生物分子的分离纯化

2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics1第七章生物分子的分离纯化2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics2生物大分子（蛋白质、核酸、糖复合物等）生物分子（Biomolecule）泛指生物体特有的各类分子，是自然存在于生物体中的分子的总称，是组成生命的基本单位。包括小分子（如脂类、激素、维生素等）2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics35）能人工合成与改造。生物分子是生物所特有的有机化合物，具有如下主要特征：1）结构复杂有序、具有特殊的层次；2）行使专一的功能；3）代谢是其存在的条件；4）生物分子体系具有自我复制的能力；2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics4一、生物大分子的制备 生物大分子指的是作为生物体内主要活性成分的各种分子量达到上万或更多的有机分子。常见的生物大分子包括蛋白质、核酸、脂类、糖类。2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics5（1）分离纯化方法千差万别，没有一种标准方法可通用于各种生物大分子的分离制备；（2）制备几乎都是在溶液中进行的，难以准确估计和判断pH值、温度度等各种参数对溶液中各种组份的综合影响 生物大分子的制备有以下主要特点：2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics6（3）大多数生物大分子的含量极微，分离纯化的步骤多，流程长，有的目的产物甚至要经过几十步的操作才能达到所需纯度；（4）分离纯化过程中要保证目标产物的活性。2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics7生物大分子制备的一般步骤：确定制备的目的和要求确定制备的目的和要求文献调研和预备性实验文献调研和预备性实验建立相应的可靠的分析测定方法建立相应的可靠的分析测定方法材料的破碎和预处理材料的破碎和预处理分离纯化方案的选择和探索分离纯化方案的选择和探索产物纯度的鉴定产物纯度的鉴定产物的浓缩，干燥和保存。产物的浓缩，干燥和保存。科研、开发或发现新的物质制备的关键要求达到一维电泳一条带，二维电泳一个点，或HPLC和毛细管电泳都是一个峰最困难的过程掌握目的产物的理化性质特异性强准确度高灵敏度高使用快捷方便 2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics8 制备生物大分子的分离纯化方法多种多样，主要是利用它们之间理化性质的差异。根据作用原理生物分子的分离、纯化可分为以下几种类型：（1）根据分子极性大小和溶解度的不同，如溶剂提取技术、盐析法、分配层析法、分级沉淀法等；（2）根据分子形状和大小不同，如凝胶过滤层析等；（3）根据物质吸附性质不同，如选择性吸附与吸附层析法等；（4）根据分子带电性（电离性质）的差异，如离子交换层析、电泳、等电聚焦法等。（5）根据配体特异性，如亲和层析。2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics9破碎方法应用机械法研磨法细菌、酵母匀浆法机体软组织捣碎法动物韧性组织化学法酶解法细菌、酵母去垢剂组织、细胞有机溶剂细菌、酵母物理法反复冻融法细胞超声波法细胞悬液低渗裂解法红细胞冷热交替法细菌、病毒常用破碎方法常用破碎方法 2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics10影响提取效果的因素影响提取效果的因素（1）pH值（2）盐浓度（即离子强度）（3）温度（4）水解酶（5）搅拌与氧化（6）有机溶剂 2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics11 生物大分子的分离纯化生物大分子的分离纯化 （1）盐析法 2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics12（2）有机溶剂沉淀法 2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics13(3)透析(dialysis)利用透析袋把大分子蛋白质与小分子化合物分开的方法。含蛋白溶液透析袋透析液磁子电磁搅拌器2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics14 核酸（nucleic acid）是遗传信息的携带者，是基因表达的物质基础(包括DNA与RNA)。无论是进行核酸结构还是功能研究，首先需要对核酸进行分离和纯化。核酸样品质量将直接关系到实验的成败。DNA与RNA理化性质及细胞定位上的差异决定了两者的最适分离与纯化条件的不同二、核酸的分离纯化 2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics15 材料与方法的选择 核酸存在于动植物的细胞以及各种微生物之中。临床诊断常见的标本包括血液、尿液、唾液、组织及培养的细胞。不同的研究目的对核酸的完整性、纯度、产量及浓度可能有不同的要求2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics16意义：遗传信息全部储存在一级结构之中，核酸的一级结构还决定其高级结构的形式以及和其他生物大分子结合的方式。分离纯化的原则 一是保持核酸碱基序列的完整性。二是尽量清除其它分子的污染，保证核酸制品的纯度。2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics17对于核酸的纯化应达到以下三点要求：1）核酸样品中不存在过高浓度的金属离子和对酶有抑制作用的有机溶剂；2）其它生物大分子如蛋白质、脂类和多糖分子的污染应降至最低程度；3）排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分子时应去除RNA，提取RNA分子时应去除DNA。2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics18 保持核酸的完整性 在整个操作过程中应尽量避免各种有害因素对核酸的破坏。1）温度不要过高(04)；(高温破坏氢键)2）控制pH值范围(pH值4-10);(极端酸碱破坏磷酸二酯键)3）保持一定离子强度;4）减少物理因素对核酸的机械剪切力.2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics19防止核酸的生物降解 细胞内或外来的各种核酸酶能消化核酸链中的磷酸二酯键，破坏核酸一级结构。所用器械和一些试剂需高温灭菌，提取缓冲液中需加核酸酶抑制剂。2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics20DNA酶抑制剂(1）金属离子螯合剂：DNA酶需要金属二价离子Mg2+、Ca2+的激活，因此使用金属二价离子螯合剂，可抑制DNA酶活性。如EDTA-Na2(乙二胺四乙酸二钠)、8-羟基喹啉；(2）阴离于型表面活性剂：如SDS，该试剂除对核酸酶有抑制作用外，还能使蛋白质变性，并与变性蛋白结合成带负电荷的复合物，该复合物在高盐溶液中沉淀。2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics21 RNA酶（RNAase)抑制剂RNAase分布广泛，极易污染样品，而且耐高温、耐酸、耐碱，不宜失活。(1)皂土（bentonite）作用机制：皂土带负电荷，能吸附RNase，使其失活。2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics22 (2)DEPC(二乙基焦碳酸盐)(C2H5OCOOCOOC2H5)粘性液体，很强的核酸酶抑制剂。作用机制：与蛋白质中His结合使蛋白变性。使用注意：1）DEPC也能破坏单链核酸中大部分腺嘌呤环。但浓度比使蛋白质变性的浓度大1001000倍。2）容易降解，保存在4或液氮中；3）提RNA时，0.1%DEPC浸泡器皿37 2 h。4）剧毒。2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics23（3)肝素（4）复合硅酸盐（Macaloid)（5）RNase阻抑蛋白（RNasin）（6）氧钒核糖核苷复合物(Vanadyl-Ribonucleoside Complex,VRC)2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics24核酸制备的技术路线2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics25（一）核酸的释放 一般情况下，DNA和RNA均位于细胞内（病毒除外），因此核酸分离与纯化的第一步即是裂解细胞、释放核酸。破碎细胞的方法很多包括机械和非机械法两大类。(1)高速组织捣碎机捣碎 (2)玻璃匀浆器匀浆 (3)超声波处理法 (4)液氮研磨法 (5)化学处理法(SDS、LDS，吐温80等）(6)生化法（溶菌酶、纤维素酶等）2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics26（二）核酸的分离与纯化 应该清除的杂质主要包括三部分：非核酸的大分子污染物 非需要的核酸分子 在分离纯化过程中前后加入的对后继研究与诊断有影响的溶液和试剂。2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics27非核酸大分子杂质主要是蛋白质、多糖及脂类物质。分离核酸最困难的是将与核酸紧密结合的蛋白质分开，同时避免核酸降解。1、加入浓盐溶液（如NaCl）核酸-蛋白质加入NaCl后，破坏静电吸力，使氢键破坏，核蛋白解聚；2、加入SDS SDS除有破胞和抑制核酸酶的作用外，还具有使核酸从蛋白质上游离出来的功能；2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics28非需要的核酸分子是指制备DNA时RNA 为杂质，制备RNA时DNA为杂质，分离某一特定的核酸分子时，其它的核酸分子皆为杂质；至于加入的有机溶剂和某些金属离子，由于影响后续操作，往往需要很好地剔除。2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics29（三）核酸的浓缩、沉淀与洗涤 随着提取试剂的逐步加入，去除杂质时的丢失，样品中核酸的浓度会逐步下降，当不能满足后续研究与诊断所需时应对样品进行浓缩。沉淀是浓缩核酸的最常用且高效的方法，优点：改变核酸的溶解缓冲液；重新调整核酸的浓度；去除溶液中某些盐离子与杂质。2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics30盐贮存液浓度（mol/L)终浓度(mol/L)MgCl210.01NaAc3(pH5.2)0.3KAc3(pH5.2)0.3NH4Ac102.5NaCl50.2LiCl80.8 当核酸溶液的pH值大于4时，核酸分子呈多聚阴离子状态，它与1价或2价阳离子形成的盐在许多有机溶剂中不溶解，也不会被有机溶剂变性。2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics31因此，常在加入一定浓度的盐后，再用有机溶剂沉淀抽提液中的核酸，常用的有机溶剂则为乙醇、异丙醇和聚乙二醇。优点缺点乙醇对盐类沉淀少，易挥发除去，不影响以后实验需要量大，低温操作异丙醇需体积小，速度快，一般不需低温长时间放置易使盐类、蔗糖与DNA共沉淀异丙醇难以挥发除去聚乙二醇（PEG）可用不同浓度的PEG选择沉淀不同相对分子质量的DNA片段一般需加NaCl或MgCl2。要除去DNA沉淀中PEG2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics32核酸的鉴定与保存（一）核酸的鉴定1.浓度鉴定 核酸浓度的测定可通过紫外分光光度法与荧光光度法进行。紫外分光光度法：该法是基于核酸分子中的碱基具有共轭双键结构因而可以吸收紫外线，其最大吸收波长为260nm，这一物理特性。前提：核酸样品要较纯，无显著蛋白质、酚、琼脂糖及其他核酸污染。测定浓度应大于0.25 g/ml2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics33荧光光度法：核酸在荧光染料溴化乙锭（ethidium bromide，EB）嵌入碱基平面后，本身无荧光的核酸在UV激发下发出红色荧光，且荧光强度的积分与溶液中核酸的含量呈正比。2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics34 纯度鉴定 紫外分光光度法或荧光光度法皆可用于核酸制品的纯度鉴定。紫外分光光度法：该法主要通过A260与A280的比值来判定有无蛋白质的污染。在TE缓冲液中，纯DNA的A260/A280为1.8，纯RNA的比值为2.0。比值升高与降低均提示不纯。荧光光度法：用EB等荧光染料示踪的核酸电泳结果可判定核酸制品的纯度。DNA分子较RNA大得多，电泳迁移率低。2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics35完整性鉴定琼脂糖凝胶电泳法：以EB为示踪剂的核酸凝胶电泳结果为依据。基因组DNA片段如发生降解，电泳图呈拖尾状。完整的或降解很少的总RNA电泳图谱中，三条带的荧光强度积分应呈特定的比值，如有改变则提示有RNA的降解。此外，若在点样孔附近有着色条带，则说明存在DNA 的污染。其它方法：必要时，还可通过一些特殊的实验来鉴定RNA的完整性。如小规模的cDNA第一条链的合成反应，已知大小的某种mRNA的Northern杂交等2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics36(1)对DNA DNA样品溶于pH8.0的TE，4 或-20 保存；在-70可保存数年 长期保存样品中可加入1滴氯仿。(2)对RNA RNA样品溶于0.3 mol/L NaAc(pH5.2)或双蒸灭菌水中，-70 保存;长期保存可以沉淀形式贮于乙醇中;在RNA溶液中，加1滴0.2 mol/L VRC(氧钒核糖核苷复合物)冻贮于-70,可保存数年。核酸的保存2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics37尽管基因组DNA因来源、性质以及制备的目的不同，其分离纯化的方法不尽相同，但有关分离纯化的原则、主要步骤、主要技术、主要试剂及其作用原理是一样的。基因组DNA分离纯化的一般程序见图7-4。真核基因组DNA的分离纯化2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics38真核基因组DNA分离纯化的一般技术路线2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics39一、酚抽提法该法于1976年由Stafford及其同事创立，现在使用的是改进的方法：以含EDTA、十二烷基磺酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）及无DNase的RNase裂解缓冲液裂解细胞，经蛋白酶K（proteinase K）处理后，用pH8.0的Tris饱和酚抽提DNA，重复抽提至一定纯度后，依据不同需要进行透析或沉淀处理，获得DNA粗制品。2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics40裂解液中：EDTA：离子螯合剂，抑制DNase活性，降低细胞膜稳定性SDS：溶解细胞膜、核膜，乳化脂质、蛋白，并使其变性沉淀，同时变性DNase无DNase的RNase可高效水解RNA而避免DNA的消化蛋白酶K：消化DNase和胞中的蛋白质酚：变性沉淀蛋白，抑制DNase活性pH 8.0的Tris溶液保证抽提时DNA进入水相，防止DNA变性2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics41二、甲酰胺解聚法1987年Kupiec等报道了甲酰胺（formamide）解聚法，其中细胞裂解和蛋白质水解步骤同酚抽提法，但不进行酚的抽提，而是以高浓度的甲酰胺裂解染色质中DNA与蛋白质，然后使用火棉胶袋进行充分透析去除蛋白酶K及有机溶剂。甲酰胺是一种离子化溶剂，既可裂解DNA与蛋白质的复合物，又可变性沉淀释放的蛋白质，但对蛋白酶K的活性无显著影响。该法操作步骤少，但耗时，所得DNA浓度低，适用于制备大片段DNA2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics42 三、玻棒缠绕法用该法收集高分子量DNA的沉淀始于20世纪30年代，现今使用的缠绕法是以1987年Bowtell的方法经改进而来。本法有两个关键步骤：一是基因组DNA沉淀在细胞裂解液和乙醇的交界面；二是将DNA沉淀缠绕在带钩玻棒上。带钩玻棒将大片段DNA从无水乙醇中转移至pH8.0的TE缓冲液中。该法以盐酸胍裂解细胞，制备的DNA片段约有80kb，适用于同时从不同细胞或组织标本中提取DNA2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics43四、其它方法如异丙醇沉淀法能去除部分RNA，从而略去了RNase的消化，所需时间短再如采用直径为525m的玻璃珠吸附法，可在45分钟内完成DNA的提取。这些步骤简化、操作简便的DNA快速提取法，适用于常用的一些分子生物学技术及分子诊断，且不需要高分子量的DNA样品的制备2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics44 但各种方法的取舍、蛋白酶K和RNase的使用与否要依据需要精心选择。一般而言，蛋白酶K的使用可以提高DNA的纯度和产量，但对要求不高的某些PCR诊断并非必需。尽管RNA的存在对以DNA为模板的PCR反应本身无影响，但是使用分别设计在两个外显子上的特异性引物进行PCR扩增时，以DNA或RNA为模板所得的PCR产物是不同的，故应有选择性地使用RNase。2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics45基因组DNA片段的纯化纯化的原则与要求纯化的原则与要求纯化的方法有透析、层析、电泳及选择性沉淀等。无论采用何种方法从何种支持介质中纯化与回收所需要的DNA片段都要注意两个原则：一是提高片段的回收率；二要清除回收的DNA样品中的污染。2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics461.回收率 为提高DNA片段的回收率，可通过提高DNA样品的上样量和选择适宜的方法与材料而实现。2.纯度 常用的纯化方法包括有机溶剂抽提法与商品化的柱层析法（column chromatography）。柱层析法采用的是阴离子交换层析的原理2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics47从琼脂糖凝胶中回收DNA片段从琼脂糖凝胶中纯化DNA片段的方法主要有二乙基氨基乙基（diethyl aminoethyl，DEAE）-纤维素（cellulose）膜插片电泳法电泳洗脱法（透析袋及非透析袋电泳洗脱法）冷冻挤压法低熔点琼脂糖凝胶挖块回收法等。2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics48目前，有许多能从琼脂糖凝胶中回收DNA片段的方法与改良方案，但至今尚无一种方法既能有效回收DNA大片段或微量的DNA片段，又能同时回收几种DNA片段并有效清除凝胶中酶促反应抑制剂（如多糖类）。每种方法各具特点，各有其适用范围，应依据不同的要求精选不同的方法。2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics49从聚丙烯酰胺凝胶回收DNA片段从聚丙烯酰胺凝胶中回收DNA的标准方法是压碎与浸泡法。它是将含待回收DNA条带的凝胶块切出，用吸头或接种针将其压碎，然后以洗脱缓冲液浸泡，使DNA洗脱出来。该方法能很好地回收小于1 kb的ss或ds-DNA，依分子量不同，其回收率从小于30%至大于90%不等。回收的DNA纯度极高，无酶抑制剂，也无对转染细胞或微注射细胞有毒的污染物，虽费时但操作简单，是小片段DNA回收的较好方法。2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics50质粒质粒DNADNA的提取与纯化的提取与纯化2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics51质粒DNA的提取与纯化的经典方法包括：碱裂解法 煮沸裂解法 SDS裂解法等这些方法主要由质粒DNA的扩增、质粒DNA的释放、质粒DNA的分离纯化三个步骤组成2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics52一、碱裂解法 在NaOH存在的强碱性（pH12.012.6）条件下，用SDS破坏细胞壁和裂解细胞，并使细胞的蛋白质与DNA发生变性，释放出质粒DNA。细胞被裂解后，细胞壁及膜的碎片与变性的蛋白质和染色体DNA形成大的复合物，在高盐条件下可有效沉淀，经离心分离，质粒DNA保留在上清液中。使用预冷无水乙醇沉淀上清液中的质粒DNA，再用70%的乙醇洗涤。2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics53尽管碱溶液能破坏DNA中的碱基配对，但CCC质粒DNA因缠绕紧密而不易解链，只要不在碱性条件下变性太久，当pH调至中性时，CCC质粒DNA就可重新恢复天然的超螺旋。该法操作简单、重复性好且成本低，制备的质粒纯度能满足DNA测序与PCR等实验要求，是使用最广泛的方法2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics54二、SDS裂解法 SDS裂解法是将细菌悬浮于等渗的蔗糖溶液中，用溶菌酶和EDTA处理以破坏细胞壁，再用SDS裂解去壁细胞，从而温和地释放质粒到等渗液中，然后酚/氯仿抽提，乙醇沉淀、洗涤质粒DNA。由于条件温和，该法特别适用于大质粒DNA（15kb）的提取。但有一部分质粒DNA会与细胞碎片缠绕在一起而丢失，故产率不高。2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics55三、煮沸裂解法 煮沸裂解法是将细菌悬浮于含TritonX-100和溶菌酶的缓冲液中，再用沸水浴裂解细胞，并使宿主细胞的蛋白质与DNA变性。CCC质粒DNA因结构紧密不会解链，当温度下降后，可重新恢复其天然超螺旋结构。通过离心去除变性的蛋白质和染色体DNA。然后回收上清液中的质粒DNA。该法条件剧烈，只能用于小质粒DNA的制备2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics56四、其它方法 小量一步提取法是直接将酚/氯仿与细菌培养物混合，同时完成细胞裂解与蛋白质变性两个过程，然后离心去除大部分蛋白质和染色体DNA，最后从上清液中回收质粒DNA。本法简单快捷、成本低，提取的质粒可用于限制性内切酶图谱分析。牙签少量制备法是用牙签直接挑取生长在琼脂平板上的细菌菌落制备质粒DNA，由于制备的质粒DNA有较多污染，不能用于分子克隆中的酶学反应，但可用于质粒的鉴定。2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics57质粒DNA的纯化 1、CsCl-EB法 利用CsCl形成的连续密度梯度，在过量EB存在的条件下，各种不同密度的物质经离心平衡后得以分开。2、聚乙二醇沉淀法 （一种分级沉淀法）3、柱层析法（树脂）2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics58DNA提取常见问题q问题一：DNA样品不纯，抑制后续酶解和PCR反应q问题二：DNA降解q问题三：DNA提取量少2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics59 RNA极易被RNase水解，除胞内的RNase外，它还广泛存在于人的皮肤、唾液、汗液及周围的环境中；RNase分子结构中二硫键的存在使其生物学活性非常稳定，加热煮沸及一般的变性剂均不能使其完全灭活，而且去除变性剂（denaturant）后，RNase的活性又可恢复。因此，在RNA的制备过程中，排除RNase的污染及强有力地抑制其活性是RNA制备成功与否的关键真核细胞RNA的分离纯化2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics60 为获得完整的RNA分子，必须在总RNA提取分离的最初阶段，尽可能地灭活胞内RNase的活性。选择性地使用RNase的变性剂（如酚、氯仿及强烈的胍类变性剂）。蛋白酶K和能与蛋白质结合的阴离子去污剂如SDS、十二烷基肌氨酸钠或脱氧胆酸钠，并联合使用RNase的特异抑制剂（如RNasin与DEPC等）能极大地防止内源性RNase对RNA的降解。此外，在变性液中加入-疏基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）等还原剂可以还原RNase中的二硫键，有利于RNase的变性、水解与灭活。2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics61 该法是经典的一步法，它以含异硫氰酸胍（guanidinium thiocyanate）、-疏基乙醇和十二烷基肌氨酸钠的变性溶液裂解细胞，然后在pH4.0的条件下，用酚/氯仿抽提细胞裂解溶液，最后通过异丙醇沉淀与75%的乙醇洗涤而获得总RNA。本法具有简便、快速、经济、高效及提取的RNA质量高等优点，能在3小时内迅速处理多个标本 酸性异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法 分离总RNA2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics62 酚氯仿混合使用能增加去除蛋白的效果，并对核酸酶有抑制作用。氯仿比重大，能加速有机相与水相分层，减少残留在水相中的酚，同时氯仿具有去除植物色素和蔗糖的作用。2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics63商品化的单相裂解试剂法分RNA 本法是异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法的改进方案。以异硫氰酸胍-酚的单相裂解液裂解细胞，再加入氯仿后形成两相。变性的DNA与蛋白质介于两相的交界面，保留于上层水相的RNA，通过异丙醇沉淀与75%乙醇洗涤而制备。目前，该法已有多种商品化的单相裂解试剂供选择，已成为实验室最常用的总RNA提取法，其产量及质量与前法相当。2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics64mRNA的分离纯化 与序列明确的rRNA、tRNA、snRNA、scRNA不同，真核生物的mRNA在细胞中含量少，种类多且分子量大小不一。除血红蛋白及组蛋白的mRNA外，绝大多数mRNA在其3末端带有长短不同的poly（A）尾巴。依据mRNA的结构特征，利用碱基配对原则，通过oligo（dT）-纤维素或poly（U）-琼脂糖凝胶的亲和层析，可以很容易地从总RNA制品中分离纯化mRNA。2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics65oligo（dT）-纤维素柱层析法oligo（dT）-纤维素柱离心法oligo（dT）-纤维素液相结合离心法磁性球珠分离法 该法联合利用了oligo（dT）与poly（A）的互补配对、生物素（biotin）与链亲和素（streptavidin）的结合特异性以及磁性分离原理，可对poly（A）+RNA进行高效、灵敏及快捷的分离（图3-2）。2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics665m7G AAAAAAAAAAAA3 3TTTTTTTTTTTT-Biotin5+总RNA中的poly(A)+RNA分子退火形成杂交体 5m7G AAAAAAAAAAAA3 3TTTTTTTTTTTT-Biotin5链亲和素标记的磁珠+Streptavidin-磁5m7G AAAAAAAAAAAA3 3TTTTTTTTTTTT-Biotin5Streptavidin-磁生物素与链亲和素的特异性结合 磁性分离5m7G AAAAAAAAAAAA3 磁铁3TTTTTTTTTTTT-Biotin5Streptavidin-磁洗涤与洗脱水相(含纯化的mRNA)固相生物素标记的oligo(dT)磁铁5m7G AAAAAAAAAAAA3 3TTTTTTTTTTTT-Biotin5Streptavidin-磁图 3-2 磁珠分离法纯化poly(A)+RNA的原理2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics67其它方法Poly(U)-凝胶层析法:利用 Poly(U)与 Poly(A)的互补配对原理Poly(U)-滤纸法:将总RNA加到共价交联有Poly(U)的滤纸上,经洗涤后加热洗脱2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics68三、蛋白质的分离与纯化2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics69 蛋白质的分离纯化是研究蛋白质化学组成、结构及生物学功能、新蛋白质的发现和疾病分子诊断的基础；分子克隆中，下游的处理和分析鉴定，基因工程产品的制备，也需要蛋白质的分离和纯化。2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics70 蛋白质分离纯化的总目标是增加制品的纯度（purity）或比活（specific activity），以增加单位蛋白质重量中靶蛋白的含量或生物学活性（比活常以活力单位数/毫克蛋白质表示），即从蛋白混合物中设法去除不要的杂蛋白和变性的靶蛋白，使靶蛋白的产量达到最高值。2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics71 靶蛋白（target protein）的种类、性质、所存在的体系（病毒颗粒、细胞内含物、细胞外分泌物还是真核细胞的细胞器等）以及分离纯化的目的不同，因此，不可能有一个固定的程序适用于各种蛋白质的分离制备工作。但这并非意味着蛋白质的分离纯化没有一定的规律，实际中，多数分离纯化工作都使用基本的技术手段、涉及相似的技术步骤。2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics72蛋白质分离纯化的一般技术路线 2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics73 技术路线的设计首先要建立一个适当的分析方法，这样才能评估每一步的提纯程度。第二，材料的选择与预处理.第三，蛋白质的粗分离.第四，蛋白质的细分离.第五，靶蛋白的浓缩、冷冻干燥和保存。2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics74 分离纯化的总体原则一是保证靶蛋白结构的完整，防止降解和活性蛋白质的变性；二是尽量满足研究与诊断对靶蛋白纯度的要求。纯化蛋白质总是希望纯度和产率均高，例如纯化某种酶，理想的结果是比活力和总回收率均高，但实际工作中二者不能兼得，通常在科研上希望比活力尽可能高，而牺牲一些回收率，在工业生产和分子诊断中则正相反。2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics75 蛋白质分离纯化的条件蛋白质是一类结构复杂具有生物活性的生物大分子，离开天然的存在体系，其结构与活性变得极不稳定，因此，从生物材料中提纯各种靶蛋白均需要特定的条件。2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics76 1.缓冲液 缓冲液可抗衡蛋白质溶液中pH的改变，选择合适的缓冲液对于维持一定pH下蛋白质的稳定。2.盐、金属离子和螯合剂.3.还原剂 加入它们是用来还原靶蛋白中的二硫键，促进它们的溶解和促进通过二硫键连接的靶蛋白多肽链间的解离.4.去垢剂 为了使靶蛋白更好地溶解且保持其活性，或减少在cDNA原核表达文库的免疫筛选时大量假阳性克隆的出现以及Western印迹中假阳性条带的产生，需要选择合适的去垢剂。2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics77 5.增溶剂 样品溶解的不好会减少分离到的蛋白质数量，同时会造成等电聚焦时某些蛋白质的沉淀，从而减少转移到第二向电泳的蛋白质数量.6.蛋白酶抑制剂（pronase inhibitor）裂解细胞（菌）提取蛋白质的同时，会释放出多种蛋白酶，需要迅速有效地抑制它们的活性方能保持靶蛋白的完整性。下面是常用的蛋白酶抑制剂（表3-1）。2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics78 蛋白酶抑制剂被抑制的蛋白酶 苯甲基磺酰氟（PMSF）丝氨酸蛋白酶（胰凝乳蛋白酶、胰蛋白酶、凝血酶等）巯基蛋白酶、木瓜蛋白酶等苯甲醚（benzamidine）丝氨酸蛋白酶亮抑蛋白酶肽（leupeptin）丝氨酸和巯基蛋白酶 EDTA/EGTA金属蛋白水解酶 胰蛋白酶抑制剂（aprotinin）丝氨酸蛋白酶（血浆酶、血管舒缓素、胰蛋白酶等）2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics79胃蛋白酶抑制剂（pepstatin）酸性蛋白酶（胃蛋白酶、组织蛋白酶D、血管紧张肽原酶）金属蛋白酶组织抑制剂（TIMP-2）间质金属蛋白酶甲苯磺酰赖氨酰氯甲酮（TLCK）胰酶和其它丝氨酸、半胱氨酸蛋白酶甲苯磺酰苯丙氨酰氯甲酮（TPCK）糜蛋白酶和其它许多丝氨酸、半胱氨酸蛋白酶2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics80 7.蛋白质的环境因素 表面效应的影响：蛋白质的稀溶液易使蛋白质变性失活，可以通过在溶液中加入高浓度的其它蛋白如牛血清蛋白（BSA）来防止.温度的影响：大多数蛋白质会由于热变性而失活，故分离纯化时应注意低温操作。储存：将蛋白质以冻干的粉末保存，保存时间会更长。另外，在保存的蛋白质中加入甘油、白蛋白等惰性稳定剂，降低溶液的极性，造成疏水环境，有利于蛋白质的长期稳定。2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics81二、材料的选择及预处理 动物、植物、培养的微生物与细胞及临床分子检验诊断的标本（如血液、分泌物、组织等）均为靶蛋白的主要材料来源。选材要依据研究、诊断的目的及遵循以下原则：一所含靶蛋白量高；二材料易得。2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics82 材料确定后，通常要进行预处理：将不必要的结缔组织、脂肪组织等尽量在接近生命状态下剔除，取出的组织和器官要迅速处理，充分脱血后应即刻使用或在冷库中保存；精制某些易在体内被分解的活性蛋白质、酶或蛋白激素时，一般易用新鲜材料；从培养的细胞或转化子中分离纯化蛋白质时，裂解前应充分洗涤，再离心收集细胞（或菌）。2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics83三、细胞破碎的方法依据作用方式不同，一般将其分为机械法、物理法及化学法三大类（下表）无论采用何种裂解细胞的方法，均要保证靶蛋白结构的完整，防止降解和变性；减少污染，减轻蛋白质纯化的难度2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics84各种组织细胞破碎方法细胞破碎方法 应用 机械法1匀浆法机体软组织2捣碎法动物韧性组织3研磨法细菌、酵母 物理法1超声法细胞混悬液2反复冻融法培养细胞3冷热交替法细菌、病毒4低渗裂解红细胞 化学法1有机溶剂细菌、酵母2去垢剂组织、培养细胞3酶解法细菌、酵母2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics85四、蛋白质的分离纯化方法 蛋白质的分离纯化是依据其溶解性、分子质量大小及形状、电离性质和生物学功能的差异而进行的。分离纯化的方法可分类如下：以溶解度的差异为依据的方法：盐析、分配层析、有机溶剂沉淀、选择性沉淀和结晶等；以分子大小及形状差异为依据的方法：差速离心、区带离心、超滤、透析和凝胶过滤层析等；2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics86以电离性质差异为依据的方法：电泳、离子交换层析等；以生物学功能专一性为依据的方法：亲和层析。2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics87盐析法：盐析法：将硫酸铵、硫酸钠或氯化钠等加入蛋白质溶液，使蛋白质表面电荷被中和以及水化膜被破坏，导致蛋白质沉淀。等电点沉淀法：等电点沉淀法：净电荷为零，分子之间的静电排斥力最小，因而容易聚集形成沉淀。该法适用于在等电点pH稳定的蛋白质。有机溶剂沉淀法：有机溶剂沉淀法：甲醇、乙醇、丙酮等（保持低温），破坏蛋白质的水化层，使蛋白质的溶解度降低而沉淀。2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics88凝胶过滤层析(gel filtration)凝胶过滤层析亦称凝胶色谱、排阻色谱或分子筛，是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法。凝胶色谱的机理是分子筛效应，在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部，而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外；而小分子可以进入凝胶颗粒内部的多孔网状结构，路径长、流速慢，以至最后流出柱外。因此，混合样品如同“过筛”一样，因分子大小的不同得以彼此分开。2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics89凝胶过滤的过程2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics90离子交换层析的原理2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics91密度梯度（区带）离心：常用蔗糖密度梯度2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics92CsCl密度剃度离心2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics93 超速离心 超速离心法(ultracentrifugation)既可以用来分离纯化蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。高速：25000rpm 超速：50000-120000rpm2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics94电 泳蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带电的颗粒，在电场中能向正极或负极移动。这种通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术,称为电泳(elctrophoresis)。电泳(elctrophoresis)2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics95几种重要的蛋白质电泳SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）：常用于蛋白质分 子量的测定。每一个蛋白质分子都因为结合了许多的SDS而带有大量的负电荷，而蛋白质分子原有的电荷则可以忽略。由于所有的蛋白质颗粒都带有大量的负电荷，而且它们的电荷密度也大体相同，因此，Eq值接近一个常数。所以该法主要利用了蛋白质分子量大小不同而分离蛋白质。2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics96等电聚焦电泳（isoelectric focusing，IEF）通过蛋白质等电点的差异而分离蛋白质的电泳方法。pH梯度以两性电解质ampholyte（脂肪族多胺和多羧同系物）在外电场作用下自然形成。2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics97 双向凝胶电泳two-dimensional electrophoresis 2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics98蛋白质分离纯化的常用方法方法原理优点缺点盐析法 破坏水化膜和中和表面电荷操作简便、成本低、对蛋白质和酶有保护作用、重复性好分辨率差、纯化倍数低、蛋白质沉淀中混杂大量盐分有机溶剂沉淀脱水作用和降低介电常数操作简便、分辨较强 对蛋白质或酶有变性作用、成本较高选择性沉淀 等电点、热变性、酸碱变性等沉淀作用选择性较强、方法简便、种类较多 应用范围较窄2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics99高速与超速离心沉降系数或密度差异操作方便、容量大离心机设备昂贵离子交换层析离子基团的交换分辨力高、处理量较大 需酸碱处理树脂、平衡洗脱耗时凝胶过滤层析分子筛的排阻效应分辨力高、不会引起变性凝胶介质昂贵、处理量有限制亲和层析 蛋白质与配体之间有特殊亲和力分辨力很高一种配体只能用于一种靶蛋白，局限性大 2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics100电泳法等电点、分子量、电荷的差异分辨力很高、可连续制备仪器试剂昂贵制备HPLC凝胶过滤、离子交换、反向色谱等分辩力很高、直接制备出纯品制备柱和HPLC仪器昂贵2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics101 从表中，选择几种分离纯化的方法，对每种分离纯化方法进行实验条件优化并对靶蛋白的稳定性给予充分的考虑，就可以逐步地从蛋白质混合物中制备高纯度或高比活的靶蛋白，实现蛋白质分离纯化的目标。2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics102五、Western印迹技术 Western印迹（Western blot）又称为免疫印迹（immunoblotting），是二十世纪70年代末发展起来的蛋白质检测技术。它集中了SDS-PAGE的高分辩率和固相免疫测定的特异、灵敏、无需对靶蛋白进行同位素标记以及固相膜保存时间较长的诸多优点.Western blot的操作程序为：蛋白质样品制备SDS-PAGE分离蛋白质的电转移靶蛋白与抗体（一抗与二抗）的结合显色、分析。2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics103六、蛋白质样品的纯度鉴定 蛋白质的纯度（purity）一般指是否含有其它杂蛋白，而不包括盐、缓冲液离子、SDS等小分子在内，一定条件下的相对均一性。目前常用的鉴定纯度的方法有：有聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、SDS-PAGE、毛细管电泳（CE）、等电聚焦电泳（IFE）及高效液相色谱（HPLC）。此外，还有超速离心法、蛋白质的化学组成和结构分析法。2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics104七、蛋白质的定量和分子量测定 蛋白质的定量，通常是指测定溶液中的蛋白质浓度。测定蛋白质总量的方法很多，最早的经典方法是凯氏定氮法，此法虽有普遍性，但操作繁琐，目前极少使用。应用较为广泛的方法是双缩脲法、福林-酚法和紫外吸收法。2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics105 确定了蛋白质的均一性后，蛋白质的定性以及一级结构的研究，都需要测定蛋白质的分子质量以及亚基和寡聚体的分子质量。测定蛋白质分子质量的方法很多，这此方法都是根据蛋白质的理化性质来测定分子量的，由此测得的分子量称为物理分子质量。与物理分子量相对应的是化学分子量，化学分子量是从化学分析所得的结果，计算而得到的最小分子质量。2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics106蛋白质在组织或细胞中是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有成千上万种不同的蛋白质，蛋白质的分离纯化往往要采取多种方法联合使用，并通过预实验进行条件优化，逐步地制备高纯度或高比活的靶蛋白，实现蛋白质分离纯化的目标 2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics107四、生物小分子的提取纯化2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics1081、溶剂提取法2、水蒸气蒸馏法 3、升华法 4、超临界流体萃取法 5、超声提取法 6、固相萃取法 常用提取方法2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics109分离精制的原理主要是根据：1）物质溶解度差别；2）物质在两相溶剂中的分配比不同；3)物质的吸附性差别；4）物质分子大小差异等进行分离2022-7-11Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics110常用纯化方法1、逆流分配法（CCD）2、液滴逆流色谱法（DCCC）3、高速逆流色谱法（HSCCC）4、气液分配色谱（GC或GLC）5、液-液分配色谱 6、凝胶过滤法 7、超滤法 8、硅胶吸附色谱9、氧化铝吸附色谱 10、大孔吸附树脂吸附色谱 等