沉淀聚合法制备槲皮素分子印迹聚合物及其分子识别性能研究

南昌航空大学学士论文毕业设计（论文） 题 目：沉淀聚合法制备槲皮素分子印迹聚合物 及其分子识别性能研究 学 院： 环境与化学工程学院专业名称： 应用化学班级学号： xxxx学生姓名： xxx指导教师： xxx1毕业设计（论文）任务书I、毕业设计(论文)题目：沉淀聚合法制备槲皮素分子印迹聚合物及其分子识别性能研究II、毕 业设计(论文)使用的原始资料(数据)及设计技术要求：1.查阅二十篇以上参考文献（核心不少于五篇），翻译外文资料不少于3000字。2.完成相关外文翻译和论文开题报告。3.实验设计科学、合理可行，实验研究考察因素全面、数据充分。4.对影响槲皮素MIP性能的相关的影响因素进行研究，改进槲皮素MIP的制备方法5.考察槲皮素MIP在固相萃取中及实际样品中的应用。6.论文的撰写必须符合学校规定要求。III、毕 业设计(论文)工作内容及完成时间：1.查找相关的外文资料并选择翻译 2011.12.21至2012.1.12.查阅资料并撰写开题报告 2012.1.2至2012.3.143.调查、研究、实验或撰写论文（设计） 2012.3.15至2012.6.54.论文（设计）定稿 2012.6.6至2012.6.115.主审教师评定论文（设计） 2012.6.12至2012.6.186.学生论文（设计）答辩 2012.6.20左右 、主 要参考资料：1 OMahony J, Molinelli A, Nolan K, Smyth M.R, Mizaikoff B. Anatomy of a successful imprint:Analysing the recognition mechanisms of a molecularly imprinted polymer for quercetinJ. Biosensorsand Bioelectronics, 2006, 21:13831392.2 Pauling L. A Theory of the Structure and Process of Formation of AantibodiesJ. Am. Chem. Soc., 1940, 62(10):2643-2657.3 Dickey F H. The Preparation of Specific AdsorbentsJ. Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 1949, 35:227-2294 颜流水, 井晶, 黄智敏, 温振东, 刘风涛. 槲皮素分子印迹聚合物的制备及固相萃取性能研究J.分析试验室, 2006, 25(5): 97-100.220-221.5 姜忠义, 吴洪编著.分子印迹技术M.第一版.北京:化学化工出版社. 2003.1.1721 环境与化学工程 学院 应用化学 专业类 xxxx 班学生（签名）： 日期： 自 xxxx 年 xx 月 xx 日至 xxxx 年 x 月 xx 日指导教师（签名）： 助理指导教师(并指出所负责的部分)： 系（室）主任（签名）：学士学位论文原创性声明本人声明，所呈交的论文是本人在导师的指导下独立完成的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含法律意义上已属于他人的任何形式的研究成果,也不包含本人已用于其他学位申请的论文或成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式表明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。作者签名： 日期：学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权南昌航空大学可以将本论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 作者签名： 日期：导师签名： 日期：沉淀聚合法制备槲皮素分子印迹聚合物及其分子识别性能研究 学生姓名：xxx 班级：xxxx 老师姓名：xxx摘要：以槲皮素(Quercetin)为模板分子，丙烯酰胺(AM)和4-乙烯基吡啶(4-VP)为双功能单体，三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(TRIM)为交联剂，采用沉淀聚合法制备槲皮素分子印迹聚合物(MIPs)并对其性能进行了考察。实验考察了致孔剂的体积、功能单体种类以及功能单体比例等因素对槲皮素MIPs吸附容量和选择性的影响。实验结果表明：以40ml致孔剂、1:1AM/4-VP混合功能单体采用沉淀聚合法制备的MIPs吸附容量达到6.93 mol/g，是传统本体聚合法制备的MIPs吸附量的3.08倍,并且此法制备的MIPs相比本体聚合法具有更好的特异性识别能力和分离能力，分离因子达到4.33；本文还将制备的MIPs用作固相萃取(SPE)吸附剂，优化了固相萃取的实验条件并采用SPE的方式对实际油茶壳样品中的槲皮素进行分离富集，试验结果表明用MIPs固相萃取处理后的油茶壳提取液中槲皮素的含量能达到83%，说明了槲皮素分子印迹固相萃取对实际油茶壳样品中槲皮素具有较好的分离、纯化效果。关键词：槲皮素 分子印迹聚合物 分子识别 沉淀聚合 指导老师签名：31chitosan - carbon nanotube modified electrode detection of resorcinolStudent name:Li Zhangmin Class:070212Supervisor:Huang ZhiminAbstract：Carbon nanotubes(CNTs) have special electrocatalytic effect on some organic pollutants due to the properties of excellent adsorption capability, great specific surface and good electronic conductivity. In this thesis, using high molecular weight chitosan as the carbon nanotubes surface modifier, through the water-soluble carbodiimide(DEC) Initiation Condensation reaction by dehydration between the carboxyl carbon nanotubes surface carboxy(-COOH) and Chitosan molecules of amino(-NH3),to achieve the purpose that in the carboxyl multi-walled carbon nanotubes surface Chemical graft fixed chitosan. Will the multi-walled carbon nanotubes have ultrasonic dispersing in N，N-dimethyl formamide(DMF), using micro adding sample appliance solution dropping in the glassy carbon electrode surface, Dry as a resorcinol sensor. Using cyclic voltammetry research resorcinol in the modified electrode electrochemical behavior, The paper also discussed the amount of carbon nanotubes, pH value, support electrolyte and sweep speed and other conditions that the electrochemical signals to the influence of resorcinol. Finally choose the PBS pH=6.24 for support electrolyte solution, zhe scanning rate is 50mV/s，10L Chitosan/carbon nanotubes modified quantity as the optimal conditions to detection different concentrations of resorcinolby cyclic voltammetry (CV).Zhe rusult wo gain a related coefficient R=0.9968 linear equation, measured the electrode detection limit for 0.3. so the modified electrodes has high sensitivity and selectivity of resorcinol.Keyword: chitosan-carbon nanotube resorcinol glassy carbon electrode cyclic voltammetry Signature of Supervisor目 录1 前言11.1分子印迹技术11.1.1分子印迹的发展历程11.1.2分子印迹聚合物的原理11.1.3分子印迹聚合物制备过程21.1.4分子印迹聚合物制备方法41.1.5分子印迹聚合物的应用61.2槲皮素简介91.3 课题研究的意义102 实验内容112.1仪器与试剂112.2槲皮素MIPs和非印迹聚合物（NIPs）的制备122.3槲皮素MIPs和NIPs性能测试132.3.1 槲皮素MIPs和NIPs吸附容量实验132.3.2 槲皮素MIPs和NIPs吸附选择性实验132.4用高效液相色谱对槲皮素的定量测定实验132.5槲皮素MIPs的固相萃取实验142.5.1 槲皮素MIPs固相萃取柱的制备142.5.2 槲皮素MIPs固相萃取柱的选择性实验142.6 槲皮素MIPs的再生识别能力测试142.7槲皮素MIPs对油茶壳提取样品的应用实验143 结果与讨论143.1槲皮素MIPs制备方法的比较143.2槲皮素MIPs功能单体的选择163.2.1功能单体种类对槲皮素MIPs吸附效果的影响163.2.2功能单体（AM）浓度对槲皮素MIPs的影响183.3致孔剂的用量对吸附效果的影响183.4槲皮素MIPs和NIPs性能测试结果193.4.1槲皮素MIPs和NIPs的静态吸附实验及Freumdlich分析193.4.2槲皮素MIPs和NIPs的吸附选择性实验结果213.5槲皮素MIPs在固相萃取中的应用结果223.5.1固相萃取条件优化223.5.2槲皮素MIPs固相萃取柱的选择性实验结果233.6 槲皮素MIPs的再生识别能力结果243.7槲皮素MIPs在油茶壳实际样品中的应用结果254 结论26参考文献28致 谢311前言1.1分子印迹技术1.1.1分子印迹的发展历程分子印迹技术1的基本思想起源于20世纪40年代诺贝尔奖获得者Pauling2在研究抗体和抗原相互作用时，提出的生物体内抗体抗原、酶底物相互作用的“钥匙”原理。尽管后来“克隆选择”理论否定了这一理论。在1949年，Dickey等3又在硅胶中实现染料的印迹过程，这被后人认为是分子印迹技术的萌芽。在1972年，德国的G.Wulff 4课题组首次报道了用共价键法制备分子印迹聚合物，使分子印迹技术的研究产生突破性进展。特别是在1993年Mosbach等5在Nature上发表了关于茶碱分子印迹聚合物的报道后，分子印迹技术得到了广泛研究和迅猛发展。1997年还成立了国际分子印迹协会(SMI)。目前，全世界有包括瑞典、日本、德国、美国、中国、土耳其等在内的50多个国家、300个以上的学术机构和企事业团体在从事分子印迹聚合物的研究及其相关工作。据Mosbach K6的报道，截止1998年底，公开发表有关MIP的论文超过500篇，如果加上1999年估计的150篇，到1999年底估计总共超过650篇。分子印迹技术之所以受到广泛的关注，主要是因为它具有三大显著特点：构效预定性、特异性和广泛实用性。此外，基于分子印迹技术合成的分子印迹聚合物具有亲和能力强、选择性高、稳定性好、再生识别能力强、制备成本低和抗恶劣环境能力强等优点。因此，分子印迹聚合物广泛地应用于手性固定相分离7、固相萃取8-9、膜分离10-11、仿生传感器12及药物控释13等领域中。1.1.2分子印迹聚合物的原理分子印迹技术是指为获得在空间和结合位点上与某一模板分子完全匹配的聚合物的制备技术。此原理如图1所示。该技术是通过以下方法来实现的：(1) 在致孔剂中目标分子与功能单体通过共价作用或非共价作用形成复合物；(2) 加入交联剂，在目标分子-功能单体复合物周围发生聚合反应，形成机械性能的高分子聚合物；(3) 洗脱除去目标分子。通过一定的物理或化学方法除去目标分子这样就在聚合物中留下一个与目标分子在空间结构上完全匹配的空腔。 由于聚合物的印迹空腔对目标分子有印迹功能，分子印迹聚合物对目标分子的亲和力大大增强，表现突出分子识别的能力。分子印迹聚合物依靠形状、大小和化学功能团的分布对目标分子进行识别，类似于“锁”与“钥匙”的关系，具有特异选择性。图1：分子印迹聚合物的合成过程的原理示意图1.1.3分子印迹聚合物制备过程（1）模板分子的选择在整个印迹过程中，模板分子的选择是至关重要的一步，因为它决定着其官能团与功能单体的相互作用，从而对分子印迹聚合物的识别性能有重要影响。同时模板分子与功能单体之间的作用类型决定了印迹方法的选择。理想的模板分子需要至少含有一个能与功能单体相互作用的合适官能团，并具备一定的空间构型，即有良好的印迹效果。然而，在实际应用中，并非所有化合物都能直接用做模板分子。模板的结构和化学性质决定着所合成的印迹方法。通常，模板分子应该具有与功能单体发生相互作用的合适功能基团，以保证相互之间形成稳定的复合物。在印迹过程中选择模板分子应满足如下三方面的要求：(A) 模板分子不影响交联剂的聚合也就是没有聚合的官能团；(B) 模板分子的官能团不会抑制和延缓引发剂产生自由基的过程；(C) 模板分子在热引发或光引发条件下具有一定的化学稳定性。（2）功能单体的选择功能单体的选择主要由印迹分子决定，它首先必须与印迹聚合物成键，且在反应过程中它与交联剂分子处于合适的位置才能使印迹分子恰好镶嵌于其中。另外还应根据模板分子的性质以及功能单体与模板分子作用力大小来合理选择。常用的功能单体有一下几类：（A） 酸性单体丙烯酸、甲基丙烯酸、4-乙烯基苯甲酸、丙烯酰胺基-（2-甲基）-丙磺酸、对-乙烯基苯甲酸等。（B） 碱性单体4-乙烯基吡啶、2-乙烯基吡啶、1-乙烯咪唑、4-（5）-乙烯咪唑、N,N-二甲基-乙氨基-甲基丙烯酸酯等。（C） 中性单体丙烯酰胺、2-羟基乙基-甲基丙烯酸酯等。（3）交联剂的选择在印迹过程中，交联剂的主要作用是用来固定功能单体与模板分子的结合，为保证特定空间构型的良好维持，使生成的分子印迹聚合物具有一定的刚性和形成稳定的印迹位点一般需要控制较高的交联度（通常高达80%）。因此交联剂单体很大程度上决定着分子印迹聚合物的疏水/亲水性，影响着分子印迹聚合物基体形态及其机械稳定性。当交联在聚合物的比例比较低时，聚合物的机械性能会下降，印迹空腔很容易受到破坏并且会有大量非特异性空腔产生，当交联剂的比例比较高时，聚合物的聚合程度会变得非常高，其空腔非常致密，导致传质阻力比较大，模板分子被包埋较深，吸附容量和速度会大大地下降。常用的交联剂有二乙烯基苯（DVB）、二甲基丙烯酸乙二醇酯（EGDMA）、三丙烯酸季戊四醇酯、三甲氧基丙烷三甲基丙烯酸酯（TRIM）、季戊四醇四甲基丙烯酸酯、N, N-二甲基二丙烯酰胺等。（4）溶剂（致孔剂）的选择溶剂（致孔剂）的选择在模板分子溶解度允许的情况下，尽量选择极性低，对氢键影响弱的溶剂。如甲苯、二甲苯、氯仿、二氯甲烷等，因为在非共价键作用中，极性溶剂对常用的离子作用、氢键作用影响比较大。为满足模板分子溶解度的要求，也可以选择乙腈、N,N-二甲基甲酰胺、四氢呋喃、丙酮、乙酸乙酯甚至甲醇、乙醇及醇和水的混合液做溶剂。在分子印迹聚合反应中，如果溶剂量过大则会造成聚合物空间结构比较疏松，机械性能差等，影响其吸附性能和重复使用次数。如果溶剂量过小则会造成聚合物交联程度比较高，印迹空腔比较致密和后处理比较繁琐等缺点。另外聚合物的形态也受溶剂的影响，溶剂使聚合物溶胀导致结合部位的三维结构的变化。通常识别溶剂最好与聚合用溶剂一致，以避免任何溶胀问题。（5）引发剂及引发方式的选择目前，分子印迹聚合物的制备都是由自由基引发聚合的，常用的引发方式有光照和加热等。由于低温下单体与印迹分子能形成更为有序和稳定的聚合物，因此在低温下合成的分子印迹聚合物具有比较好的吸附性能。常用的引发剂有偶氮二异丁腈或偶氮二异庚腈。此外，最近报道用微波辅助手段进行热引发聚合，所制备的聚合物与传统加热引发制备的聚合物相比，二次成核率更低，聚合物的尺寸分布更小和更均匀，非特异性更低和重复使用次数更多，从而提高了对目标分子的吸附容量和选择性。（6）模板分子的去除采用萃取等手段将占据在结合位点上的印迹聚合物模板分子洗脱下来。通常采用乙腈、水、甲醇-乙酸（或三氯乙酸）、乙腈-乙酸等高极性溶剂反复洗涤分子印迹聚合物，以彻底出去模板分子。洗涤过程通常非常缓慢，需要耗费大量的溶剂。可使用索氏提取器进行连续回流和萃取。寻求一种快捷、彻底的洗涤方法对于简化分子印迹聚合物的制备过程非常重要。（7）后处理在适宜温度下对印迹分子聚合物进行真空干燥和研磨等成形加工处理。1.1.4分子印迹聚合物制备方法分子印迹聚合物制备方法主要有两方面的要求，一是对材料的性能加以改善（如提高交换容量、提高材料韧性），以适应大规模生产和应用的需求；另一方面是在水溶液体系中进行分子印迹，以解决对水溶性分子，特别是生物大分子的印迹问题，扩大分子印迹技术的应用领域。在设计分子印迹聚合物的制备方案时需要综合分析研究的对象和目的，选择最佳的制备方案。迄今为止，分子印迹聚合物的制备方法主要有以下几种。(1) 本体聚合本体聚合是制备分子印迹聚合物最常用的方法之一，是将模板分子、功能单体、交联剂以及溶剂按照一定的比例混合，采用光引发或热引发的方式聚合制得块状聚合物，然后经粉碎、研磨、用有机试剂反复沉降和过筛等处理获得适当大小的颗粒，洗脱除去模板分子。本体聚合方法的优点：此方法合成条件容易控制，实验装置简单，制备的印迹聚合物对目标分子选择识别性好，是分子印迹技术中最成熟的方法。本体聚合方法的缺点：产物后处理过程需要粉碎、研磨、用有机试剂反复沉降和过筛繁琐步骤，费时费力，筛分过程易造成产物损失，产率较低；制备的印迹聚合物颗粒形状大小不规则且分散性较差；模板分子包埋过深不易洗脱。因此，在实际应用中受到了限制。(2) 原位聚合原位聚合是指将预聚合混合物溶液注入至所用的分析介质上如色谱柱、毛细管中直接聚合，形成棒状连续的或膜状分子印迹聚合物，去除模板分子后可以直接用作色谱柱固定相或识别敏感材料，它省去了本体聚合需要粉碎筛选等过程，聚合物的溶胀程度也相应减小。原位聚合法的缺点：聚合反应程度不易控制，且采用该法制备的分子印迹聚合物色谱柱大多存在柱效低、模板分子难洗脱等问题。(3) 悬浮聚合悬浮聚合是将溶有功能单体、交联剂和引发剂的有机相和溶有分散剂的水相混合，经机械搅拌使其形成悬浊液，反应就在悬浊液中每一个小液滴里进行，制得粒径分布比较均匀的印迹聚合物微球。印迹聚合物微球的粒径可以通过调节有机相与水相的体积比以及搅拌速度进行控制。采用该方法制备的微米级微球适合做色谱柱填料可以避免粉状填料存在的峰形不对称和拖尾现象，所以该技术被广泛应用于色谱柱填料的工业生产。此外，这种方法制备的分子印迹聚合物的形貌是球形，与传统的块状聚合物相比具有更大的比表面积。悬浮聚合法的缺点：水溶性功能单体与交联剂间的无规共聚很难进行，且水溶性模板分子会在水相中损失，因此很难用水相悬浮聚合制备分子印迹聚合物。(4) 乳液聚合乳液聚合是将模板分子、功能单体、交联剂溶于有机溶剂，然后将此溶液加入溶有一定量乳化剂的水中，搅拌使其乳化，加入引发剂交联聚合后就可得到粒径较为均匀的球形聚合物。该法得到的印迹聚合物微球的粒径通常为纳米级，因此该分子印迹微球的比表面大，吸附能力强，常用于金属离子和蛋白质的印迹聚合物制备。乳液聚合法的缺点：由于乳液聚合制备的分子印迹聚合物粒径较小，抗压能力差。因此，在实际应用受到了限制。(5) 表面印迹聚合 表面印迹聚合法也称为基质修饰法，是指以表面经过化学改性的硅胶和金属氧化物等为载体，将模板分子和功能单体在溶剂中聚合形成的复合物接枝到载体的表面，形成一层薄薄的分子印迹聚合物的方法。这种方法解决了传统方法制备的印迹聚合物对模板分子包埋过深而洗脱不完全的问题，并提高了印迹效率和吸附速率。由于结合位点存在于聚合物的表面，目标分子易于接近，从而大大缩短了吸附平衡的时间。表面印迹聚合法的缺点：吸附容量较小。(6) 沉淀聚合沉淀聚合与本体聚合类似，区别只是需用大量的合成溶剂，它是目前能够直接制备得到分子印迹聚合物微球的最简便和有效的方法之一，可解决本体聚合法中粉碎、过筛等繁杂步骤、耗时及其最终产量较低的缺点。同时，由于该方法不需要在反应体系中加入任何稳定剂，从而制备得到的聚合物微球表面洁净，可避免部分难以除去的稳定剂或表面活性剂对模板分子的非特异性吸附。沉淀聚合法的缺点：对溶剂要求比较高，离子尺寸大小不宜控制。1.1.5分子印迹聚合物的应用 与常规和传统的分离或分析介质相比，基于分子识别的分子印迹聚合物的突出特点是对被分离物或分析物具有高度的选择性。同时分子印迹聚合物具有良好的物理化学稳定性，能够耐受高温、高压、酸碱、有机溶剂等。容易保存，制备简单，易于实现工业化生产。因而，在色谱分析分离、固相萃取、传感器、模拟酶催化、药物分析等方面得到了日益广泛的应用，展现出良好的应用前景。（1）色谱分析和分离分子印迹聚合物主要用于色谱分离分析，制备色谱固定相，以建立固相萃取（SPE）、高效液相色谱（HLPC）或毛细管电泳（CE）分析方法进行手性物质的分离。最早作为亲和色谱固定相，特别是手性异构体分离14。Maria15等用高效液相色谱对氨基酸、缩氨酸以其大生物分子蛋白质进行分离。目前用分子印迹色谱固定相分离的手性化合物有药物及其对映体、氨基酸及其衍生物、短肽及有机酸等。Yin等16用原位聚合的方法成功地制备了分子印迹聚合物微色谱柱，并用这种分子印迹聚合物作为色谱的固定相分离那格列奈及其对应结构体，与传统的本体聚合制备的分子印迹聚合物作为色谱固定相相比，具有更快的传质速率，更好的峰型和更稳定的压力差。（2）固相萃取固相萃取由于具有回收率和富集倍数高，有机溶剂用量少，对环境友好，无相分离操作，易于收集，能处理小体积试样，操作简单，易于实现自动化等优点。目前已成为最常用的样品处理方法之一。传统的固相萃取通常使用疏水性聚合物(C2，C8，C18和St-DVB)、亲水性聚合物(Oasis HLB)、离子交换吸附剂(SAX)和混合模式离子交换吸附剂(PAX，MAX)，虽然对目标物质有比较好的保留能力，由于缺乏选择性，对复杂的环境、生物体系中的样品很难进行分离。分子印迹固相萃取技术有望解决上述问题。这种聚合物具有选择性吸附对特定的目标分子，或者一组结构相类似的物质，因此分子印迹聚合物作为固相萃取的吸附剂对目标分子有很好的富集效果。分子印迹固相萃取的基本原理流程如图2。目前，分子印迹聚合物已经成功地应用许多分析物的检测如抗生素17、霉菌毒素18、三嗪类化合物19、内分泌干扰物20、尿嘧啶21、酰亚胺22、四环素23和苯丙胺药物24。图2：分子印迹固相萃取的基本原理流程图（3）传感器近十几年来，生物传感器以其突出的灵敏度和特异性引起了广泛的关注，使传感器技术的研究不断升温。但是生物传感器多以生物物质如酶、受体、抗体等作为分子识别元件，这些物质往往不易长期保存，且操作稳定性差，使以其为敏感材料制成的传感器面临着长期稳定性、恶劣化学环境耐受性等方面的严重挑战，这在很大程度上限制了生物传感器的应用发展。而分子印迹聚合物有可能弥补生物识别元件的不足，为传感器技术的发展开辟新的途径。与生物元件相比，分子印迹聚合物具有耐高温、高压、酸、碱和有机溶剂、稳定性高、可多次重复使用和抗干扰能力强等优点。通常用分子印迹聚合物作为传感器设备的识别元件固定在传感器与分析物的界面，分析物在识别元件上的识别过程经传感器转变为电讯号再放大。按照转换器的工作原理，分子印迹聚合物作为传感器已经被广泛使用如电化学传感器、光学传感器、压电传感器以及表面等离子共振传感器等。Yang等25在电极表面合成了分子印迹膜通过直接电沉积的方法，并用分子印迹膜作为葡萄糖测定仪的传感器。（4）模拟酶催化催化剂在化工生产中起着至关重要的作用，化学合成反应的发展很大程度上依赖于催化剂的品质。自然界中的酶以其高效、专一、反应条件温和的特点成为一类重要的催化剂，但天然酶提取困难，耐受性差，难以回收和重复使用的缺点严重制约了它的生产和应用。但分子印迹技术的出现及其在模拟抗体方面取得的突破性进展启发人们利用分子印迹技术将识别位点和催化基团引入聚合物内部用以制备模拟酶。与天然酶相比，理想的模拟酶除具备可与之匹敌的高的催化活性和选择性外还具有以下优点。（A）结构的可调控性，即针对不同底物和反应需要设计不同结构的印迹空腔；（B）结构和性能更稳定、耐温、耐酸碱、耐有机溶剂能力更强、适用性更广、寿命更长；（C）材料易得、价格便宜、便于储存和规模化生产。另外通过改变简化活性位点中的官能团，模拟酶还可帮助人们针对整个催化反应历程有更深入的了解。目前分子印迹模拟酶技术制备的模拟酶已经广泛应用于水解反应、脱卤化氢反应、醇醛缩合反应、合成反应、氧化-还原反应、转移反应和异构化反应等。Cheng等26用分子印迹技术合成了酶模拟印迹聚合物用高香草酸作为模板分子，研究了其在水环境中的催化性质，并获得满意的效果。有可能应用于工业的模拟酶催化。1.2槲皮素简介槲皮素（Quercetin）其学名为3,3,4,5,7-五羟基黄酮是一类天然具有多种活性的黄酮类化合物，其化学结构如图3所示槲皮素分子含有羟基，具备了与功能单体形成氢键的条件，但分子中含有五个羟基，造成了它的极性大而不溶于非极性或弱极性溶剂。槲皮素广泛存在于水果、蔬菜、核桃、茶、和多种天然活性产物中，具有抗氧化、抗病毒、抗肿瘤和调节免疫等多种功能。因其有极高的药用价值，国内外的学者都对槲皮素的药理进行了研究。如王艳芳27等的文章中概括了国内外近20年来有关槲皮素的药理研究，综述了槲皮素抗肿瘤，抗炎，抗血小板聚集，扩张冠脉等作用，并从分子生物学角度初步探讨了槲皮素抗病毒的机理。随着研究的深入，还发现更多的中药和食物中含有槲皮素，扩大了槲皮素的来源。如对贯叶连翘，水红花子，油菜花粉28-30等植物进行槲皮素的含量检测，发现它们都含有丰富的槲皮素。图3： 槲皮素的结构虽然槲皮素的来源广泛，但是如何获得纯度较高的槲皮素提取方法还没有一个标准，现行的提取方法中还存在一些技术上的缺陷，分离成本高，选择性分离效率低，在提取的过程中往往还将槲皮素的类似物一并提取出来。解决这些问题的根本就是研究出新的提取分离方法，解决了核心问题也将使得槲皮素的价值能够充分发挥出来。因此，近年来，许多学者开始探索利用分子印迹技术制备槲皮素的分子印迹聚合物并将其制作成分离提取材料如颜流水31等制备了槲皮素的分子印迹聚合物并研究了其固相萃取的性能；刘小育32不仅制备了槲皮素的分子印迹聚合物还用电化学方法对其选择性性能进行了考察得出印迹聚合物比类槲皮素似的分子相比具有较高的选择性；OMahony J33分析了一个已成功的槲皮素分子印迹聚合物的案例，从中解释了槲皮素分子印迹聚合物的制备方法、表征方法及其识别机理。另外还有很多研究如Jianchun Xie等34制备交联印迹的丙烯酰胺（AM-co-EGDMA）固定相，直接在银杏叶中提取槲皮素。随后他们有研究了AM-co-TRIM印迹体系具有更高的柱容量35。1.3 课题研究的意义天然植物中往往存有很多活性物质以及他们的类似化合物，从天然植物中提取分离一种物质时常常会伴随着类似化合物被提取出来的情况。如本实验中从油茶壳中提取槲皮素时往往会伴有芦丁，异鼠李素等类似物。所以本课题以槲皮素为模板分子，应用分子印迹技术制备槲皮素分子印迹聚合物。探讨最佳的制备方法以获得具有选择识别能力的槲皮素分子印迹聚合物。这将更高效地选择性提取分离油茶壳中的槲皮素，同时对提取分离其他活性物质提供了一个参考，对今后高效选择性地提取分离更多活性组分提供一种新的途径。2 实验内容2.1仪器与试剂2.1.1仪器仪器名称型号生产厂家高效液相色谱仪Agilent 1100Agilent 1100紫外-可见分光光度计T6北京普析通用仪器有限公司固相萃取装置12管天津博纳-艾捷尔科技有限公司数控超声波清洗器SK5210LHC上海科导超声仪器有限公司N2SHZ-C型江西省华东特种气体有限公司电子天平 A2104梅特勒-托利多仪器有限公司2.1.2试剂药品名称规格生产厂家槲皮素AR美国Sigma 公司芦丁AR国药集团化学试剂有限公司三羟甲基丙烷三甲基丙烯酸酯(TRIM)AR阿拉丁试剂偶氮二异丁氰(AIBN)AR上海青析化工科技有限公司丙烯酰胺（AM）AR阿拉丁试剂4-乙烯基吡啶(4-VP)AR阿拉丁试剂乙酸AR广东西陇化工有限公司甲醇AR广东西陇化工有限公司乙腈AR上海化工厂2.2槲皮素MIPs和非印迹聚合物（NIPs）的制备在100 mL锥形瓶中加入0.5 mmol槲皮素和5.0 mL甲醇超声溶解，再加入适量AM或4-VP和一定量的乙腈，充分振荡后，于室温下静置12 h, 然后加入8.0 mmol交联剂TRIM和0.02 g引发剂AIBN，超声振荡脱气5 min，并通氮气15 min，密封后置于80水浴中，聚合反应12 h。聚合产物缓慢冷却至室温，抽滤分离得到聚合物沉淀。用200 mL甲醇/乙酸(V :V=9:1)混合溶液索氏提取，除去聚合物中的模板分子及未反应的单体，提取完毕后用超纯水水洗，直至pH为7.0为止。于80 真空干燥箱中干燥24 h，得到MIPs。非印迹聚合物(NIPs)制备方法与MIPs制备方法相同，只是在反应体系中不加入模板分子槲皮素。得到一系列的MIPs和NIPs（如表1）用于后备实验。表1 MIPs和NIPs的组成聚合物槲皮素(mmol)MA(mmol)4-VP(mmol)乙腈(mL)MIP10.51.01.020MIP20.51.01.030MIP30.51.01.040MIP40.51.01.050MIP50.51.01.060MIP50.51.01.070MIP60.502.040MIP70.50.251.7540MIP80.50.671.3340MIP90.51.330.6740MIP100.51.750.2540MIP110.52.0040NIP1-1.01.040其他：TRIM，8.0mmol. AIBN，20mg2.3槲皮素MIPs和NIPs性能测试2.3.1 槲皮素MIPs和NIPs吸附容量实验（1）吸附动力学曲线的制作分别称取0.10 g制备的MIPs和NIPs置于100 mL磨口锥形瓶中，加入10 mL 0.2 mM槲皮素甲醇溶液，于室温下25恒温振荡吸附不同时间，离心分离后取上清夜，用高效液相色谱仪测定上清液中槲皮素的浓度，根据吸附前后溶液浓度的变化，计算出MIPs和NIPs的吸附量。（2）静态吸附等温线的制作分别称取一组等量的MIPs和NIPs 50 mg，置于 10 mL 的离心管中，依次加入 0.02-1.0 mmol/L 的槲皮素甲醇溶液 5.0 mL，置于恒温震荡器中保持25 oC振荡 12 h，根据吸附前后的浓度变化计算出单位质量聚合物的结合量，从而得出MIPs和NIPs对槲皮素的吸附等温线。2.3.2 槲皮素MIPs和NIPs吸附选择性实验分别称取一组等量的MIPs和NIPs 0.10 g放入100 mL锥形瓶中，加入10 mL 0.2 mM槲皮素和芦丁的甲醇混合标准溶液，于25室温下恒温振荡12 h，然后将此混合物转入离心机中,在12000 r/min的转速下离心10 min。测定槲皮素和芦丁的平衡浓度，根据吸附前后溶液浓度的变化计算MIPs对底物的结合量。2.4用高效液相色谱对槲皮素的定量测定实验用Agilent 1100 高效液相色谱仪分离分析经固相萃取后上样液，淋洗液和洗脱液中的槲皮素及其类似物。液相条件为,色谱柱：Hypersil C18柱(5 m,4.6 mm250 mm)；流动相A:乙腈，B:质量分数为0.1的磷酸水溶液；梯度洗脱条件:0-4min,20A;4-10 min,20A60A；柱温:25 ，流速:1.0 mL/min，进样量：20 L，检测波长:280 nm、360 nm双波长检测。2.5槲皮素MIPs的固相萃取实验 2.5.1 槲皮素MIPs固相萃取柱的制备采用湿法装柱，称取槲皮素MIPs 0.3 g，加入5.0 mL甲醇制成浆液，装入容量为5.0mL、直径为8.0 mm的聚丙烯固相萃取空柱中，装填均匀后再用10 mL甲醇冲洗。2.5.2 槲皮素MIPs固相萃取柱的选择性实验配置浓度为0.2 mM的槲皮素芦丁混合标准溶液，移取1.0 mL标准溶液置于固相萃取柱中，上样液收集完后，用一定体积甲醇溶液洗脱，收集淋洗液；最后用一定体积的甲醇/乙酸(V:V =9:1)的溶液洗脱固相萃取柱，并收集洗脱液。上样液、淋洗液和洗脱液分别用氮吹仪浓缩至干，用甲醇定容至1.0 mL，以备测定。2.6 槲皮素MIPs的再生识别能力测试用槲皮素MIPs吸附剂制备的固相萃取柱重复固相萃取实验，将上样液、淋液、洗脱液收集后用高效液相色谱测定其峰面积计算槲皮素的回收率。2.7槲皮素MIPs对油茶壳提取样品的应用实验将油茶壳提取物蒸干后用甲醇定容至10.0mL，移取1.0mL于固相萃取柱中，上样液收集完后，用一定体积甲醇溶液洗脱，收集淋洗液；最后用一定体积的甲醇/乙酸(V:V =9:1)的溶液洗脱固相萃取柱，并收集洗脱液。上样液、淋洗液和洗脱液分别用氮吹仪浓缩至干，用甲醇定容至1.0 mL，以备测定。3结果与讨论3.1槲皮素MIPs制备方法的比较分别采用本体聚合法和沉淀聚合法制得槲皮素MIPs，测定其最大吸附容量及结合槲皮素和芦丁标准样品测得其分离因子如表2所示。取沉淀聚合法制得的槲皮素MIPs做吸附动力学曲线如图4所示。表2不同制备方法制得的槲皮素MIPs比较聚合方法本体聚合沉淀聚合最大吸附容量Q（mol/g）1.606.93分离因子1.844.33平衡时间T（h）92图4：沉淀聚合合成MIPs的吸附动力学曲线考察沉淀聚合法和传统本体聚合法对槲皮素分子的吸附容量和选择性。目前大部分槲皮素印迹聚合物采用本体聚合法制备36-38，采用此聚合方式普遍存在的问题是：MIPs吸附容量低、印迹分子识别速率慢和选择性不高等等。Song等39采用本体聚合制备槲皮素分子印迹聚合物，如表2所示其最大吸附容量为1.60 mol/g，吸附9 h后才基本达到吸附平衡，他们以槲皮素和芦丁进行结合实验，得到其分离因子为1.84；而采用本方法得到槲皮素最大吸附容量为6.93 mol/g，是其吸附容量的3.08倍；其分离因子为4.33，并且在120 min内即能达到吸附平衡；其吸附动力学曲线由图1所示，可以看出：MIPs在前10 min的吸附速率很快，吸附量已经占到总吸附量的82.3。吸附平衡在60 min左右即能达到吸附饱和。与传统本体聚合法相比，沉淀聚合合成的MIPs对模板分子的吸附速率要快得多，这可能是因为：MIPs较快的吸附速率与聚合物颗粒的粒径较小有关，由于沉淀聚合得到的MIPs颗粒粒径小，模板分子传输到MIPs上的传质阻力大大减小，因而识别空穴的时间要短，而表观的总吸附速率也要快得多。3.2槲皮素MIPs功能单体的选择3.2.1功能单体种类对槲皮素MIPs吸附效果的影响采用沉淀聚合法分别用AM，4-VP，AM/4-VP做功能单体制备槲皮素MIPs，将制得的槲皮素MIPs作为吸附剂用槲皮素芦丁混合标准液做固相萃取实验得出其回收率如表3所示。不同功能单体混合比例制备槲皮素MIPs固相萃取实验回收率如表4所示。不同功能单体制备槲皮素MIPs的吸附量对比结果如图5所示。表3 槲皮素和芦丁的回收率（n = 3）吸附剂槲皮素芦丁回收率RSD回收率RSD(%)(%)(%)(%)AM-MIP103.31.520.23.64-VP-MIP61.71.46.92.9AM-4-VP-MIP91.52.110.32.5C1833.83.029.82.4表4不同比例混和功能单体的回收率比例（AM:4-VP）回收率(%)槲皮素（%）芦丁（%）上样淋洗洗脱上样淋洗洗脱1:33.02.864.4080.77.01:207.172.2082.95.81:114.5091.540.959.110.32:110.920.968.216.157.516.43:10.559.039.8098.65.8图5：不同功能单体合成聚合物的吸附量一般来说，印迹酸性的模板分子，适合选用碱性功能单体；印迹碱性的模板分子，则适合选用酸性功能单体。由于槲皮素分子含有多个酚羟基，具有一定的酸性，从理论而言，选择碱性的功能单体会有利于模板分子和功能单体形成稳定的主客体复合物。本实验采用碱性的AM和4-VP做功能单体，考察这两种功能单体对模板分子及其类似物的吸附性和选择性的影响。其结果表明：采用4-VP为功能单体，对模板分子识别效果较AM更强、选择性也更高；其用作固相萃取吸附剂对模板分子槲皮素及其类似物的保留能力也更强，导致难于洗脱。如表3所示，用4-VP做功能单体的吸附剂对槲皮素的回收率仅为61.7%，远小于用AM做功能单体的回收率，达到103.3%；而对类似物芦丁的回则收率远低于AM。究其原因，可能是4-VP和槲皮素之间除了氢键、离子间作用力外，吡啶环的疏水效应和模板分子槲皮素及其类似物间也有相互作用，这几种作用使得4-VP对槲皮素分子的保留强于AM。而采用AM和4-VP混合功能单体对模板分子的选择性和吸附量较高，其固相萃取回收率和特异性选择性明显高于商品化的C18固相萃取柱。图5比较了分别用AM，4-VP，AM/4-VP做功能单体时聚合物的吸附量，发现使用混和功能单体获得的吸附容量最大，达到其吸附容量6.0 mol/g；这可能是因为AM和4-VP都属于碱性功能单体，它们之间具有协同作用，不容易产生自身缔合，从而和槲皮素分子能够较好的形成复合物，并在MIPs中产生更多的、具有特异选择性的活性印迹位点。实验中发现当AM的比例较大时，经过固相萃取后模板分子槲皮素的回收率较低，归因于用AM作功能单体时对模板分子的保留弱；而当4-VP的比例较大时，经固相萃取后模板分子槲皮素的回收率相比AM来说也较低，这是因为用4-VP作功能单体对模板分子的保留太强、难于洗脱所导致的。因此，根据表3和表4的实验结果，合成MIPs时选择1:1比例下的AM和4-VP为1:1的混和功能单体。3.2.2功能单体（AM）浓度对槲皮素MIPs的影响通过固定槲皮素的浓度(0.02 mM)，改变AM的浓度(从a到h分别为：0；0.005；0.01；0.02；0.04；0.05；0.1；0.25 mM)而测得槲皮素分子和功能单体AM预聚合后的紫外光谱图如图6所示。图6：不同AM浓度溶液的紫外吸收光谱图由图可知：随着AM的浓度增大，预聚合后溶液的吸光度也逐渐增大，并且最大吸收波长发生红移，说明AM与槲皮素分子发生了作用。这可能是由于AM是碱性的功能单体，而槲皮素是多酚类的酸性化合物，含有较多的羟基，它们之间具有离子间作用；另外由于它们之间形成的氢键也使得相互之间发生作用，形成复合物。并且由于N原子上的富余电子对槲皮素芳香环的供电子基效应，使得AM最大吸收波长发生红移。3.3致孔剂的用量对吸附效果的影响本课题实验以乙腈做致孔剂，通过改变致孔剂用量考察其对MIPs吸附容量的影响如图7所示。图7：不同溶剂体积合成聚合物的吸附容量由图7对比不同体积得到MIPs的吸附量，发现当乙腈用量为40 mL时，吸附量可以达到较高的水平，因此在聚合反应过程中致孔剂乙腈的加入量为40 mL。其原因可能是随着致孔剂量的减少，反应体系(包括溶剂、单体和其它溶解组分)中的连续相对聚合物链的溶解度增强、聚合物临界链长增加，导致核聚集而成的聚合物粒子数目下降，因而聚合后粒子的粒径减小。3.4槲皮素MIPs和NIPs性能测试结果3.4.1槲皮素MIPs和NIPs的静态吸附实验及Freumdlich分析在浓度范围为0.02-1.0 mmol /L的槲皮素甲醇溶液中，加入等量的MIPs和NIPs做吸附试验，根据吸附前后的浓度变化计算出单位质量聚合物的结合量，从而得出MIPs和NIPs对槲皮素的吸附等温线如图8所示。图8槲皮素在MIPs 和 NIPs 上静态吸附等温曲线 由图8中的曲线可知，随着槲皮素浓度的增大，单位质量MIPs的吸附量也增大，而NIPs在槲皮素初始浓度大于0. 4 mmol /L 时的吸附量已趋于饱和，并且在相同初始浓度下单位质量MIPs 的吸附量远大于在单位质量 NIP s的吸附量，证明了这种沉淀聚合得到的MIPs对槲皮素具有很好的吸附效果效果。这说明在印迹过程中，模板分子在MIPs中选择性键合产生的印迹孔穴及孔穴上的活性结合位点，决定了MIPs 对模板分子的高度亲合力和特异识别性远大于非选择性键合作用。在分子印迹的研究中，常用Freumdlich模型来印迹聚合物的吸附能力强弱，评价分子印迹聚合物的结合特性，Freumdlich模型方程式lg Q = lg +m lg C;式中：Q (mol/g)单位质量聚合吸附分析物的量； C(mol/mL)分析物在溶液中平衡时的浓度； 和m是Freumdlich方程的两个常数40。其中m表示吸附能力的强弱，当m的值在0到1的范围内，说明吸附比较容易进行。经Freumdlich模型拟合的结果如图9所示：MIPs对槲皮素的吸附方程为：lgQ= 0.94323+0.82992 lgC，R=0.9986；而NIPs对槲皮素的吸附方程为：lgQ= 0.73119+0.67589 lgC，R=0.9887；由值可知MIPs比NIPs具有更大的吸附容量，而由m值可以明显得出MIPs的同质的吸附位点的相比NIPs更多。这可能是由于功能单体和模板分子之间存在多种相互作用，使得制备的MIPs对模板分子的特异性吸附更强所导致的。图9槲皮素在MIPs和NIPs吸附的Freumdlich模型曲线3.4.2槲皮素MIPs和NIPs的吸附选择性实验结果在底物浓度为2.0 mmol/L时，用槲皮素和芦丁混合标准液测定MIPs和NIPs的结合分配系数KD(见表5)。表5 MIPs和NIPs对槲皮素和芦丁的分离系数KD和选择性识别因子聚合物KD(mLg-1)槲皮素 芦丁MIPs24.096.833.53NIPs11.2010.221.10聚合物:100.0 mg;C(Initial substrate):0.2 mmolL;V = 10.0 mL;吸附时间:1