高频率离体培养诱导四倍体蝴蝶再生体系的研究课件

高频率离体培养诱导四倍体蝴蝶再生体系的研究课件高频率离体培养诱导四倍体蝴蝶再生体系的研究 答辩人：李 文石峰田 高频率离体培养诱导四倍体蝴蝶再生体系的研究课件实验方案v通过改变培养基中激素的 浓度、配比和糖浓度等对 蝴蝶兰顶芽、花梗节间等外植体进行组织培养快速繁殖试管苗，培育出愈伤组织诱导频率高、再生频率高的植株体系。v蝴蝶兰组织培养成功后，我们将用秋水仙素对其进行处理，培育多倍体蝴蝶兰。高频率离体培养诱导四倍体蝴蝶再生体系的研究课件技术路线技术路线 母株选择初代诱导丛芽分化继代增殖壮苗生根锻炼幼苗出瓶移栽 高频率离体培养诱导四倍体蝴蝶再生体系的研究课件实验方案表格如下图所示：MS（加Vc,椰汁）NAA(mg/l)6-BA(mg/l)(1)(2)(1)(2)花梗节间 44花粉块 1155幼叶 112020茎尖 1155根尖 1010高频率离体培养诱导四倍体蝴蝶再生体系的研究课件 V W（加Vc,椰汁）NAA(mg/l)6-BA(mg/l)(1)(2)(1)(2)花梗节间 44花粉块 1155幼叶 112020茎尖 1155根尖 1010高频率离体培养诱导四倍体蝴蝶再生体系的研究课件项目研究进展情况项目研究进展情况(08-3-12-08-4-4)总进度：总进度：正在进行愈伤组织的诱导，观察，分离和筛选阶段。分进度：分进度：v第一阶段：第一阶段：召开开题报告会，小组讨论会议，确定实验如何开展。高频率离体培养诱导四倍体蝴蝶再生体系的研究课件第二阶段：第二阶段：相关文献、资料的搜集，培养基的选择 实验材料的挑选。高频率离体培养诱导四倍体蝴蝶再生体系的研究课件v 第三阶段：第三阶段：母液、培养基的配制、灭菌、倒板，材料的预处理（4,24h）、购买。无毒处理、接种。高频率离体培养诱导四倍体蝴蝶再生体系的研究课件v第四阶段：第四阶段：接种外植体后进行培养（25，黑暗培养），观察，记录褐变、污染情况，并设计相应的解决方案。v 第五阶段：第五阶段：吸取经验，重复实验，进行新方法的测试与应用。高频率离体培养诱导四倍体蝴蝶再生体系的研究课件进展结果进展结果v茎尖和根尖很容易长霉，而花粉块和花梗节间很少被污染。褐化的外植体也基本是茎尖和根尖，因为这些外植体细胞分裂比较活跃，多酚氧化酶的活性也相对要高些，因此容易褐化。高频率离体培养诱导四倍体蝴蝶再生体系的研究课件v部分外植体褐变、霉变，其余外植体形态、颜色与接种前相比无明显变化高频率离体培养诱导四倍体蝴蝶再生体系的研究课件目前存在的问题目前存在的问题v问题一：霉变问题一：霉变消毒不彻底。超净工作台操作不严格。无菌操作意识不足。封装保存不完善。v问题二：褐变问题二：褐变外植体切割后，内部细胞与外界空气直接接触，组织中多酚氧化酶被激活，多酚类化合物和单宁被氧化后产生醌类物质的缘故。切割面过大，外植体被损伤。接种方向不对，应使切割面接触培养基。外植体过于老化。初代培养中培养基中无机盐和植物生长调节物质浓度过高。高频率离体培养诱导四倍体蝴蝶再生体系的研究课件v问题三：材料来源问题三：材料来源长沙无蝴蝶兰培养基地，市场上销售的蝴蝶兰为观赏用花，不能作为理想的实验材料，因此接种后脱分化、再分化的效果不好。高频率离体培养诱导四倍体蝴蝶再生体系的研究课件解决方案解决方案 v增强无菌操作的意识v活性炭能有效控制褐化和促进生长,但不利于分化;谷胱甘肽控制褐化的效果虽不及活性炭,但综合效果最佳。因此可在培养基中加入这些抗氧化物质，以防止外植体的褐化。高频率离体培养诱导四倍体蝴蝶再生体系的研究课件v选择幼嫩的实验材料，有利于外植体脱分化及愈伤组织的诱导。v总结上次实验经验，确定合适的无机盐、琼脂和植物生长调节物质的浓度。高频率离体培养诱导四倍体蝴蝶再生体系的研究课件下阶段计划及主要措施下阶段计划及主要措施 v计划：计划：总结经验后，决定用花梗节间和花粉块两种外植体继续培养、诱导愈伤组织，并控制培养条件，如加入活性碳等，以防止褐化。利用蝴蝶兰种子培育出蝴蝶兰试管苗，此试管苗幼嫩，可作为理想的实验材料进行组织培养。高频率离体培养诱导四倍体蝴蝶再生体系的研究课件 措施：措施：v第一步：第一步：搜集蝴蝶兰种子培养基的相关文献资料，了解其萌发条件，萌发周期，萌发所需培养基。v第二步：第二步：利用种子培养基对种子接种，并添加一些生长调节物，如香蕉汁等，探索缩短种子萌发的因素。v第三步：第三步：待种子萌发后，按规范的组织培养操作方法，进行外植体的接种。高频率离体培养诱导四倍体蝴蝶再生体系的研究课件v 第四步：第四步：所用外植体为34片叶试管苗的顶部两片叶。将叶片切成约1 cm见方接种于不同的培养基上,每次处理10瓶,每瓶接种4块,叶片正面向上。培养室温度(25 1),光照强度约1 500 lx(光源为40W日光灯),光照时间12 h/d。v 第五步：第五步：待叶片表面出现芽点状突起时,制作常规石蜡切片,切片厚度8m,番红、固绿染色,光学显微镜下拍照。接种后50 d统计胚状体或愈伤组织发生情况。形成率=形成胚状体块数/接种外植体总块数。高频率离体培养诱导四倍体蝴蝶再生体系的研究课件预期成果预期成果 v一一通过向培养基中加入活性碳等抗氧化剂，防止外植体褐化。选择激素的最适浓度配比，添加适宜的生长调节物，如椰汁等，培养出愈伤组织诱导频率高，再生频率高的植株体系，达到加快繁殖速度的效果，使蝴蝶兰繁殖成本降低，以提高经济效益。v二二由蝴蝶兰种子萌发的蝴蝶兰试管苗，取其幼叶为外植体（该外植体幼嫩，是理想的实验材料），进行组织培养，以期获得再生频率高的植株体系。高频率离体培养诱导四倍体蝴蝶再生体系的研究课件v三三将无菌操作贯穿在整个实验过程中,尽量防止外植体的霉变、褐变、染菌,提高实验的成功率。v四四用秋水仙素处理再生的植株体系,以期得到目前未报道，具更高观赏价值的多倍体蝴蝶兰。高频率离体培养诱导四倍体蝴蝶再生体系的研究课件第二阶段进展报告(08-5-12)v用三个品种的蝴蝶兰种子培养,得到三种蝴蝶兰无菌试管苗.v(1)其幼叶因为幼嫩,可作为下一阶段的外植体,进行愈伤组织的诱导,并继续探索提高蝴蝶兰离体培养成功率的条件.v(2)可直接用秋水仙素处理无菌试管苗,得到多倍体蝴蝶兰,探索其观赏价值,遗传学特征等.高频率离体培养诱导四倍体蝴蝶再生体系的研究课件蝴蝶兰种子培养出的试管苗高频率离体培养诱导四倍体蝴蝶再生体系的研究课件第二阶段小结v完成情况:2,3号种子有根萌发,接着萌发出嫩黄色的幼叶.而且叶的颜色渐渐转变成绿色.根毛特别发达,可能和其吸收水分和养料有关.v存在问题:1号种子目前仍无萌发现象.1号种子最大,可能是因为接种前1号种子的浸泡时间不够,所以其萌发也较缓慢.高频率离体培养诱导四倍体蝴蝶再生体系的研究课件第二阶段小结v存在问题:第一批的种子用温水浸泡1h.第二批的种子用冷水浸泡3h.结果:第一批种子的萌发速度明显大于第二批种子的萌发速率.可见温度对种子的萌发特别重要.解决方案:延长1号种子的浸泡时间,提高一号种子的萌发率.高频率离体培养诱导四倍体蝴蝶再生体系的研究课件谢谢!