以利于烹饪。婴儿食品胰蛋白酶经过酶处理的婴儿食品更易消化。183应用所用酶用途酿酒业麦芽中的酶将淀粉和蛋白质降解为糖、氨基酸和肽段，而这些原料可以被酵母发酵产生酒精。工业生产的麦酶广泛用于替代天然酶进行啤酒酿造淀粉酶、葡聚糖酶和蛋白酶分解麦芽中的多聚糖链和蛋白质。-葡聚糖酶和阿拉伯木聚糖酶提高麦汁和啤酒的滤过性。淀粉葡糖苷酶和普鲁兰酶制造低卡路里啤酒和调整发酵能力。蛋白酶除去在啤酒储存过程中产生的絮状物。乙酰乳酸脱羧酶（ALDC）避免丁二酮的产生。果汁制造业纤维素酶、果胶酶降解果汁中的不溶物。184应用所用酶用途乳品业凝乳酶，提自反刍动物（牛、羊）幼崽的胃。制造乳酪，水解蛋白质。用微生物生产的凝乳酶越来越多地使用于乳品制造业。脂酶洛克福羊乳酪的制作过程中添加，以加快乳酪的成熟。乳糖酶将乳糖分解为葡萄糖和半乳糖。185应用所用酶用途造纸业 淀粉酶、木聚糖酶、纤维素酶和木质酶淀粉酶用于降解淀粉至低粘性，加胶和给纸加膜；木聚糖酶能够降低脱色过程所需的漂白剂；纤维素酶使纤维光滑并增强纸的排水性；木质酶可以消除木质素以软化纸质。生物燃料生产 纤维素酶 降解纤维素，产生可用于发酵的蔗糖。木质酶用于木质废品的降解。186应用所用酶用途生物去垢剂主要为蛋白酶（产自细菌的膜外部分）用于洗衣过程中的浸泡阶段，帮助除去衣物上含有蛋白质的污渍。淀粉酶除去洗衣机上的淀粉残余。脂酶帮助除去衣物上的油渍。纤维素酶作为生物纤维（如棉质衣物）的柔顺剂。隐形眼镜清洁剂蛋白酶清除隐形眼镜上的蛋白质，以防止细菌滋生。橡胶制造业过氧化氢酶催化过氧化物产生氧气，以将胶乳转化为泡沫橡皮。摄影业蛋白酶（无花果蛋白酶）溶解底片上的明胶，使得银成分显现。1871881、免疫体系中分子间的识别机制2、DNA与蛋白质的相互作用3、蛋白水解酶与疾病4、膜蛋白、受体与信号转导5、酶抑制剂与药物开发 6、新技术与新方法 1891.免疫体系分子的相互识别190受体-配体结合的特异性191Antibody 抗体的结构192B cell 产生抗体193Helper T cell是免疫体系的关键细胞 HIV感染的主要细胞194After many cell generations,the Th cells progenitors differentiate into 1.effector Th cells 2.memory Th cells3.regulatory Th cellsHelper T cell是免疫体系的关键细胞195Killer T Cell是保卫我们的主要战士之一196APC抗原呈递细胞激活T细胞197抗原呈递细胞上的MHC分子是特异性识别的关键198主要组织相容性复合体(Major Histocompatibility Complex，MHC)u早期从组织器官移植实验中发现，也是当今免疫遗传学的主要内容。u已发现，在人群或同种动物不同个体间进行皮肤移植时出现的排斥反应，具有记忆性、特异性和可转移性等免疫反应的基本特征，故从廿世纪40年代起就确认移植排斥反应是一种典型的免疫现象。u引起排斥反应的抗原称移植抗原(transplantation antigen)或组织相容性抗原(histocompatibility antigen)。此等抗原存在于细胞表面，无器官特异性，不同个体间其抗原特异性互不相同，但同卵双生及纯系动物不同个体之间，其抗原特异性完全一致。199链由胞外区、跨膜区和胞内区组成。胞外区可进一步分为1、2和3 三个功能区。跨膜区含疏水性氨基酸，排列成螺旋跨越脂质双分子层。胞内的氨基酸被磷酰化后有利于细胞外信息向胞内传递。2m无同种特异性，与3功能区连接，其功能为有助于类抗原的表达和稳定性。200MHC IMHC I分子的结构容纳抗原的口袋201MHC I类抗原分子顶部1和2区组成的抗原肽结合区呈沟槽状结构，1和2区各含4股片层和1个螺旋，呈对称排列而连接成一个沟槽，片层组成槽底，其两侧由螺旋组成。沟槽大小为2.5nm1.0nm1.1nm，可容纳8-12个氨基酸残基组成的短肽。沟槽内氨基酸变化大，是类抗原多态性的基础。虽然抗原肽与类分子的结合有一定的选择性，但并不像抗原与抗体那样高度特异地结合，只要被结合的多肽有2-3个关键的氨基酸能恰当地连接到沟槽内的多肽结合基序(binding motif)的相应位置上，多肽即可与之结合，并被运送到细胞表面递呈给T细胞。所以每个类抗原分子能与一定广度的多肽谱结合。202MHC II MHC II，1和1区各自盘绕成一个螺旋和片层构成沟槽的一个侧壁和半个底面。由于它的末端是开放的，故可容纳较长的多肽(约12-20个氨基酸)。该沟槽与多肽结合的特点基本上与类抗原相似，但被结合的多肽一般来自外源性抗原经加工处理降解的产物。203类抗原是由类基因编码的链(34kD)和链(29kD)非共价连接的糖蛋白。链和链在内质网分别合成后，很快与第3条链链(或称Ii链)结合成复合体，当复合体到达溶酶体样结构，链解离、降解。链的存在，使、链不能与其他胞内蛋白结合，并协助复合体转运以及与抗原的结合。链和链，均由胞外区、跨膜区和胞内区组成。胞外区各含两个功能区1、2和、2 204MHC IITCR识别抗原2052062.蛋白质与DNA的相互作用Helix-Turn-HelixZinc-fingerLeucine zipper非特异性:特异性:Histones207DNA-蛋白质相互作用的化学键u氢键:具有识别功能蛋白质的螺旋结构常与DNA的大沟相互作用。u疏水键：暴露于大沟侧缘的T-CH3基团是疏水性的，可与疏水氨基酸残基侧链相互作用。u离子键：蛋白质的带电的氨基酸残基的侧链与DNA分子上的带电基团形成离子键。208组蛋白（Histone)组蛋白带正电荷，含Arg、Lys，含量恒定，真核细胞中组蛋白共有5种，分为两类：一类是高度保守的核心组蛋白（core histone）包括H2A、H2B、H3、H4四种；另一类是可变的连接组蛋白（linker histone）即H1。核心组蛋白的结构是非常保守，特别是H4，牛和豌豆H4的102个氨基酸中仅有2个不同。核心组蛋白高度保守的原因可能有两个：其一是核心组蛋白中绝大多数氨基酸都与DNA或其它组蛋白相互作用，可置换而不引起致命变异的氨基酸残基很少；其二是在所有的生物中与组蛋白相互作用的DNA磷酸二酯骨架都是一样的。209四种核心组蛋白通过C端疏水的氨基酸相互结合，N端带正电荷的氨基酸向外伸出，与DNA分子结合，使DNA分子缠绕在组蛋白核心周围，形成核小体。尾部含有大量Lys和Arg残基，为组蛋白翻译后进行修饰的部位，如乙酰化、甲基化、磷酸化等。H1不仅具有种属特异性，而且还有组织特异性，所以H1是多样性的。210Histones组蛋白构成核小体211212213核小体的结构要点u每个核小体单位包括约200 bp的DNA、一个组蛋白核心和一个H1。u由H2A、H2B、H3、H4各两分子形成八聚体，构成盘状核心颗粒；H3、H4形成4聚体，位于颗粒中央；H2A、H2B二聚体分别位于两侧。uDNA分子以左手螺旋缠绕在核心颗粒表面，每圈80 bp，共1.75圈，约146 bp，两端被H1锁合，H1 结合20bp DNA.u相邻核心颗粒之间为一段60 bp的连接线DNA(linker DNA)，典型长度60 bp。u组蛋白与DNA是非特异性结合，核小体具有自主装性质。214核小体上DNA与组蛋白的接触点215非组蛋白染色体上与特异DNA序列结合的蛋白质，又称序列特异性DNA结合蛋白（凝胶迟滞电泳实验）。包括多种参与核酸代谢与修饰的酶类、核质蛋白、骨架蛋白、基因表达和染色体结构调节蛋白等。u含有较多的Asp和Glu，酸性蛋白质；u整个细胞周期都进行合成，不象组蛋白只在S期合成，并与DNA复制同步进行；u能识别特异的DNA序列，识别信息存在于DNA本身，位点在大沟部分，识别与结合靠氢键和离子键；u具有多样性和异质性；u具有多种功能，如帮助DNA分子折叠，以形成不同的结构域，从而有利于DNA的复制和基因的转录，协助启动DNA复制，控制基因转录，调节基因表达。216vHTH:螺旋-转角-螺旋模式vHLH:螺旋-环-螺旋模式vZinc Finger:锌指模式 vLeucine Zipper:亮氨酸拉链式模式 序列特异性DNA结合蛋白的不同结构模式217HTH Motif 蛋白质形成对称的同型二聚体，每个单位由20个氨基酸的小肽组成，两个 螺旋相互连接成转角。羧基端的 螺旋负责识别DNA大沟的特异碱基信息，另一个螺旋与磷酸戊糖链骨架接触。最初发现于噬菌体的阻遏蛋白中，现发现在很多原核及真核DNA结合蛋白中存在。由两个较短的螺旋与其间含Gly残基的绞链组成。如大肠杆菌的CAP蛋白含一HTH结构域，HTH通过DNA双螺旋大沟识别、结合反向重复序列TGTG/CACA。218HTH的分子识别机制219-repressor的结构220HLH(Helix-loop-helix)a protein structural motif that characterizes a family of transcription factors;bHLH proteins typically bind to a consensus sequence called an E-box,CANNTG.221指状结构约含23个氨基酸残基，锌以4个配价键与4个Cys或2个Cys和2个His相结合。整个蛋白质分子可有2-9个这样的锌指重复单位。每一个单位可以其指部伸入DNA双螺旋的深沟，接触一定数量和序列的核苷酸。Zinc finger蛋白结构特征222碱性亮氨酸拉链(bZIP)u可形成蛋白质蛋白质二聚体的亮氨酸拉链(leucine zipper，LP)；u具有35个氨基酸残基，其中有4个亮氨酸，每7个氨基酸出现一次，形成-螺旋时，每两圈伸出一个亮氨酸，由亮氨酸残基间的疏水作用力形成一条拉链，产生蛋白质二聚体；u碱性-螺旋与DNA磷酸残基和碱基互作，二聚体剪刀结构。223u蛋白质分子的肽链上每隔6个氨基酸就有1个亮氨酸残基，结果就导致这些亮氨酸残基都在螺旋的同一个方向出现。u两个相同结构的两排亮氨酸残基就能以疏水键结合成二聚体，该二聚体的另一端的肽段富含碱性氨基酸残基，借其正电荷与DNA双螺旋链上带负电荷的磷酸基团结合。若不形成二聚体则对DNA的亲和结合力明显降低。u这类蛋白质能够与CAAT框和病毒增强子结合，其特征就聚体形成域是能形成bZIP二聚体结构。Leucine-zipper的结构特征224an alpha helix with a leucine at every 7th amino acid Leucine-zipper的蛋白的剪刀型结合模式225足迹法技术用于测定与特殊蛋白质结合在DNA上的结合位点和相应的核苷酸顺序。如该技术提供了RNA聚合酶与启动子之间相互作用的信息并确定了作用位点（启动子）的核苷酸顺序。足迹法：Foot Printing226研究蛋白在DNA上的结合位点足迹法：DNA Footprinting227足迹法原理228利用足迹法确定RNA聚合酶结合位点的实验2293.蛋白水解酶与人体疾病Cardiovascular diseases 心血管疾病Hemophilia A/B 血友病Programmed cell death/appotosis 细胞凋亡Alzheimer disease 老年痴呆Cancer metastasis 癌细胞转移Arthritis 关节炎Parasite disease:malaria/T cruzain 疟疾Influenza A&AIDS 甲型流感与艾滋病230细胞内蛋白质有确定的寿命Proteosome是蛋白质降解的专业机构231蛋白质降解的泛素蛋白酶体途径 u泛素(ubiquitin，Ub)是76个氨基残基组成的小分子多肽，可以以共价结合的方式与蛋白质的赖氨酸相连。u蛋白质一旦接有泛素，称为发生泛素化(uhiquitylation)。u泛素化在ATP的参与下被三种酶依序催化，形成蛋白质与一条泛素聚合链相结合的复合结构，进入蛋白酶体，然后降解为肽段。此为生物大分子在胞质中降解的泛素蛋白酶体途径(ubiquitin-proteosome pathway)。u泛素化是一个具有普遍意义的免疫生物学现象（2004年Nobel化学奖）232蛋白质降解的泛素蛋白酶体途径 蛋白质泛素化系统由3个组分构成.一个称为泛素激活酶E1，它可利用水解ATP释放的能量以其 Cys的巯基与泛素C端的Gly形成高能硫酯键。然后连接在其上的泛素被转移到另一个泛素结合酶E2上，同时，被选中的靶蛋白与第三个组分即靶蛋白泛素连接酶E3结合。E2然后将与其连接的泛素转移到靶蛋白上，并与靶蛋白 Lys -NH2基团形成异肽键(isopeptide bond)，E2被释放。选择什么样的蛋白质进行泛素化主要取决于E2和E3。233234血栓形成与消除235血栓形成（Thrombosis）活体心脏、血管内血液的某些成分析出，凝集形成固体质块的过程称血栓形成，形成的固体质块叫血栓。内膜损伤后血小板粘集，形成血小板小堆；以后内源性凝血系统、外源性凝血系统激活，形成纤维蛋白，血小板与纤维蛋白等形成血小板血栓，阻碍血流，血流下游形成漩涡，形成新的血小板血栓，如此往复形成不规则梁索状或珊瑚状突起，称为血小板小梁，在小梁间则由网有大量红细胞的纤维蛋白网填充。后血栓逐渐增大，阻塞血管，血流停止，血液发生凝固，形成更大血栓。236Thrombin 凝血酶237Plasmin血纤蛋白溶酶238甲型流感病毒与艾滋病毒239Influenza Virusv流行性感冒病毒简称流感病毒，是引起流感的病原体。v流感是一种上呼吸道急性传染病，它传染性强、传播快、潜伏期短、发病率高。已引起数次世界性大流行，仅19181919年的世界大流行，死亡人数就达2000万，对人类的生命健康危害极大。240流感病毒分类v流感病毒（Influenza virus）属正粘液病毒科，流感病毒属，包括甲、乙、丙三型，甲型抗原变异性最强，感染人类和其他动物，引起中、重度疾病，侵袭所有年龄组人群，常引起世界性大流行。乙型变异性较弱，仅感染人类，一般引起轻微的疾病，主要侵袭儿童，可引起局部爆发。丙型抗原性比较稳定，仅引起婴幼儿感染和成人散发病例。v甲型流感病毒根据H和N抗原不同，又分为许多亚型，H可分为15个亚型（H1H15），N有9个亚型（N1N9）。其中仅H1N1、H2N2、H3N2主要感染人类，其它许多亚型的自然宿主是多种禽类和动物。其中对禽类危害最大的为H5、H7和H9亚型毒株。241Life Cycle of Influenza A virus242A型流感病毒的HA(血凝素)的结构域受蛋白水解酶活化后才有感染细胞的能力243艾滋病（AIDS)v艾滋病的医学全称是“获得性免疫缺陷综合征(Acquired Immunodeficiency Syndrome，缩写AIDS)”，其病原为“人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，缩写HIV)”。vHIV专门攻击人体的T淋巴细胞，致使人体免疫功能缺陷，进而导致人体丧失了对各种病原体的抵抗能力而发生多种机会性感染、恶性肿瘤和多系统损害的综合征，最终导致死亡。244HIV外界环境中的生存能力较弱，对物理因素和化学因素的抵抗能力较低。对热很敏感，体外56处理 30min 可使其失去感染性，但 不能完全灭活血清中的HIV，100处理20 min可将其完全灭活。除此之外，75%的酒精也可灭活，但紫外线不能灭活。变异强：艾滋病毒的变异性很强，给研制预防性疫苗和治疗性药物带来了极大困难。易感性：人群普遍易感，无国界、无季节性。HIV感染与人类的行为密切相关，如：多性伴、吸毒等。245AIDS病毒生活史Protease cuts up the protein 246癌细胞的转移需要蛋白水解酶的帮助2474.膜蛋白、受体与信号转导248膜蛋白249生物膜与膜蛋白250穿膜蛋白的类型251蛋白质转运的信号肽Gnter Blobel 因此获得1999 年诺贝尔生理和医学奖252螺旋作为穿膜部分253 折叠作为穿膜部分254极性和非极性氨基酸255穿膜蛋白介导细胞间联系256受体、信号传导257肾上腺素作用 瀑布效应258信号传导的特点259信号传导的类型260261