羟基磷灰石表面修饰人工角膜钛支架的生物相容性

www.CRTER.org马骁，等. 羟基磷灰石表面修饰人工角膜钛支架的生物相容性羟基磷灰石表面修饰人工角膜钛支架的生物相容性*马 骁1，石 红1，黄一飞2，黄靖香2，崔福斋3 (1北京世纪坛医院眼科，北京市 100038；2解放军总医院眼科，北京市 100853；3清华大学材料科学工程系，北京市 100084)文章亮点：实验的创新在于将羟基磷灰石表面修饰后的人工角膜钛支架植入碱烧伤兔角膜内，通过体内实验证实羟基磷灰石表面修饰法促进了支架材料与宿主角膜的生物整合，提高了钛支架的生物相容性。关键词：生物材料；材料生物相容性；人工角膜；羟基磷灰石；钛；表面修饰；碱烧伤；生物相容性；其他基金主题词：生物相容性材料；羟基磷灰石类；钛；角膜；支架基金资助：解放军十五课题(01MA109)*；解放军十一五课题(06MA281)*摘要背景：纯钛作为安全的生物种植体材料已被用于制作俄罗斯钛人工角膜，但其临床使用中仍存在人工角膜移位、漏水、角膜组织融解或人工角膜排出等并发症。目的：观察经羟基磷灰石表面修饰人工角膜钛支架在碱烧伤兔角膜内的生物相容性。方法：将30只右眼角膜碱烧伤新西兰白兔随机分为3组，实验组于角膜基质层内植入经羟基磷灰石表面修饰的人工角膜钛支架，对照组于角膜基质层内植入人工角膜钛支架，空白对照组仅作角膜板层切口。结果与结论：所有支架在观察期内稳定存留，无角膜坏死融解及支架脱出发生。术后2，8周，实验组与对照组炎症细胞浸润数量明显高于空白对照组(P 0.05)，16周后各组间炎症细胞浸润数量差异无显著性意义。术后2，8，16周，实验组角膜成纤维细胞数高于对照组和空白对照组(P 0.05)。实验组支架表面有密集的角膜细胞及细胞外基质紧密抓附，支架与角膜组织愈合良好；对照组支架表面仅见少量角膜组织简单包裹，支架与角膜组织未真正愈合。表明羟基磷灰石表面修饰的人工角膜钛支架可在碱烧伤兔角膜组织中稳定存留，生物相容性较单纯钛支架提高。Biocompatibility of hydroxyapatite modified titanium skirt for keratoprosthesis Ma Xiao1, Shi Hong1, Huang Yi-fei2, Huang Jing-xiang2, Cui Fu-zhai3 (1Department of Ophthalmology, Hospital of Shijitan, Beijing 100038, China; 2Department of Ophthalmology, General Hospital of PLA, Beijing 100853, China; 3Department of Materials Science and Engineering, Tsinghua University, Beijing 100084, China)马骁，女，1978年生，内蒙古自治区通辽市人，汉族，2007年解放军总医院毕业，博士，主治医师，主要从事角膜及眼表疾病的基础和临床工作。通讯作者：黄一飞，解放军总医院眼科，北京市 100853 mxia-010中图分类号:R318文献标识码:B文章编号:2095-4344(2013)51-08875-06 修回日期：2013-09-01(201304061/GWW)Ma Xiao, M.D., Attending physician, Department of Ophthalmology, Hospital of Shijitan, Beijing 100038, ChinaCorresponding author: Huang Yi-fei, Department of Ophthalmology, General Hospital of PLA, Beijing 100853, China mxia-010 Accepted: 2013-09-01AbstractBACKGROUND: Titanium implants as a safe biological material have been used to produce the artificial Russian titanium cornea, but complications still exist, including artificial cornea shift, leakage, corneal tissue melting and artificial cornea discharge.OBJECTIVE: To evaluate in vivo biocompatibility of hydroxyapatite modified titanium skirt for keratoprosthesis in alkali burn cornea.METHODS: A total of 30 alkali burned New Zealand white rabbit corneas were divided into three group groups. Hydroxyapatite modified titanium skirt (experimental group) and titanium skirt (control group) were respectively inserted into the corneal stroma of rabbits. In the blank control group, only a lamellar corneal incision was made. RESULTS AND CONCLUSION: All skirts were stable without necrosis, melting and exclusion during the observation period. The number of inflammatory cells in the experimental and control groups was significantly higher than that in the blank control group at 2 and 8 weeks postoperatively (P 0.05), but there was no difference in inflammatory cell infiltration among different groups by the 16th week. The number of corneal fibroblasts increased significantly in the experimental group compared with the control and blank control group after 2, 8, 16 weeks (P 0.05). The extracellular matrix deposited on the surface of hydroxyapatite modified titanium skirt was denser and tighter than that on the surface of titanium skirt. It indicates that hydroxyapatite modified titanium skirt for keratoprosthesis can promote the interfacial biointegration of skirt and host cornea.Subject headings: biocompatible materials; hydroxyapatites; titanium; cornea; stentsFunding: the Tenth Five-Year Projects of Chinese PLA, No. 01MA109*; the Eleventh Five-Year Projects of Chinese PLA, No. 06MA281*3 P.O.Box 1200,Shenyang 110004 kf23385083Ma X, Shi H, Huang YF, Huang JX, Cui FZ. Biocompatibility of hydroxyapatite modified titanium skirt for keratoprosthesis. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2013;17(51):8875-8880.8879ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH0 引言 Introduction对于严重双眼角膜盲患者，目前人工角膜是其最终复明的希望。人工角膜多由透明中心镜柱及植入病变角膜层间的支架两部分组成。为使人工角膜在眼内长期存留，人工角膜材料需具备良好的生物相容性。纯钛作为安全的生物种植体材料已用于制作MICOF人工角膜，但其临床使用中仍存在人工角膜移位、漏水、角膜组织融解或人工角膜排出等并发症1-3，18.8%的患者需要角膜进一步修补2。Kasemo4指出生物材料的组织相容性主要依赖于材料的表面特性，提高材料的表面活性将有效改善其生物相容性。表面修饰法是目前最常用的提高材料表面活性的方法5，实验拟将羟基磷灰石作为修饰材料固定到俄罗斯钛人工角膜钛支架表面，建立新西兰白兔角膜碱烧伤模型(模拟临床中严重血管化及瘢痕的病变角膜)，通过体内实验，观察人工角膜钛支架经羟基磷灰石表面修饰后，其生物相容性是否提高。1 材料和方法 Materials and methods 设计：以新西兰白兔为实验对象，随机对照实验。时间及地点：实验于2010年11月至2012年2月在解放军总医院眼科实验室完成。材料：实验动物：实验选用6月龄健康雌性新西兰白兔33只，体质量2.5-3.0 kg，由解放军总医院动物实验室提供，合格证号SCXK-2006，普通级。羟基磷灰石表面修饰人工角膜钛支架生物相容性实验的主要材料及仪器：来源材料及仪器宝鸡市钛星金属有限公司清华大学崔福斋教授实验室日本Hitachi S-450德国苏州明仁医疗器械商用纯钛箔(纯度99.5%)钛支架表面羟基磷灰石涂层的制备6扫描电子显微镜Leica2500E重型切片机、Muller FS2011型眼科手术显微镜、Leica 光学显微镜眼科显微手术器械实验方法：兔角膜碱烧伤模型的建立：33只新西兰白兔经速眠新号肌注(0.3 mL/kg)麻醉后，置开睑器，用直径为9 mm圆形滤纸片蘸取1 mol/L氢氧化钠溶液，密切贴附于兔右侧角膜正中并避开睑、球结膜，30 s后取下，大量生理盐水迅速冲洗角膜和结膜囊1 min。术后10 d每日以0.5%金霉素眼膏涂眼，3个月后取3只白兔角膜行组织病理学检查，其余30只进入人工角膜支架植入实验。人工角膜支架植入：将30只新西兰白兔随机分为3组，每组10只。实验组植入羟基磷灰石表面修饰的人工角膜钛支架，对照组植入人工角膜钛支架，空白对照组为手术对照组。手术方法：速眠新号(0.3 mL/kg)肌注麻醉白兔，在眼科手术显微镜下于右眼角膜缘内2 mm处做平行角膜缘的角膜板层切口，长6 mm，深为角膜全层的1/2-2/3；以角膜板层刀分离角膜板层制成直径约8 mm的角膜板层口袋，并尽量使其位于角膜中央。实验组和对照组于角膜板层口袋内分别植入羟基磷灰石表面修饰的人工角膜钛支架和人工角膜钛支架，空白对照组仅作角膜板层口袋，不植入人工角膜支架，作为手术对照组。角膜切口以10-0尼龙线间断缝合两针。术后给予0.5%金霉素眼膏连续涂眼3 d。1周内每日裂隙灯下观察角膜反应情况，之后改为每周3次。7 d后拆除角膜缝线。组织病理学检查：术后2，8，16周每组每个时间点各取2只兔，速眠新号肌注麻醉后，在手术显微镜下沿角膜缘剪下角膜，置40 g/L多聚甲醛(pH值7.2，4 ，现配)固定2 h，角膜内植入支架者使用塑料包埋法，无支架者选用石蜡包埋，苏木精-伊红染色，光学显微镜下观察支架与角膜组织界面愈合情况，200倍视野下任选10个等大的区域，计数各组炎症细胞数量和角膜成纤维细胞数量。扫描电子显微镜检查：术后6，12周，实验组和对照组每个时间点各取2只兔，速眠新号肌注麻醉后，在手术显微镜下沿支架边缘作角膜切口，板层刀分离支架周围的角膜组织，取出支架，PBS漂洗后，2.5%戊二醛固定，PBS漂洗，1%锇酸4 下固定1.0-2.0 h，梯度丙酮脱水，乙酸异戊酯替代，室温下六甲基二硅胺烷(HMDS)干燥，喷金，日立S-2250N扫描电子显微镜观察和摄片。主要观察指标：兔角膜碱烧伤3个月后模型的组织病理学检查。观察人工角膜支架植入兔角膜层间后界面的生物愈合情况。扫描电镜观察角膜内人工角膜支架取出后，其表面角膜组织的生长情况。统计学分析：实验数据由第二作者采用SPSS 16.0统计软件包进行分析，数据用x(_)s表示，组间比较用方差分析和q 检验，以P 0.05为差异有显著性意义。 2 结果 Results2.1 兔角膜碱烧伤模型 角膜碱烧伤后3 d内，炎症反应最强烈，角膜上皮缺损、基质水肿，7 d后炎症反应开始减退，角膜缘充血减轻但新生血管增加。3个月后，所有动物形成了角膜白斑和新生血管。组织学检查：苏木精-伊红染色见再生的角膜上皮厚薄不均，角膜基质排列不规则，基质内可见新生血管，有多形核白细胞和巨噬细胞浸润，亦有一定数量的纤维母细胞及成纤维细胞存在，见图1，表明碱烧伤造成的炎症反应已减轻，角膜从炎症反应状态转向组织修复过程。注：再生的角膜上皮厚薄不均，角膜基质排列不规则，基质内可见新生血管，有多形核白细胞和巨噬细胞浸润，亦有一定数量的纤维母细胞及成纤维细胞存在。图1 兔角膜碱烧伤后3个月(苏木精-伊红染色，200)Figure 1 Corneal tissue 3 mon after alkali burn (Hematoxylin-eosin staining, 200)2.2 人工角膜钛支架植入后的临床观察 术后7 d内出现不同程度的畏光、流泪、分泌物增多，7 d后症状消失。观察期内支架均稳定存留，无角膜溃疡、坏死融解及支架脱出发生，见图2。注：支架稳定存留，无角膜溃疡、坏死融解及支架脱出发生。图2 羟基磷灰石表涂层人工角膜钛支架或人工角膜钛支架植入碱烧伤兔角膜Figure 2 Hydroxyapatite modified titanium skirt or titanium skirt for keratoprosthesis was implanted into the corneal stroma of alkali burn rabbits2.3 组织学检查结果 实验组、对照组采用塑料包埋，切片过程中钛支架全部脱落，在角膜基质内留下一空腔，但钛表面的羟基磷灰石涂层仍保留在原位。支架脱落处的组织界面光滑，形态保存好。术后2周可见角膜组织界面处大量炎症细胞浸润，主要为嗜酸性粒细胞和巨噬细胞，后随时间逐渐减少，见图3。羟基磷灰石涂层A：植入羟基磷灰石涂层人工角膜钛支架的实验组B：植入人工角膜钛支架的对照组C：未植入任何物质的空白对照组注：各组均可见角膜组织界面处大量炎症细胞浸润，主要为嗜酸性粒细胞和巨噬细胞，实验组与对照组炎症反应较空白对照组重。图3 将不同材料植入碱烧伤兔角膜后2周的苏木精-伊红染色(200)Figure 3 Hematoxylin-eosin staining of corneal tissues at 2 wk after different skirt implantation in alkali burn rabbits (200)各组炎症细胞计数结果显示，术后2，8 周，实验组与对照组炎症反应程度相近，均明显高于空白对照组(P 0.05)，见图4。242016128 4 0羟基磷灰石涂层钛组纯钛组空白对照组炎症细胞计数术后2周 术后8周 术后16周注：术后2，8 周，植入羟基磷灰石涂层钛支架组与植入纯钛支架组炎症反应程度相近，均明显高于未植入任何物质空白对照组(P 0.05)，说明羟基磷灰石涂层人工角膜钛支架和人工角膜钛支架一样，均为安全的种植体。图4 将不同材料植入碱烧伤兔角膜2，8，16周后的炎症细胞计数Figure 4 Counting of inflammatory cells at 2, 8, 16 wk after different skirt implantation into the cornea of alkali burn rabbits术后2周组织界面处即可见角膜成纤维细胞增殖，术后2，8，16周角膜成纤维细胞计数结果显示，实验组角膜成纤维细胞增殖最显著，明显高于对照组和空白对照组(P 0.05)，见图5。羟基磷灰石涂层钛组纯钛组空白对照组35302520151050成纤维细胞计数术后2周 术后8周 术后16周注：植入羟基磷灰石涂层人工角膜钛支架组角膜成纤维细胞增殖最显著，明显高于植入人工角膜钛支架组和未植入任何物质的空白对照组(P 0.05)。图5 将不同材料植入碱烧伤兔角膜2，8，16周后的角膜成纤维细胞计数Figure 5 Counting of corneal fibroblasts at 2, 8, 16 wk after different skirt implantation into the cornea of alkali burn rabbits人工角膜支架：扫描电镜见纯钛支架表面平整光滑，见图6；经酸碱法预处理后钛表面产生的羟基磷灰石涂层由两层结构组成，外层为疏松的片状羟基磷灰石结晶，内层为羟基磷灰石密集层, 估计羟基磷灰石涂层厚度约为30 m，见图7。注：纯钛支架表面平整光滑。图6 扫描电子显微镜下钛表面情况(2 000)Figure 6 Surface texture of titanium skirt detected by scanning electron microscope (2 000)角膜层间取出的人工角膜支架：术后6周，钛支架表面可见细胞及细胞外基质附着，但数量少并呈简单贴附生长；术后12周，钛支架表面细胞数目减少，支架表面仍大部分呈裸露状态，局部区域可见少量角膜组织包裹钛支架，钛/角膜界面未真正愈合，见图8，9。术后6周，羟基磷灰石涂层钛支架表面可见角膜成纤维细胞跨越羟基磷灰石微孔表面向孔内生长，角膜组织呈爬行生长并连接成片；12周后羟基磷灰石涂层钛支架表面大部分被密集的角膜细胞外基质及细胞紧密抓附覆盖，羟基磷灰石涂层钛/角膜界面粘连紧密，愈合良好，见图10，11。A：钛表面羟基磷灰石涂层B：钛表面羟基磷灰石断层扫描注：经酸碱法预处理后钛表面产生的羟基磷灰石涂层由两层结构组成，外层为疏松的片状羟基磷灰石结晶，内层为羟基磷灰石密集层, 估计羟基磷灰石涂层厚度约为30 m。图7 扫描电子显微镜下羟基磷灰石涂层钛表面及其断层情况(2 000)Figure 7 Surface and tomographic texture of hydroxyapatite modified titanium skirt detected by scanning electron microscope (2 000)注：植入后6周，钛支架表面可见细胞及细胞外基质附着，但数量少并呈简单贴附生长。图8 将钛支架植入碱烧伤兔角膜6周，角膜组织在支架表面的沉积情况(710) Figure 8 Corneal matrix deposited on the surface of titanium skirt at 6 wk after implantation (710)注：植入后12周，钛支架表面细胞数目减少，支架表面仍大部分呈裸露状态，局部区域可见少量角膜组织包裹钛支架，钛/角膜界面未真正愈合。图9 将钛支架植入碱烧伤兔角膜12周，角膜组织在支架表面的沉积情况(200)Figure 9 Corneal matrix deposited on the surface of titanium skirt at 12 wk after implantation (200)注：植入后6周，羟基磷灰石修饰的钛支架表面可见角膜成纤维细胞跨越羟基磷灰石微孔表面向孔内生长，角膜组织呈爬行生长并连接成片。图10 将羟基磷灰石涂层钛支架植入碱烧伤兔角膜6周，角膜组织在支架表面的沉积情况(1 900)Figure 10 Corneal matrix deposited on the surface of hydroxyapatite modified titanium skirt at 6 wk after implantation (1 900)注：植入后12周，羟基磷灰石修饰的钛支架表面大部分被密集的角膜细胞外基质及细胞紧密抓附覆盖，羟基磷灰石涂层钛/角膜界面粘连紧密，愈合良好。图11 将羟基磷灰石涂层钛支架植入碱烧伤兔角膜12周，角膜组织在支架表面的沉积情况(200)Figure 11 Corneal matrix deposited on the surface of hydroxyapatite modified titanium skirt at 12 wk after implantation (200)3 讨论 Discussion对于严重的角膜疾病如Stevens-Johnson 综合征、眼瘢痕性类天疱疮、严重的眼化学烧伤等导致的双眼盲患者，人工角膜是其最终复明的希望，但以往临床中使用的人工角膜材料，如合金、PMMA、PHEMA、PTFE等，生物活性差，与宿主角膜的结合多是简单的黏附，因而人工角膜难以在眼内长期稳定的存留7。调节材料的生物活性使其能与角膜牢固结合融为一体已成为人工角膜进一步发展的方向8。目前最成功的人工角膜是以患者牙齿作为支架材料的OOKP人工角膜，但OOKP手术周期长，需损耗患者牙齿，而且长期使用中存在着骨质支架吸收问题9。实验将骨质中的主要活性成分羟基磷灰石通过酸碱两步法沉积在钛支架表面改变其生物活性，并已在体外实验中证实钛支架经羟基磷灰石表面修饰后，其促角膜成纤维细胞黏附、增殖生长及分化的能力均有提高10。在此研究基础上，作者进一步进行了体内实验，将羟基磷灰石-钛和钛支架分别植入碱烧伤新西兰白兔角膜层间，结果发现羟基磷灰石-钛与角膜组织的界面愈合情况明显优于纯钛支架。羟基磷灰石表面修饰法促进了支架材料与宿主角膜的生物整合。对宿主而言，生物材料植入体内后引发的最普遍反应就是炎症反应，包括早期宿主对手术损伤的修复反应及晚期植入材料诱导的宿主异物反应11。生物材料的理化特性及表面特性将直接影响炎症反应的进程，而炎症反应的程度和持续时间又将反过来影响到生物材料的稳定性12-13。实验发现术后2周和8周时，羟基磷灰石-钛或钛支架界面炎症反应较轻、程度相近，并随时间炎症反应逐渐减弱，说明羟基磷灰石-钛和钛一样，均为安全的种植体，其引发的炎症反应可被宿主接受，不引起排斥，这与Linnola等14的研究结果一致。作者研究发现，虽然两种支架植入角膜后均能促进角膜成纤维细胞的增生及细胞外基质的沉积，但各个观察时间点，羟基磷灰石-钛组角膜成纤维细胞的数目均多于钛支架组，而且两组细胞外基质沉积的形式不同，在钛支架组宿主角膜的胶原纤维平行环绕于钛支架表面，扫描电镜证实这些环绕的角膜组织与钛表面的结合仅是简单的贴附。与钛作为口腔种植体时，牙龈纤维与钛的结合情况相似。这种简单的附着在眼睑和眼球运动等外力作用下将可能发生分离，因此MICOF人工角膜临床使用中存在移位、漏水等并发症。与钛/角膜界面不同，在羟基磷灰石-钛支架组，角膜成纤维细胞跨越羟基磷灰石微孔表面向孔内生长，羟基磷灰石-钛支架表面大部分被密集的角膜细胞外基质及细胞紧密抓附，羟基磷灰石-钛/角膜组织界面愈合良好，Slettebery等15发现将生物陶瓷从体内排出的难度是钛排出的10倍，其原因即是生物陶瓷与体液接触后在其表面形成了一薄层羟基磷灰石，从而限制了其排出。羟基磷灰石是目前公认的较好的生物相容性材料，其可促进软/硬组织间的生物整合，但纯羟基磷灰石脆性大、质硬、可塑性差16，单独作为人工角膜支架时无法承受眨眼时眼睑对角膜的加压，易发生碎裂。将羟基磷灰石涂覆到钛支架表面制成复合材料，可使其兼有羟基磷灰石的生物活性和金属较强的力学性能，为临床改良MICOF人工角膜提供了新方法。临床中人工角膜的适应证是严重血管化及长期存在慢性炎症的病变角膜，在这些角膜中角膜成纤维细胞增生及胶原沉积能力均不足17。实验中建立中度兔角膜碱烧伤模型，烧伤后不给予任何抗炎及抗胶原酶药物治疗，以使损伤更大化，并选择于碱烧伤3个月后植入羟基磷灰石/钛和钛支架，因为此时兔角膜仍处于炎症反应期，角膜成纤维细胞少，组织愈合功能差，可较好地模拟临床实际情况，使实验更具意义。作者贡献：黄一飞、马骁进行实验设计，实验实施为马骁，实验评估为石红，资料收集为马骁，马骁成文，黄一飞审校，马骁对文章负责。利益冲突：课题未涉及任何厂家及相关雇主或其他经济组织直接或间接的经济或利益的赞助。伦理要求：实验过程中对动物的处置符合2009年Ethical issues in animal experimentation相关动物伦理学标准的条例。学术术语：表面改性-指在保持材料或制品原性能的前提下，赋予其表面新的性能，如亲水性、生物相容性、抗静电性能、染色性能等。表面改性的方法有很多报道，大体上可以归结为:表面化学反应法、表面接枝法、表面复合化法等。作者声明：文章为原创作品，数据准确，内容不涉及泄密，无一稿两投，无抄袭，无内容剽窃，无作者署名争议，无与他人课题以及专利技术的争执，内容真实，文责自负。4 参考文献 References1 黄一飞,王丽强,王凤翔.人工角膜植入术的临床研究J.中华眼科杂志,2003, 39(10):9-12. 2 Huang YF,Yu JF,Liu L,et al.Moscow Eye Microsurgery Complex in Russia Keratoprosthesis in Beijing. 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