限制性内切酶1JunPPT课件

第二章第二章 基因工程中常用的工具酶基因工程中常用的工具酶基因工程的基因工程的基本流程基本流程TOOLS FOR GENE CLONINGSCISSORS:RESTRICTION ENZYMES GLUE:DNA LIGASE VEHICLE:PLASMID OR VIRAL VECTORS第二章第二章 基因工程中常用的工具酶基因工程中常用的工具酶第一节第一节 限制性核酸内切酶与限制性核酸内切酶与DNADNA分子的分子的 体外切割体外切割第二节第二节 DNADNA连接酶和连接酶和DNADNA分子的体外连接分子的体外连接第三节第三节 其他工具酶其他工具酶一、限制性内切酶的发现一、限制性内切酶的发现二、限制性内切酶的定义二、限制性内切酶的定义三、限制性内切酶的命名三、限制性内切酶的命名四、限制性内切酶的分类四、限制性内切酶的分类五、五、IIII型限制内切酶的基本特性型限制内切酶的基本特性六、影响酶活性的因素六、影响酶活性的因素七、限制内切酶的用途七、限制内切酶的用途 第一节第一节 限制性核酸内切酶与限制性核酸内切酶与DNADNA分子的体外切割分子的体外切割一、限制性内切酶的发现和一、限制性内切酶的发现和细菌的限制细菌的限制修饰作用修饰作用1、细菌的限制和修饰系统的发现、细菌的限制和修饰系统的发现 1950年代初期，两组科学家几乎同时发现了限制修饰现象，当时称为宿主专一性:1952年，Luria,Humann等：T偶数噬菌体,1953年，Bertani,Weigle等：和P2噬菌体。大量的研究结果证实噬菌体所表现的宿主限制和修饰现象更具普遍性和代表性。E.coli-E.coli-噬菌体的噬菌体的限制修饰模式限制修饰模式 噬菌体在感染某一宿主后，再去感染其它宿主时会受到限制。噬菌体在感染某一宿主后，再去感染其它宿主时会受到限制。仍有少量仍有少量(K)(K)可在可在 E.coli BE.coli B中生存，是因中生存，是因 E.coli BE.coli B对对(K)(K)进行了修饰。进行了修饰。19591959年，瑞士塞尔生物研究中心年，瑞士塞尔生物研究中心ArberArber提出限制一修饰理论：提出限制一修饰理论：核酸内切酶降解细菌外源核酸内切酶降解细菌外源DNA,DNA,修饰酶保护自身修饰酶保护自身DNADNA2.细菌的限制细菌的限制修饰理论的提出修饰理论的提出侵入细菌体内的外源侵入细菌体内的外源DNADNA（非甲基化），能被限制性内切酶识别和（非甲基化），能被限制性内切酶识别和降解，细菌通过这种方式进行自我保护。降解，细菌通过这种方式进行自我保护。n细菌自身的细菌自身的DNADNA可被甲基化酶修饰，可被甲基化酶修饰，DamDam甲基化酶甲基化酶 -在在G GA ATCTC序列的序列的腺嘌呤腺嘌呤N6N6位引入甲基。位引入甲基。DcmDcm甲基化酶甲基化酶 -在在C CC CAGGAGG序列的第序列的第2 2个个胞嘧啶胞嘧啶C5C5位引入甲基。位引入甲基。2.细菌的限制细菌的限制修饰理论修饰理论n细菌自身的细菌自身的DNADNA可被甲基化酶修饰，从而防止限制性内切酶的识可被甲基化酶修饰，从而防止限制性内切酶的识别和水解。别和水解。Werner ArberWerner Arber于于1962-19681962-1968年发现限制与修饰体系，年发现限制与修饰体系，19681968年分离得到年分离得到I I型限制酶型限制酶 EcoB.EcoB.1970 1970 年，年，H.Smith H.Smith 首次从流感嗜血杆菌首次从流感嗜血杆菌 （H.H.influenzaeinfluenzae）中发现并分离到中发现并分离到IIII型限制酶型限制酶 HinHind.d.19711971年，年，D.NathansD.Nathans用用HinHindIIdII绘制了猿猴病毒绘制了猿猴病毒SV40SV40的限制酶谱。的限制酶谱。Arber,SmithArber,Smith和和Nathans Nathans 获得了获得了1978 1978 年年NobelNobel生理学和医学奖。生理学和医学奖。3.限制性核酸限制性核酸内切酶的发现内切酶的发现到到1986 1986 年下半年，发现年下半年，发现 615 615 种限制酶和种限制酶和 98 98 种甲基化酶。种甲基化酶。到到 2006 2006 年年2 2 月，共发现月，共发现 4583 4583 种限制酶种限制酶和甲基化酶，其中限制酶有和甲基化酶，其中限制酶有 3773 3773 种，种，型、型、型和型和型限制酶各有型限制酶各有 68 68、3692 3692、10 10 种。种。3.限制性核酸内切酶的发现限制性核酸内切酶的发现一、限制性内切酶的发现一、限制性内切酶的发现二、限制性内切酶的定义二、限制性内切酶的定义三、限制性内切酶的命名三、限制性内切酶的命名四、限制性内切酶的分类四、限制性内切酶的分类五、五、IIII型限制内切酶的基本特性型限制内切酶的基本特性六、影响酶活性的因素六、影响酶活性的因素七、限制内切酶的用途七、限制内切酶的用途 第一节第一节 限制性核酸内切酶与限制性核酸内切酶与DNADNA分子的体外切割分子的体外切割 限制性内切酶系统中有两个部分组成：限制性内切酶系统中有两个部分组成：1.1.核酸酶核酸酶 2.2.甲基化酶甲基化酶来源：细菌染色体、噬菌体来源：细菌染色体、噬菌体/病毒病毒限制性内切酶不仅受病毒感染的影响，还可随限制性内切酶不仅受病毒感染的影响，还可随DNADNA的连接、的连接、转导或转染而传给其他个体转导或转染而传给其他个体二、限制性核酸内切酶的定义二、限制性核酸内切酶的定义限制性内切酶限制性内切酶 是一组可以特异性地识别是一组可以特异性地识别DNADNA上的某一特定上的某一特定序列，并将之水解的核酸酶。序列，并将之水解的核酸酶。限制性核酸内切酶，是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。n限制酶裂解DNA双链的磷酸二酯键n酶切得到5-P和3-OH一、限制性内切酶的发现一、限制性内切酶的发现二、限制性内切酶的定义二、限制性内切酶的定义三、限制性内切酶的命名三、限制性内切酶的命名四、限制性内切酶的分类四、限制性内切酶的分类五、五、IIII型限制内切酶的基本特性型限制内切酶的基本特性六、影响酶活性的因素六、影响酶活性的因素七、限制内切酶的用途七、限制内切酶的用途 第一节第一节 限制性核酸内切酶与限制性核酸内切酶与DNADNA分子的体外切割分子的体外切割三、限制性核酸内切酶的命名三、限制性核酸内切酶的命名第第1 1个字母大写，表示来源物种属名的第一个字母。个字母大写，表示来源物种属名的第一个字母。第第2 2、3 3个字母小写，表示来源物种种名的前二个字母。个字母小写，表示来源物种种名的前二个字母。如果细菌有不同的血清型，则有第四个字母，小写，且与前如果细菌有不同的血清型，则有第四个字母，小写，且与前3 3个个字母紧紧排在一起。字母紧紧排在一起。HinHind d：H Haemophilus aemophilus ininfluensae fluensae d d当控制宿主的限制、修饰系统的遗传因子位于病毒和质粒上时，当控制宿主的限制、修饰系统的遗传因子位于病毒和质粒上时，需要在名称中标出遗传成分。需要在名称中标出遗传成分。Eco Eco RIRI：E Escherichia scherichia cocoli li R R若从一种细菌中分离出几种不同的酶，则根据发现顺序用罗马若从一种细菌中分离出几种不同的酶，则根据发现顺序用罗马数字表示。数字表示。SacSac I(II)I(II)：S Streptomyces treptomyces acachromagenes hromagenes I()I()一、限制性内切酶的发现一、限制性内切酶的发现二、限制性内切酶的定义二、限制性内切酶的定义三、限制性内切酶的命名三、限制性内切酶的命名四、限制性内切酶的分类四、限制性内切酶的分类五、五、IIII型限制内切酶的基本特性型限制内切酶的基本特性六、影响酶活性的因素六、影响酶活性的因素七、限制内切酶的用途七、限制内切酶的用途 第一节第一节 限制性核酸内切酶与限制性核酸内切酶与DNADNA分子的体外切割分子的体外切割性质性质酶酶酶酶酶酶结构与功能结构与功能三亚基多功能酶三亚基多功能酶单一功能的酶单一功能的酶同型二聚体同型二聚体二亚基双功能的酶二亚基双功能的酶限制与修饰限制与修饰酶蛋白酶蛋白同时同时具有甲具有甲基化作用基化作用酶蛋白酶蛋白不不具有甲基具有甲基化作用化作用酶蛋白酶蛋白同时同时具有甲具有甲基化作用基化作用限制作用的限制作用的辅助因子辅助因子ATP,MgATP,Mg2+2+,SAM,SAM（S-S-腺苷甲硫氨酸）腺苷甲硫氨酸）MgMg2+2+ATP,MgATP,Mg2+2+,SAM,SAM寄主特异性寄主特异性位点序列位点序列特异性特异性,非对称非对称序列序列特异性特异性,旋转对称旋转对称序列序列特异性特异性,非对称非对称序列序列切割位点切割位点在距寄主特异性位在距寄主特异性位点点至少至少1kb1kb的地方的地方位于寄主位于寄主特异性位特异性位点点或或其附近其附近在距寄主在距寄主特异性位特异性位点点3 3 端端2426bp2426bp处处切割方式切割方式随机随机切割切割特异特异切割切割特异特异切割切割甲基化作用甲基化作用位点位点寄主特异性的位点寄主特异性的位点寄主特异性的位点寄主特异性的位点寄主特异性的位点寄主特异性的位点在在DNADNA克隆中克隆中的用途的用途无无十分有用十分有用有用有用四、限制性核酸内切酶的分类及主要特征四、限制性核酸内切酶的分类及主要特征一、限制性内切酶的发现一、限制性内切酶的发现二、限制性内切酶的定义二、限制性内切酶的定义三、限制性内切酶的命名三、限制性内切酶的命名四、限制性内切酶的分类四、限制性内切酶的分类五、五、IIII型限制内切酶的基本特性型限制内切酶的基本特性六、影响酶活性的因素六、影响酶活性的因素七、限制内切酶的用途七、限制内切酶的用途 第一节第一节 限制性核酸内切酶与限制性核酸内切酶与DNADNA分子的体外切割分子的体外切割五、五、II型限制性核酸内切酶的基本特性型限制性核酸内切酶的基本特性 是用途最广、最简单的一种限制性内切酶。是用途最广、最简单的一种限制性内切酶。II II型限制性内切酶的形式多样，从大小上型限制性内切酶的形式多样，从大小上来说，它们可以小到如来说，它们可以小到如PvuPvuII(157II(157个氨基个氨基酸酸)，也可以比，也可以比12501250个氨基酸的个氨基酸的CjeCjeI I更大。更大。在已纯化分类的在已纯化分类的30003000种限制性内切酶中，种限制性内切酶中，已发现了超过已发现了超过250250种的特异识别序列。种的特异识别序列。根据酶的作用特点，II型限制性内切酶分为3类：A.最普遍的是HhaI、HindIII和NotI这样在识别序列中进行切割的酶。有以下4种情况：a)大部分这类酶都以同源二聚体的形式结合到DNA上，因而识别的是对称序列；b)但有极少的酶作为单聚体结合到DNA上，识别非对称序列。c)一些酶识别连续的序列(如EcoRI识别GAATTC)d)而另一些识别不连续的序列(如BglI识别GCCNNNNNGGC)1 1、根据酶作用特点进行的分类、根据酶作用特点进行的分类五、五、II型限制性核酸内切酶的基本特性型限制性核酸内切酶的基本特性B.IIS型酶 另一种比较常见的酶是所谓的IIS型酶，比如FokI和AlwI，它们在识别位点之外切开DNA。这些酶的大小居中，约为400-650个氨基酸左右；它们识别连续的非对称序列，有一个结合识别位点的域和一个专门切割DNA的功能域。一般认为这些酶主要以单体的形式结合到DNA上，但与临近的酶结合成二聚体，协同切开DNA链。因此一些IIS型的酶在切割有多个识别位点的DNA分子时，活性可能更高。C.第三种II型限制性内切酶 第三种II型限制性内切酶(有时也被称为IV型限制性内切酶)是一类较大的、集限制和修饰功能于一体的酶，通常由850-1250个碱基组成，在同一条多肽链上同时具有限制和修饰酶活性。有些酶识别连续序列，并在识别位点的一端切开DNA链；而另一些酶识别不连续的序列(如BcgI：CGANNNNNNTGC)，并在识别位点的两端切开DNA链，产生一小段含识别序列的片段。这些酶的氨基酸序列各不相同，但其结构组成是一致的。他们在N端由一个负责切开DNA的功能域，这个域又与DNA修饰域连接；此外还有一到两个识别特异序列的功能域构成C端，或以独立的亚基形式存在。当这些酶与底物结合时，它们或行使限制性内切酶的功能切开底物，或作为修饰酶将其甲基化。a.a.识别位点与酶切位点高度一识别位点与酶切位点高度一致，具有高度特异性致，具有高度特异性b.b.极为稳定极为稳定c.c.辅酶辅酶:Mg:Mg 2+2+2 2、IIII型限制性内切酶的特点型限制性内切酶的特点五、五、II型限制性核酸内切酶的基本特性型限制性核酸内切酶的基本特性（1 1）限制酶识别序列的长度）限制酶识别序列的长度 限制性内切酶在双链限制性内切酶在双链DNADNA上能够识别的上能够识别的特殊核苷酸序列特殊核苷酸序列被称为被称为识别序列识别序列。识别序列的长度一般为识别序列的长度一般为 4 48 8 个碱基，最个碱基，最常见的为常见的为 6 6 个碱基。个碱基。切割频率理论上为切割频率理论上为 1/41/4n n（n n为识别序列长度），实际上为识别序列长度），实际上与序列有关。与序列有关。3 3、识别序列、识别序列 MboI NGATCN；AvaII GG(A/T)CC BamHI GGATCC：PpuMI PuGG(A/T)CCPy Not I GCGGCCGC；SfiI GGCC N N N N N GGCC CCGGNNNNNCCGG Fok I 5-()9-3 3-()13-5 外侧，产生外侧，产生-端突起端突起五、五、II型限制性核酸内切酶的基本特性型限制性核酸内切酶的基本特性（3 3）限制酶识别序列的结构）限制酶识别序列的结构 限制酶识别序列大多具有回文对称结构限制酶识别序列大多具有回文对称结构 EcoRI 5-G A A T T C-3 3-C T T A A G-5 有些限制酶的识别序列不对称有些限制酶的识别序列不对称 AccBS C C G C T C G G C G A G（2 2）富含）富含GC GC 型酶识别型酶识别回文序列回文序列有些限制酶可识别多种序列有些限制酶可识别多种序列 有些限制酶识别的序列呈有些限制酶识别的序列呈间断对称间断对称，对称序列之间含有若干个任意碱基。对称序列之间含有若干个任意碱基。AlwN C A G N N N C T G G T C N N N G A C Acc G T M K A C C A K M T G M=A、CK =G、T（4 4）限制酶切割的位置）限制酶切割的位置 限制酶对限制酶对 DNA DNA 的切割位置大的切割位置大多数在识别序列内部，但也有在多数在识别序列内部，但也有在外部的。外部的。（5 5）限制酶切后产生两个末端，末）限制酶切后产生两个末端，末端结构是端结构是-和和-4 4末端种类末端种类(切割方式切割方式)（1 1）5-5-黏性末端和黏性末端和3-3-黏性末端黏性末端（cohesive end）识别位点为回文对称结构的序列经限制酶切识别位点为回文对称结构的序列经限制酶切割后，产生的末端为黏性末端，这样形成的两个割后，产生的末端为黏性末端，这样形成的两个末端是相同的，也是互补的。末端是相同的，也是互补的。（2 2）平末端（）平末端（Blunt endBlunt end）在回文对称轴上同时切割在回文对称轴上同时切割 DNA DNA 的两条链，则的两条链，则产生平末端。产生平末端。如如 Hae Hae（GGCCGGCC）和）和 EcoEcoR VR V（GATATCGATATC）五、五、II型限制性核酸内切酶的基本特性型限制性核酸内切酶的基本特性粘性末端的意义粘性末端的意义连接方便n不同的DNA双链：只要粘性末端碱基互补就可以连接。这比连接两个平齐末端容易的多。n同一个DNA分子内连接：通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子。5末端标记n凸出的5末端可用DNA多核苷酸激酶进行32P标记。3末端标记n凸出的3端可以通过末端转移酶添加几个多聚核苷酸的尾巴（如AAA或TTT等）造成人工粘性末端。补平成平齐末端n粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐末端。粘性末端的意义粘性末端的意义部部分分常常用用的的限限制制性性内内切切酶酶（3 3）非互补黏性末端）非互补黏性末端(不对称末端不对称末端)当识别序列为非对称序列时，切割的当识别序列为非对称序列时，切割的 DNA DNA 产物的末端是不同的。产物的末端是不同的。BbvCC C T C A G CG G A G T C GC C T C A G CG G A G T C G 能识别简并顺序的，如：能识别简并顺序的，如：AvaAvaI I AvaI 5-CPyCGPuG-3 CCCGGG;CTCGGG;CCCGAG;CTCGAG (1).(1).识别不同，切割不同识别不同，切割不同 eg:BamHI EcoRI -G GATC C-A GATCT-C CTAG G-T CTAG A-(2).(2).识别不同，切割产生末端相同识别不同，切割产生末端相同(同尾酶同尾酶)eg:BamHI Bg1 -A GATC T -G GATC C -T CTAG A -C CTAG G5.5.识别位点与切割方式之间的关系识别位点与切割方式之间的关系五、五、II型限制性核酸内切酶的基本特性型限制性核酸内切酶的基本特性(3).(3).识别相同，切割不同识别相同，切割不同 eg:SmaI XmaI -CCC GGG-C CCGG -GGG CCC-G GGCC C-(4)4)识别相同，切割相同识别相同，切割相同同工酶同工酶 同裂酶同裂酶 eg:Hpa Msp -CC GG-C*C GG-GG CC-G G CC-同裂酶（同裂酶（isoschizomersisoschizomers）概念概念 用途用途 有一些同裂酶对于切割位点上的甲基化碱基的敏感性有一些同裂酶对于切割位点上的甲基化碱基的敏感性有所差别，所以可以用来研究有所差别，所以可以用来研究DNADNA甲基化作用。甲基化作用。KpnI GGTAC C Asp718 G GTACC SstI CCGC GG SacI CCGC GG 有一些有一些来源不同来源不同的限制性酶识别的是的限制性酶识别的是相同的核苷酸相同的核苷酸靶序列靶序列，这类酶称为同裂酶。，这类酶称为同裂酶。用途用途 如：限制酶如：限制酶HpaHpa和和MspMsp是一对同裂酶，共同的靶是一对同裂酶，共同的靶序列是序列是CCGGCCGG。当其靶序列中含有一个。当其靶序列中含有一个5-5-甲基胞嘧啶（甲基胞嘧啶（CCGGCCGG，*号表示甲基化的碱基），号表示甲基化的碱基），HpaHpa不能够切割它，而不能够切割它，而MspMsp对对于这个核苷酸的甲基化作用的反应则是中性的，它不管于这个核苷酸的甲基化作用的反应则是中性的，它不管C C残残基甲基化与否都能够切割之。基甲基化与否都能够切割之。*现已研究发现，许多动物现已研究发现，许多动物DNADNA中中90%90%以上的甲基，都以上的甲基，都是在序列是在序列CGCG处以处以5-5-甲基胞嘧啶的形式出现。所以，通过比较甲基胞嘧啶的形式出现。所以，通过比较HpaHpa和和MspMsp的的DNADNA消化产物就可以检测出甲基化的存在。消化产物就可以检测出甲基化的存在。同尾酶（同尾酶（isocaudamerisocaudamer）概念概念 常用的限制酶常用的限制酶BamHBamH、BacBac、BglBgl、Sau3ASau3A和和XhoXho就是一组同尾酶，它们切割就是一组同尾酶，它们切割DNADNA后都形成由后都形成由GATC 4GATC 4个核苷酸组成的粘性末端。个核苷酸组成的粘性末端。举例举例 与同裂酶对应的一类限制性酶，它们虽然与同裂酶对应的一类限制性酶，它们虽然来源来源各异各异，识别的，识别的靶序列也各不相同靶序列也各不相同，但都产生出，但都产生出相同的相同的粘性末端粘性末端，这类酶称为同尾酶。，这类酶称为同尾酶。BamH I 5 5 .G.G G A T C C .3G A T C C .3 3 3 .C C T A G.C C T A G G .5G .5 Bgl II5 5 .A.A G A T C T .3G A T C T .3 3 3 .T C T A G.T C T A G A.5A.5 Sau3A5 5 .G A T C .3G A T C .3 3 3 .C T A G.C T A G .5 .5 用途用途 由于同尾酶切割由于同尾酶切割DNADNA后产生的是粘性末端，后产生的是粘性末端，因此，可以通过粘性末端之间的互补作用而彼因此，可以通过粘性末端之间的互补作用而彼此连接起来，这在基因克隆实验中是很有用处此连接起来，这在基因克隆实验中是很有用处的。的。由由一对同尾酶一对同尾酶分别产生的分别产生的粘性末端粘性末端共价结合共价结合形成的形成的位点位点，特称为，特称为杂种位点（杂种位点（hybrid sitehybrid site）n 同尾酶的粘性末端互相结合后，形成的新位同尾酶的粘性末端互相结合后，形成的新位点，不能再被原来的酶所识别。点，不能再被原来的酶所识别。5-G 3-CCTAG GATCT-3 A-5 BamH IBgl 5-GGATCT-3 3-CCTAGA-5 BamH IBgl Sau 3A同尾酶的粘性末端结合形成的同尾酶的粘性末端结合形成的新位点不能再被原来的酶识别新位点不能再被原来的酶识别BamH I G GATCCBgl II A GATCTMbo I,Sau3A I N GATCN6、酶切位点在、酶切位点在DNA上出现的频率上出现的频率1.II型限制性内切酶的酶切位点在DNA上出现的频率受DNA的长度、识别位点的长度以及GC含量的影响。2.当GC：AT1：14bp的识别位点：1/44256 bp如：HaeIII GGCC6bp的识别位点：1/464096 bp因此当一个酶的识别位点为6bp时，在DNA上每4000bp才会出现一次。五、五、II型限制性核酸内切酶的基本特性型限制性核酸内切酶的基本特性 另外一些不常见的酶识别位点相对较长，在DNA链上出现频率也相对较低。如FseI GGCCGGCC，出现频率为1/48。实际上由于不同生物体的DNA碱基含量不同，酶的识别位点的分布和频率也不同。大肠杆菌基因组中AT含量较丰富，所以富含AT的识别序列(如DraI：TTTAAA；PshBI：ATTATT；SspI：AATTAA)较为频繁的出现；链霉菌基因组因GC含量高，相应的富含GC碱基对的识别序列(NaeI：GCCGGC；SmaI：CCCGGG-；SacII：CCGCGG)较常见。真核生物中，DNA中的CG:GC=1:3，这也影响酶切位点的出现频率。7 7五、五、II型限制性核酸内切酶的基本特性型限制性核酸内切酶的基本特性8、对寡核苷酸的活性、对寡核苷酸的活性 尽管是双链、有识别位点，但因为太短，尽管是双链、有识别位点，但因为太短，酶不能与酶不能与DNA有效结合，所以不能切割。有效结合，所以不能切割。当当2个酶切位点距离非常近的时候，它们个酶切位点距离非常近的时候，它们之间由于竞争结合位点，所以也会相互之间由于竞争结合位点，所以也会相互干扰。干扰。五、五、II型限制性核酸内切酶的基本特性型限制性核酸内切酶的基本特性9.9.其它特异性的内切酶及其用途其它特异性的内切酶及其用途1.1.末端酶（末端酶（terminase terminase）：）：5-GGGCGGCGACCTN-3 N-5，出现的频率约，出现的频率约412 分子量为分子量为 117,000=1 A（74,000）+2 Nul（21,000）2.Omega2.Omega核酸酶（核酸酶（I-SceII-SceI）：）：由内含子编码，用于由内含子编码，用于rRNArRNA的剪切，出现的频率约的剪切，出现的频率约4 418 18=6.9 X 10=6.9 X 101010 bp bp，其识别顺序为其识别顺序为 5-TAGGGATAACAGGGTAAT-3 TATT 3.I-PpoI3.I-PpoI：来自于来自于Physarum polycephalumPhysarum polycephalum 识别序列：识别序列：CTCTCTTAA GGTAGC AATT4.4.用途用途:遗传标记，遗传标记，构建载体构建载体五、五、II型限制性核酸内切酶的基本特性型限制性核酸内切酶的基本特性一、限制性内切酶的发现一、限制性内切酶的发现二、限制性内切酶的定义二、限制性内切酶的定义三、限制性内切酶的命名三、限制性内切酶的命名四、限制性内切酶的分类四、限制性内切酶的分类五、五、IIII型限制内切酶的基本特性型限制内切酶的基本特性六、影响限制性内切酶活性的因素六、影响限制性内切酶活性的因素七、限制内切酶的用途七、限制内切酶的用途 第一节第一节 限制性核酸内切酶与限制性核酸内切酶与DNADNA分子的体外切割分子的体外切割型限制性内切酶的反应条件型限制性内切酶的反应条件五、影响限制性内切酶活性的因素五、影响限制性内切酶活性的因素 酶的纯度酶的纯度 DNADNA样品的纯度样品的纯度 DNADNA的甲基化程度的甲基化程度 酶切反应的温度和时间酶切反应的温度和时间 DNADNA分子的结构分子的结构 限制性内切核酸酶的反应缓冲液限制性内切核酸酶的反应缓冲液六、影响限制性内切酶活性的因素六、影响限制性内切酶活性的因素高质量的限制性核酸内切酶，要求高质量的限制性核酸内切酶，要求:不存在其他核酸内切酶或外切酶的污染不存在其他核酸内切酶或外切酶的污染;长时间酶解不出现识别顺序特异性的下降长时间酶解不出现识别顺序特异性的下降;酶解的酶解的DNADNA片段连接后能重新被识别和切割等片段连接后能重新被识别和切割等.酶的纯度酶的纯度1.DNA1.DNA制剂中可能抑制限制性核酸内切酶活性的物制剂中可能抑制限制性核酸内切酶活性的物质质:蛋白质、酚、氯仿、酒精蛋白质、酚、氯仿、酒精 乙二胺四乙酸（乙二胺四乙酸（EDTAEDTA）十二烷基硫酸钠（十二烷基硫酸钠（SDSSDS）高浓度的盐离子等高浓度的盐离子等 DNADNA样品的纯度样品的纯度 2.2.提高限制性内切核酸酶对提高限制性内切核酸酶对低浓低纯度低浓低纯度DNADNA制剂反应效率的方法制剂反应效率的方法 纯化纯化DNADNA；增加核酸内切酶的用量，平均每微克底增加核酸内切酶的用量，平均每微克底 物物DNADNA可高达可高达1010单位甚至更多些；单位甚至更多些；扩大酶催化反应的体积，以使潜在的抑扩大酶催化反应的体积，以使潜在的抑 制因素被响应地稀释；制因素被响应地稀释；延长酶催化反应的保温时间。延长酶催化反应的保温时间。DNADNA的甲基化的甲基化 1.1.原核生物的限制原核生物的限制-修饰系统的组成成分是：修饰系统的组成成分是：甲基化酶：对自身甲基化酶：对自身DNADNA起修饰作用，从而使限起修饰作用，从而使限 制性内切核酸酶不能识别，保护自制性内切核酸酶不能识别，保护自 身身DNADNA免受降解。免受降解。限制性内切核酸酶：破坏入侵的外源限制性内切核酸酶：破坏入侵的外源DNADNA，防御异源遗传防御异源遗传信息进入体内。信息进入体内。因此，甲基化作用直接影响限制性内切核酸酶的活性因此，甲基化作用直接影响限制性内切核酸酶的活性 大多数大肠杆菌菌株中含有DamDam甲基化酶和DcmDcm甲基化酶，前者可以在GATCGATC序列中腺嘌呤N-6N-6位上引入甲基，后者在CCA/TGCCCA/TGC序列的第一个胞嘧啶C-5C-5位置上引入甲基。部分限制性内切酶对甲基化的DNADNA不能切割，如FbaFbaI I和MboMboI I等。而要解除这种限制修饰作用通常有两种方法：选用上述酶的同功酶，如Sau3ASau3AI I，DNADNA识别切割位点与MboMboI I相同；但不受甲基化影响；DNADNA的甲基化的甲基化 解除限制修饰作用的方法：利用甲基化酶缺失的受体细胞进行DNADNA的制备，如E.coli JM110E.coli JM110和链霉菌等，前者DamDam和DcmDcm甲基化酶已敲除，而后者细胞内本就没有甲基化酶，从这些细胞中抽提的DNADNA就能被上述酶切割。DNADNA的甲基化的甲基化 酶切反应的温度酶切反应的温度 DNADNA酶切反应的温度是影响限制性内切核酶切反应的温度是影响限制性内切核酸酶活性的另一个重要因素。不同的核酸内切酸酶活性的另一个重要因素。不同的核酸内切酶，具有不同的最适温度，而且彼此之间有很酶，具有不同的最适温度，而且彼此之间有很大的变动范围。大的变动范围。但是大多数限制性核酸内切酶的标准但是大多数限制性核酸内切酶的标准反反应温度都是应温度都是3737。酶酶反应温度（反应温度（）ApaApaBanBanBstEBstEMaeMaeMaeMaeMaeMaeSmaSmaTaqTaq30305050606045455050555525256565部分限制性内切核酸酶的最适反应温度部分限制性内切核酸酶的最适反应温度 DNADNA分子结构分子结构 DNA DNA分子的不同的构型对限制性内切分子的不同的构型对限制性内切核酸酶的活性也有很大的影响。核酸酶的活性也有很大的影响。某些核酸内切酶切割某些核酸内切酶切割超螺旋超螺旋的质粒的质粒DNADNA或病或病 毒毒DNADNA所需要的所需要的酶量酶量，要比消化，要比消化线性线性DNADNA高高 出许多倍，最高的可达出许多倍，最高的可达2020倍倍。DNADNA末端长度对限制酶切割的影响末端长度对限制酶切割的影响:限制酶切割限制酶切割 DNA DNA 时对识别序列两端的时对识别序列两端的非识别序列有长度的要求，也就是说在非识别序列有长度的要求，也就是说在识识别序列两端必须有一定数量的核苷酸别序列两端必须有一定数量的核苷酸，否，否则限制酶将难以发挥切割活性。则限制酶将难以发挥切割活性。DNADNA分子结构分子结构近末端的切割：近末端的切割：eg:AccI Geg:AccI GGTCGACGTCGACC C 切不动切不动 CGCGGTCGACGTCGACCGCG 切不动切不动 CCGCCGGTCGACGTCGACCGG CGG 切不动切不动 eg:EcoRI Geg:EcoRI GGAATTCGAATTCC CCGCGGAATTCGAATTCCGCG 2 2小时内小时内90%90%完全酶切完全酶切 eg:PmeI eg:PmeI GTTTAAACGTTTAAAC2020小时不能切小时不能切 G GGTTTAAACGTTTAAACC 20C 20小时，小时，25%25%切开切开 GGGGGTTTAAACGTTTAAACCC 20CC 20小时，小时，50%50%切开切开 AGCTTTAGCTTTGTTTAAACGTTTAAACGGCGGCCGG 20GGCGGCCGG 20小时，小时，90%90%切开切开位点偏爱（位点偏爱（Site preferenceSite preference）某些限制酶对不同位置的同一个识别序列某些限制酶对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率的现象称作表现出不同的切割效率的现象称作位点偏爱位点偏爱。噬菌体 DNA全长48,502bp，有5个EcoR酶切位点。切割时并非在 5 个位点随机进行，靠近右端的位点比分子中间的位点切割快 10 倍。DNADNA分子结构分子结构一般来说，一种限制性内切核酸酶对其不同识别一般来说，一种限制性内切核酸酶对其不同识别位点切割速率的差别最多不会超过位点切割速率的差别最多不会超过1010倍倍。造成位点偏爱现象的原因造成位点偏爱现象的原因 限制酶在切割限制酶在切割DNADNA之前需要同时与两个识之前需要同时与两个识别位点作用；别位点作用；限制酶对要求作用的限制酶对要求作用的DNADNA序列有两个明显序列有两个明显不同的结合位点，其中一个是为不同的结合位点，其中一个是为DNADNA切割切割时激活另一个的变构位点。时激活另一个的变构位点。DNADNA分子结构分子结构 限制性核酸内切酶的反应缓冲液限制性核酸内切酶的反应缓冲液1.1.缓冲液的主要成分缓冲液的主要成分Tris-ClTris-Cl：使反应混合物的使反应混合物的pHpH恒定在酶活性所要恒定在酶活性所要 求的求的最佳数值最佳数值范围内。对绝大数限制范围内。对绝大数限制 酶来说，酶来说，最佳最佳pH=7.4pH=7.4。MgClMgCl2 2：保证酶活性的保证酶活性的正常正常发挥。发挥。NaCl NaCl 或或 KClKCl：同上。同上。-巯基乙醇：巯基乙醇：防止限制酶的氧化，保持酶的稳定性防止限制酶的氧化，保持酶的稳定性 （但也可能有利于潜在污染杂质的稳定（但也可能有利于潜在污染杂质的稳定 性）。性）。牛血清白蛋白（牛血清白蛋白（BSABSA）：对某些限制酶是必需的，它：对某些限制酶是必需的，它 是一种中性蛋白，可防止酶在低浓度是一种中性蛋白，可防止酶在低浓度 蛋白质溶液中变性。蛋白质溶液中变性。限制性核酸内切酶的反应缓冲液限制性核酸内切酶的反应缓冲液1.1.缓冲液的主要成分缓冲液的主要成分2.2.缓冲液的分类缓冲液的分类 不同酶对缓冲液的离子强度要求不同，不同酶对缓冲液的离子强度要求不同，据此缓冲液可分为如下三种：据此缓冲液可分为如下三种：低盐缓冲液（低盐缓冲液（L L）：10 mmol/L NaCl10 mmol/L NaCl 中盐缓冲液（中盐缓冲液（M M）：50 mmol/L NaCl50 mmol/L NaCl 高盐缓冲液（高盐缓冲液（H H）：100 mmol/L NaCl100 mmol/L NaCl 限制性核酸内切酶的反应缓冲液限制性核酸内切酶的反应缓冲液 限制性核酸内切酶的反应缓冲液限制性核酸内切酶的反应缓冲液3.3.限制性内切核酸酶的多酶联合酶解限制性内切核酸酶的多酶联合酶解对盐浓度要求相同的酶，原则上可同时酶切对盐浓度要求相同的酶，原则上可同时酶切对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法：对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法：低盐酶先切，然后补加低盐酶先切，然后补加NaClNaCl，再用高盐酶切，再用高盐酶切 一种酶先切，然后用乙醇沉淀酶解产物，再重一种酶先切，然后用乙醇沉淀酶解产物，再重悬于另一种缓冲液中用另一种酶切。悬于另一种缓冲液中用另一种酶切。使用适合所有限制酶的通用缓冲液，如使用适合所有限制酶的通用缓冲液，如KGBKGB（谷氨酸钾缓冲液）（谷氨酸钾缓冲液）限制性核酸内切酶的反应缓冲液限制性核酸内切酶的反应缓冲液3.3.限制性内切核酸酶的多酶联合酶解限制性内切核酸酶的多酶联合酶解 限制性核酸内切酶的反应缓冲液限制性核酸内切酶的反应缓冲液4.4.星号活性（星号活性（star actvitystar actvity）限制性内切核酸酶的识别位点是在特定的消化条限制性内切核酸酶的识别位点是在特定的消化条件下测定的，当件下测定的，当条件改变条件改变时，有些酶的时，有些酶的识别位点识别位点 也随也随之之改变改变，可能切割一些与特异识别序列相，可能切割一些与特异识别序列相类似类似的序列，的序列，这种现象称为这种现象称为星号活性星号活性。概念概念实际上星号活性是限制性内切酶的一般性质，任何实际上星号活性是限制性内切酶的一般性质，任何一种限制酶在极端非标准条件下都能切割非典型位点。一种限制酶在极端非标准条件下都能切割非典型位点。限制性核酸内切酶的反应缓冲液限制性核酸内切酶的反应缓冲液4.4.星号活性（星号活性（star actvitystar actvity）概念（以概念（以EcoREcoR为例）为例）EcoREcoR在正常条件下识别并切割在正常条件下识别并切割GAATTCGAATTC，但在，但在甘油甘油浓度浓度超过超过5%5%（V/VV/V）时，也可）时，也可切割切割NAATTNNAATTN（其中（其中N=AN=A、T T、C C、G G），用），用 EcoREcoR*表示。表示。限制性核酸内切酶的反应缓冲液限制性核酸内切酶的反应缓冲液4.4.星号活性（星号活性（star actvitystar actvity）诱发星号活性产生的常见原因诱发星号活性产生的常见原因o 甘油浓度高（甘油浓度高（5%5%）o 限制酶过量（限制酶过量（100U/100U/l l）o 离子强度低（离子强度低（25mM8.08.0）o 反应体系含反应体系含DMSODMSO、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺、二甲基甲酰胺等有机溶剂二甲基甲酰胺等有机溶剂o MgMg+被其它二价阳离子如被其它二价阳离子如 MnMn+、CuCu+、CoCo+或或 ZnZn+代替代替具有星反应的限制性内切酶与条件具有星反应的限制性内切酶与条件限制酶诱发星活性的条件限制酶诱发星活性的条件a a识别序列识别序列AvaAvaI 1,2,4I 1,2,4BamBamHI 1-5,8 G GATCN,G PuATCCHI 1-5,8 G GATCN,G PuATCCBstBstI 2,4I 2,4BsuBsuI 2,4,6I 2,4,6EcoEcoRI 1,2,4-6 N AATTNRI 1,2,4-6 N AATTNHaeHae 2,4 2,4HhaHhaI 2,4,7I 2,4,7HinHind 6d 6HpaHpaI 1,2,4I 1,2,4PstPstI 1,2,4,7I 1,2,4,7PvuPvu 2,4 2,4SalSalI 1,2,4,7I 1,2,4,7ScaScaI 4-6,8 I 4-6,8 SstSst 2,4 2,4XbaXbaI 2,4,7I 2,4,7a.1a.1：亚乙二醇：亚乙二醇(45%)(45%)；2:2:甘油甘油(12%)(12%)；3 3：乙醇：乙醇(12%)(12%)；4 4：高酶：高酶/DNA/DNA比比(25U/g)(25U/g)；5：Mn+代替代替Mg+；6:pH8.5;7:二甲基亚砜二甲基亚砜(8%);8:无无NaCl。抑制星星活性的措施抑制星星活性的措施 o 减少酶的用量（可避免过分酶切）减少酶的用量（可避免过分酶切）o 减少甘油浓度减少甘油浓度o 保证反应体系中无有机溶剂或乙醇保证反应体系中无有机溶剂或乙醇o 提高离子强度到提高离子强度到 100100150mM 150mM（但不（但不能抑制酶活性）能抑制酶活性）o 降低反应降低反应 pH pH 至至 pH7.0 pH7.0 o 保证使用保证使用 MgMg+作为二价阳离子作为二价阳离子一、限制性内切酶的发现一、限制性内切酶的发现二、限制性内切酶的定义二、限制性内切酶的定义三、限制性内切酶的命名三、限制性内切酶的命名四、限制性内切酶的分类四、限制性内切酶的分类五、五、IIII型限制内切酶的基本特性型限制内切酶的基本特性六、影响酶活性的因素六、影响酶活性的因素七、限制内切酶的用途七、限制内切酶的用途 第一节第一节 限制性核酸内切酶与限制性核酸内切酶与DNADNA分子的体外切割分子的体外切割 DNADNA重组重组 突变分析（突变分析（RFLPRFLP分析）分析）限制酶（物理）图谱绘制限制酶（物理）图谱绘制 限制酶的部分酶切与完全酶切限制酶的部分酶切与完全酶切七、限制内切酶的用途七、限制内切酶的用途限制性内切酶酶切图谱限制性内切酶酶切图谱(Restriction mapping)1.1.限制酶对限制酶对DNADNA的酶切方法的酶切方法完全酶切/消化n对DNA上所有的识别位点都被酶切开。应用有限。部分酶切/消化nDNA上只有部分酶切位点被切开。n部分酶切的方法：缩短保温时间、降低反应温度、减少酶的用量。完全酶切完全酶切n如EcoR I（GAATTC）的 4个位点都被切开。12 341234部分酶切部分酶切n4个EcoR I位点中，仅酶切2个位点。12 34142.2.限制性内切酶图谱限制性内切酶图谱定义nDNA上某些限制性内切酶酶切位点的图谱，可作为DNA片段的特殊标记。也称DNA物理图谱。3.3.限制酶酶切图谱的分析限制酶酶切图谱的分析EcoR1NotIEcoRINotI2.0 kb3.0 kb1.0 kbEcoRINotIEcoRI/NotI3.0kb6.0 kb2.0 kb3.0 kb5.0 kb4.0 kb1.0 kb4.4.酶切产物的检测酶切产物的检测琼脂糖凝胶电泳法nDNA经内切酶酶切，然后在琼脂糖凝胶电泳分析。适合小分子DNA分析。Southern Blot法nDNA酶切后，电泳分离。后变性后转移到尼龙膜或硝酸纤维膜，然后与同位素标记的探针杂交，最后做放射自显影，检测多态性条带。TOOLS FOR GENE CLONINGSCISSORS:RESTRICTION ENZYMES GLUE:DNA LIGASE VEHICLE:PLASMID OR VIRAL VECTORSn限制酶裂解DNA双链的磷酸二酯键n酶切得到5-P和3-OH性质性质酶酶酶酶酶酶结构与功能结构与功能三亚基多功能酶三亚基多功能酶单一功能的酶单一功能的酶同型二聚体同型二聚体二亚基双功能的酶二亚基双功能的酶限制与修饰限制与修饰酶蛋白酶蛋白同时同时具有甲具有甲基化作用基化作用酶蛋白酶蛋白不不具有甲基具有甲基化作用化作用酶蛋白酶蛋白同时同时具有甲具有甲基化作用基化作用限制作用的限制作用的辅助因子辅助因子ATP,MgATP,Mg2+2+,SAM,SAM（S-S-腺苷甲硫氨酸）腺苷甲硫氨酸）MgMg2+2+ATP,MgATP,Mg2+2+,SAM,SAM寄主特异性寄主特异性位点序列位点序列特异性特异性,非对称非对称序列序列特异性特异性,旋转对称旋转对称序列序列特异性特异性,非对称非对称序列序列切割位点切割位点在距寄主特异性位在距寄主特异性位点点至少至少1kb1kb的地方的地方位于寄主位于寄主特异性位特异性位点点或或其附近其附近在距寄主在距寄主特异性位特异性位点点3 3 端端2426bp2426bp处处切割方式切割方式随机随机切割切割特异特异切割切割特异特异切割切割甲基化作用甲基化作用位点位点寄主特异性的位点寄主特异性的位点寄主特异性的位点寄主特异性的位点寄主特异性的位点寄主特异性的位点在在DNADNA克隆中克隆中的用途的用途无无十分有用十分有用有用有用四、限制性核酸内切酶的分类及主要特征四、限制性核酸内切酶的分类及主要特征根据酶的作用特点，II型限制性内切酶分为3类：A.最普遍的是HhaI、HindIII和NotI这样在识别序列中进行切割的酶。有以下4种情况：a)大部分这类酶都以同源二聚体的形式结合到DNA上，因而识别的是对称序列；b)但有极少的酶作为单聚体结合到DNA上，识别非对称序列。c)一些酶识别连续的序列(如EcoRI识别GAATTC)d)而另一些识别不连续的序列(如BglI识别GCCNNNNNGGC)1 1、根据酶作用特点进行的分类、根据酶作用特点进行的分类五、五、II型限制性核酸内切酶的基本特性型限制性核酸内切酶的基本特性4 4末端种类末端种类(切割方式切割方式)（1 1）5-5-黏性末端和黏性末端和3-3-黏性末端黏性末端（cohesive end）识别位点为回文对称结构的序列经限制酶切识别位点为回文对称结构的序列经限制酶切割后，产生的末端为黏性末端，这样形成的两个割后，产生的末端为黏性末端，这样形成的两个末端是相同的，也是互补的。末端是相同的，也是互补的。（2 2）平末端（）平末端（Blunt endBlunt end）在回文对称轴上同时切割在回文对称轴上同时切割 DNA DNA 的两条链，则的两条链，则产生平末端。产生平末端。如如 Hae Hae（GGCCGGCC）和）和 EcoEcoR VR V（GATATCGATATC）五、五、II型限制性核酸内切酶的基本特性型限制性核酸内切酶的基本特性粘性末端的意义粘性末端的意义连接方便n不同的DNA双链：只要粘性末端碱基互补就可以连接。这比连接两个平齐末端容易的多。n同一个DNA分子内连接：通过两个相同的粘性末端可以连接成环形分子。（3 3）非互补黏性末端）非互补黏性末端(不对称末端不对称末端)当识别序列为非对称序列时，切割的当识别序列为非对称序列时，切割的 DNA DNA 产物的末端是不同的。产物的末端是不同的。BbvCC C T C A G CG G A G T C GC C T C A G CG G A G T C G