南农 生物技术制药第二章基因工程药物

Genentech 公司公司1976年，年，27岁的风险投资人岁的风险投资人Robert Swanson与与University of California的教授的教授Herb Boyer共饮了几杯啤酒，讨论了基因共饮了几杯啤酒，讨论了基因工程技术的商业前景。讨论结束时，他们工程技术的商业前景。讨论结束时，他们决定建立一个公司，并取名为决定建立一个公司，并取名为Genentech（Genetic Engineering Technology）。）。第一个基因工程公司在学术界和商业界第一个基因工程公司在学术界和商业界的满腹怀疑中诞生了！的满腹怀疑中诞生了！Genentech的骄人业绩的骄人业绩1976Genentech创立创立1977首次在微生物里生产了人蛋白生长激素抑制素首次在微生物里生产了人蛋白生长激素抑制素1978克隆了人胰岛素基因克隆了人胰岛素基因1979克隆了人生长激素素基因克隆了人生长激素素基因1980公司上市，募集公司上市，募集$ 35million1982第一个基因重组药（人胰岛素）上市（转让给第一个基因重组药（人胰岛素）上市（转让给Lilly公司）公司）1984第一个第一个VIII因子，转让给因子，转让给Cutter Biological1985第一个自己生产的产品（人生长激素）第一个自己生产的产品（人生长激素）1987生产组织纤溶酶原激活剂（生产组织纤溶酶原激活剂（tPA）1990生产生产interferon 1 1990与瑞士与瑞士Roche医药公司合并（医药公司合并（$ 2.1billion）美国已批准上市的基因工程药物（美国已批准上市的基因工程药物（1997.7）1中国已经批准上市的基因工程药物（中国已经批准上市的基因工程药物（1998.5）一、基因工程与医药卫生一、基因工程与医药卫生1、生产基因工程药品 （1 1）传统的某些药品（如动物激素）生产：）传统的某些药品（如动物激素）生产：控制某种物控制某种物质合成基因质合成基因转基因转基因“工程菌工程菌”基因工基因工程药品程药品基因表基因表达产物达产物基因工程基因工程发酵分离提取从动物组织中提取，生产量小，价格昂贵。（3 3）基因工程生产的药品）基因工程生产的药品重组人生长激素重组人白细胞介素 重组人干扰素 重组人胰岛素发酵罐（2 2）基因工程方法生产药品的方法：）基因工程方法生产药品的方法：13二、基因工程菌大肠杆菌表达系统二、基因工程菌大肠杆菌表达系统一：大肠杆菌表达外源基因的优势一：大肠杆菌表达外源基因的优势二二 大肠杆菌表达载体的基本组成大肠杆菌表达载体的基本组成三三 常用的大肠杆菌表达载体常用的大肠杆菌表达载体四四 真核基因在大肠杆菌中的表达真核基因在大肠杆菌中的表达五五 大肠杆菌表达真核基因存在的问题大肠杆菌表达真核基因存在的问题六六 基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制七七. 人胰岛素的生产方法人胰岛素的生产方法一：大肠杆菌表达外源基因的优势一：大肠杆菌表达外源基因的优势l全基因组测序全基因组测序 , 共有共有4405个开放型阅读框架个开放型阅读框架l基因克隆表达系统成熟基因克隆表达系统成熟l繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定l被美国被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物批准为安全的基因工程受体生物大肠杆菌表达外源基因的劣势大肠杆菌表达外源基因的劣势l缺乏对真核生物蛋白质的复性功能缺乏对真核生物蛋白质的复性功能l缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统l内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白l细胞周质内含有种类繁多的内毒素细胞周质内含有种类繁多的内毒素(endotoxin)periplasmheterogous二二 大肠杆菌表达载体的基本组成大肠杆菌表达载体的基本组成一个良好的大肠杆菌表达载体：一个良好的大肠杆菌表达载体：l有抗菌素抗性基因有抗菌素抗性基因l决定载体拷贝数的复制起点决定载体拷贝数的复制起点 (ori )l供外源基因插入的多克隆位点。供外源基因插入的多克隆位点。l参与控制转录与翻译的必不可少的原件参与控制转录与翻译的必不可少的原件外源基因在原核寄主细胞中表达外源基因在原核寄主细胞中表达 , 它的编码结构它的编码结构必须是连续的必须是连续的 , 不间断的不间断的 , 处于寄主启动子有效处于寄主启动子有效控制下。控制下。1启动子启动子可使外源基因高水平表达的最佳启动子必须具备以下几个可使外源基因高水平表达的最佳启动子必须具备以下几个条件条件1 ) 强启动子，外源基因的蛋白质的表达量占细胞总蛋白的强启动子，外源基因的蛋白质的表达量占细胞总蛋白的10 % - 30 %以上以上2 ) 应能呈现出一种低限的基础转录水平应能呈现出一种低限的基础转录水平3 ) 应该是诱导型的应该是诱导型的 , 能通过简单的方式能通过简单的方式,使用廉价的诱导物使用廉价的诱导物得以诱导。得以诱导。Account forinducibleb: 如果在启动子的上游部位放置一个有效的转录终止如果在启动子的上游部位放置一个有效的转录终止子子 , , 那么由该启动子驱动的克隆基因的转录便会被那么由该启动子驱动的克隆基因的转录便会被限制在最低本底水平。限制在最低本底水平。2 终止子终止子 a : 如果在克隆基因编码区的如果在克隆基因编码区的3 末端之后，接上一个有效的转录终止子，末端之后，接上一个有效的转录终止子，便能够阻止转录通读过位于下游另一个启动子便能够阻止转录通读过位于下游另一个启动子 c: 转录终止子还能增强转录终止子还能增强mRNA分子的稳定性分子的稳定性, 大大提高蛋白质产物水平。大大提高蛋白质产物水平。在构建大肠杆菌表达载体时，通常是添加全部终止密码在构建大肠杆菌表达载体时，通常是添加全部终止密码子子 , 阻止核糖体跳跃阻止核糖体跳跃 (skipping )现象。现象。大肠杆菌格外偏爱使用终止密码子大肠杆菌格外偏爱使用终止密码子UAA, 当其后连上一个当其后连上一个U而形成而形成四联核苷酸的情况下四联核苷酸的情况下 , 转译终止效率便会得到进一步加强。转译终止效率便会得到进一步加强。3转译起始序列转译起始序列mRNA的的5 末端之独特的结构特征末端之独特的结构特征 , 是决定是决定mRNA转译起始效率的主转译起始效率的主要因素。要因素。在构建外源基因的高效表达载体时在构建外源基因的高效表达载体时 , 需认真选择有效的转录起始序列。需认真选择有效的转录起始序列。未鉴定出未鉴定出通用通用有效的转译起始序列的有效的转译起始序列的保守结构保守结构initiation factorconserved sequenceuniversial4、reporter gene其编码产物可被快速测定的功能单元。其编码产物可被快速测定的功能单元。l 追踪某些特定的追踪某些特定的DNA结构结构 (重组质粒重组质粒 )是否已经导入是否已经导入寄主细胞寄主细胞l 同任何一种目的启动子连接同任何一种目的启动子连接 , 其表达活性可作为检其表达活性可作为检测启动子功能的依据。测启动子功能的依据。usage半乳糖苷酶基因半乳糖苷酶基因lacZ 、碱性磷酸酶基因、碱性磷酸酶基因、荧光素酶基因荧光素酶基因 (luciferase )基因、基因、半乳糖激酶基因半乳糖激酶基因(galK )氯霉素抗性氯霉素抗性(乙酰转移酶乙酰转移酶)基因基因 (cat )四环素抗性基因四环素抗性基因 (tetr )alkaline phosphatase三三 常用的大肠杆菌表达载体启动子常用的大肠杆菌表达载体启动子广泛使用的大多数质粒表达载体启动子广泛使用的大多数质粒表达载体启动子l 噬菌体的噬菌体的PL启动子启动子l 大肠杆菌乳糖操纵子大肠杆菌乳糖操纵子lac启动子启动子l 色氨酸操纵子色氨酸操纵子trp启动子启动子l pBR322质粒的质粒的beta内酰胺酶启动子内酰胺酶启动子Lactose Operon图1-1 在大肠杆菌中基因表达的3个重要信号启动子 核糖体结合位点基因终止子DNARNA转录核糖体结合mRNA位点图图1-2 基因转录起始位点上游序列的比较基因转录起始位点上游序列的比较TTGACATATAATPuPy-35区区-30-70正调控区正调控区-20负调控区负调控区+1-10区区GC区区.CAAT区区TATAAA T PuAPy-40-110+1-20-30增强子增强子CCGCCC或或GGGCGG或或GGCCAATCT T A原核原核真核真核图1-3 通过表达载体在大肠杆菌中被表达PRTTPRTPRmRNA蛋白质表达载体外源基因将外源基因插入限制性酶切位点转化大肠杆菌图1-4 杂交基因的构建和融合蛋白的合成P R TP R T插入外源基因ATA TTA正确融合N端C端不正确融合外源基因不被翻译表达ATA TTA GGA GCTGGA GC融合蛋白亲和层析法纯化 化学试剂除去大肠杆菌肽段 图1-5 在大肠杆菌中表达外源基因长遇到的问题翻译转录P R TT转录大肠杆菌不能切除内含子转录提前终止图1-6 真核细胞表达载体常用的4种启动子P半乳糖转录GAL10P甲醇转录乙醇氧化酶基因（a）GAL启动子（b）AOX启动子（c）葡萄糖水解酶启动子（d）纤维二糖水解酶启动子P纤维素转录纤维素二糖水解酶基因P淀粉转录葡萄糖淀粉酶基因木糖不转录四四 真核基因在大肠杆菌中的表达真核基因在大肠杆菌中的表达三种表达部位各有不同的优缺三种表达部位各有不同的优缺点点 / 而且对克隆基因表达产物而且对克隆基因表达产物的制备有很大关系。的制备有很大关系。l 在细胞质中表达在细胞质中表达l 在细胞周质中表达在细胞周质中表达l 以分泌到细胞外的形式表达。以分泌到细胞外的形式表达。1 1 外源基因在大肠杆菌中表达蛋白质位置外源基因在大肠杆菌中表达蛋白质位置 cytoplasmperiplasm1 ) 细胞质中表达细胞质中表达 expressed in cytoplasm包含体是存在于细胞质中的一种由不可溶性蛋白质聚集折叠而成的晶包含体是存在于细胞质中的一种由不可溶性蛋白质聚集折叠而成的晶体结构。体结构。在表达中应尽可能限制包含体产生在表达中应尽可能限制包含体产生, 并促进形成天然三维结构的蛋白并促进形成天然三维结构的蛋白质。质。多采用与分子伴侣共表达的方法多采用与分子伴侣共表达的方法, 可能是增加外源蛋白的可溶性和折可能是增加外源蛋白的可溶性和折叠能力的一种有效途径。叠能力的一种有效途径。insolublechaperon周质周质 : 指大肠杆菌一类指大肠杆菌一类G-菌中，位于内膜和外膜之间的细菌中，位于内膜和外膜之间的细胞结构部分。胞结构部分。 在大肠杆菌中在大肠杆菌中 , 已成功的使用了各种不同类型信号肽已成功的使用了各种不同类型信号肽 ,将细胞质中蛋白的蛋白质转运至周质。将细胞质中蛋白的蛋白质转运至周质。周质中表达外源蛋白质优点周质中表达外源蛋白质优点:A : 周质中蛋白质种类少周质中蛋白质种类少 , 周质中表达的外源蛋白质能够被有效的周质中表达的外源蛋白质能够被有效的浓缩和纯化。浓缩和纯化。b: 周质氧化环境有利于蛋白质按正确的方式折叠周质氧化环境有利于蛋白质按正确的方式折叠c: 在周质中蛋白质降解不广泛。在周质中蛋白质降解不广泛。来自原核、真核的外源基因都成功的在大肠杆菌细胞周质中实现了有来自原核、真核的外源基因都成功的在大肠杆菌细胞周质中实现了有效表达。效表达。2 ) 周质中表达周质中表达 expressed in periplasm3) 分泌表达分泌表达 使在大肠杆菌中表达的外源蛋白质分泌到胞使在大肠杆菌中表达的外源蛋白质分泌到胞外培养基中进行分离纯化外培养基中进行分离纯化 , 这种研究思路称为这种研究思路称为外源蛋白质的分泌表达。外源蛋白质的分泌表达。l目的蛋白稳定性高目的蛋白稳定性高:l目的蛋白易于分离目的蛋白易于分离l目的蛋白末端完整目的蛋白末端完整将外源基因与大肠杆将外源基因与大肠杆菌信号肽编码序列重菌信号肽编码序列重组在一起进行分泌表组在一起进行分泌表达达 , 其其N端的甲硫氨端的甲硫氨酸残基可在信号肽剪酸残基可在信号肽剪切过程中被有效除去切过程中被有效除去这些真核基因在大肠杆菌中表达这些真核基因在大肠杆菌中表达时时 , 蛋白质甲硫氨酸残基往往不蛋白质甲硫氨酸残基往往不能被切除。能被切除。分泌表达优点分泌表达优点 :重组人胰岛素原若分泌到细胞重组人胰岛素原若分泌到细胞周质中周质中 , 其稳定性大约是在细胞其稳定性大约是在细胞质中的质中的10倍倍许多真核生物成熟蛋白许多真核生物成熟蛋白N端不含有端不含有甲硫氨酸残基。甲硫氨酸残基。intactexcise外源真核生物基因很难在大肠杆菌中进外源真核生物基因很难在大肠杆菌中进行分泌型表达行分泌型表达;外源基因分泌表达的表达率通常要比包外源基因分泌表达的表达率通常要比包涵体形式低很多涵体形式低很多分泌表达缺点分泌表达缺点 相对其它生物细胞相对其它生物细胞 , 大肠杆菌蛋白分泌机制不健全。大肠杆菌蛋白分泌机制不健全。目前产业化的异源蛋白分泌型重组目前产业化的异源蛋白分泌型重组大肠杆菌工程菌很少大肠杆菌工程菌很少Perfectsoundl分泌型重组蛋白具有较高比例分泌型重组蛋白具有较高比例正确构象，正确构象，l对蛋白酶不敏感对蛋白酶不敏感蛋白质的分泌机制蛋白质的分泌机制原核细胞周质中有多种分子伴侣原核细胞周质中有多种分子伴侣 ,可阻止分泌蛋白随机折叠可阻止分泌蛋白随机折叠l分泌至细胞周质或培养基中分泌至细胞周质或培养基中l重组蛋白很少形成分子间二硫键重组蛋白很少形成分子间二硫键与包涵体相比与包涵体相比randomSulferinnerouter重组大肠杆菌重组大肠杆菌 -目的蛋白完全分泌目的蛋白完全分泌分泌型目的蛋白表达系统构建分泌型目的蛋白表达系统构建有些有些G- 能将细菌的抗菌蛋白（细菌素）分泌到培养基中能将细菌的抗菌蛋白（细菌素）分泌到培养基中 , 这一过程严这一过程严格依赖于格依赖于细菌素释放蛋白细菌素释放蛋白 , 它激活定位于内膜上的磷酸酯酶它激活定位于内膜上的磷酸酯酶 , 导致细菌导致细菌内外膜的通透性增大。内外膜的通透性增大。将细菌素释放蛋白编码基因克隆将细菌素释放蛋白编码基因克隆在一个合适的质粒上在一个合适的质粒上携带大肠杆菌信号肽编码序列和携带大肠杆菌信号肽编码序列和目的基因的表达质粒目的基因的表达质粒转化转化受体细胞受体细胞完全分泌型受体细胞完全分泌型受体细胞转化转化permeabilitybacteriocin二种类型二种类型 l由报告基因编码序列和另一个基因启动子及其它的调节由报告基因编码序列和另一个基因启动子及其它的调节序列构成。用于研究启动子功能及调控作用分子机理。序列构成。用于研究启动子功能及调控作用分子机理。l由一种异源蛋白质基因编码序列同寄主细胞诱导型启动由一种异源蛋白质基因编码序列同寄主细胞诱导型启动子构成。用于生产新型融和蛋白。子构成。用于生产新型融和蛋白。2 融和蛋白质表达融和蛋白质表达将外源基因与受体菌自身的蛋白质编码基因拼接在一起将外源基因与受体菌自身的蛋白质编码基因拼接在一起 , 并作为一个并作为一个开放型阅读框架进行表达。这种杂合基因表达出的蛋白质称为融合蛋开放型阅读框架进行表达。这种杂合基因表达出的蛋白质称为融合蛋白。白。 2.1 融和基因融和基因attention外源基因应装在受体蛋白编码基因下游外源基因应装在受体蛋白编码基因下游 , 为融合蛋白提供终止密码子。在为融合蛋白提供终止密码子。在某些情况下某些情况下 , 并不需要完整的受体结构基因并不需要完整的受体结构基因2.2 融和蛋白的表达策略融和蛋白的表达策略融合蛋白表达质粒的构建原则融合蛋白表达质粒的构建原则 受体细胞的结构基因能高效表达受体细胞的结构基因能高效表达 , 且其表达产物可以且其表达产物可以通过亲和层析进行特异性简单纯化通过亲和层析进行特异性简单纯化两个结构基因拼接位点处的序列设计十分重要两个结构基因拼接位点处的序列设计十分重要 , 它直接决定融合蛋白的裂它直接决定融合蛋白的裂解。解。两个蛋白编码序列应保持一致的翻译阅读框架两个蛋白编码序列应保持一致的翻译阅读框架在在DNA水平上，人工设计引入的蛋白酶切割位点或化学试水平上，人工设计引入的蛋白酶切割位点或化学试剂特异性断裂位点剂特异性断裂位点 , 可以在体外从纯化的融合蛋白分子中释可以在体外从纯化的融合蛋白分子中释放回收异源蛋白放回收异源蛋白Base onconsistentl使克隆外源基因有效转译使克隆外源基因有效转译 有效转译：取决于核糖体的结合位点有效转译：取决于核糖体的结合位点 , 受到编码区起点核苷酸序列影响。受到编码区起点核苷酸序列影响。l可使蛋白质产物稳定可使蛋白质产物稳定 , 免受寄主胞内酶的降解作用免受寄主胞内酶的降解作用 ,因此可以得到较高的产率。因此可以得到较高的产率。l可能构成一种信号肽指导大肠杆菌蛋白质分配到细胞可能构成一种信号肽指导大肠杆菌蛋白质分配到细胞的正确位置。的正确位置。l能够使用亲和层析技术分离纯化融合蛋白。能够使用亲和层析技术分离纯化融合蛋白。2.3 表达融合蛋白质的优点表达融合蛋白质的优点ribosome3 3 整合型异源蛋白的表达整合型异源蛋白的表达l工程菌在没有选择压力存在下工程菌在没有选择压力存在下 ,可以连可以连续培养而不丢失目的基因表达盒续培养而不丢失目的基因表达盒, 这对以这对以改良物种遗传性状为目的的基因工程特改良物种遗传性状为目的的基因工程特别有意义别有意义3.1 3.1 整合形式表达目的蛋白的特点整合形式表达目的蛋白的特点u目的基因稳定表达目的基因稳定表达 u目的基因表达率低目的基因表达率低l整合型的目的基因随受整合型的目的基因随受体细胞染色体体细胞染色体DNADNA一起复制一起复制, 在大多数情况下相当稳定在大多数情况下相当稳定 单拷贝整合的目的基因表达率受到限制单拷贝整合的目的基因表达率受到限制 , 此时可通过强化表达元件加以此时可通过强化表达元件加以补偿补偿 replicate/ stabilitySpecies/ improvementintensify转位因子依赖型的体内重组转位因子依赖型的体内重组同源序列依赖型的体内重组同源序列依赖型的体内重组3.2 DNA体内重组的基本原理体内重组的基本原理生物细胞内天然存在的一类无复制能力的生物细胞内天然存在的一类无复制能力的DNA可移动因子可移动因子 , 不同生物种群拥有结构不同的转位因子不同生物种群拥有结构不同的转位因子噬菌体噬菌体 G片段片段 (G-Fragment )原核微生物原核微生物 插入顺序插入顺序 (IS ) 真核微生物真核微生物 转座子转座子 (Tn、Ty ) 高等植物高等植物 可移动因子可移动因子 (Ac、Ds ) 高等动物高等动物 跳跃基因跳跃基因 (mobile gene )转位因子转位因子 transposon转位因子依赖型的体内重组转位因子依赖型的体内重组转位因子的结构转位因子的结构transposonpalindromerepressorinversion region整合形式整合形式 同源整合同源整合同源序列依赖型的体内重组同源序列依赖型的体内重组同源整合同源整合一般地说一般地说 , 距离越远、长度越长、同源性越高距离越远、长度越长、同源性越高 , 重组的频率也就越高重组的频率也就越高 , 反之亦然。反之亦然。同源整合同源整合1基因结构存在很大差异。大多数真核基因含有内含子，细菌基因结构存在很大差异。大多数真核基因含有内含子，细菌细胞中没有除去内含子机制；细胞中没有除去内含子机制；五五 大肠杆菌表达真核基因存在的问题大肠杆菌表达真核基因存在的问题2 转录信号不同。真核基因转录的转录信号不同。真核基因转录的mRNA分子不具有结合细菌核糖体所必分子不具有结合细菌核糖体所必须的须的SD序列。细菌序列。细菌RNA聚合酶不能识别真核生物启动子聚合酶不能识别真核生物启动子3 mRNA的分子结构有所差异。绝大多数真核的分子结构有所差异。绝大多数真核mRNA分子的分子的3 末端有末端有poly(A)尾巴尾巴 ，在，在5 末端有一个帽结构。影响末端有一个帽结构。影响mRNA在细菌中的稳定性在细菌中的稳定性及与细菌核糖体相结合的能力，及与细菌核糖体相结合的能力， 阻止正常的转录和转译。阻止正常的转录和转译。4真核生物的蛋白质真核生物的蛋白质 -有些是通过前体分子加工来的。有些是通过前体分子加工来的。在细菌中不存在这种修饰作用。在细菌中不存在这种修饰作用。5细菌的蛋白酶细菌的蛋白酶 -可以识别和降解真核生物的蛋白质产物可以识别和降解真核生物的蛋白质产物l结构不稳定性结构不稳定性重组重组DNA分子上某一区域发生缺失、重排、修饰分子上某一区域发生缺失、重排、修饰 ，导致其表观生物学，导致其表观生物学功能的丧失功能的丧失六六 基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制基因工程菌遗传不稳定性的表现与机制1 工程菌遗传不稳定性表现形式工程菌遗传不稳定性表现形式基因工程菌的遗传不稳定性主要表现在重组质粒的不稳性基因工程菌的遗传不稳定性主要表现在重组质粒的不稳性 , 具有下列两种具有下列两种表现形式表现形式 l分配不稳定性分配不稳定性整个重组整个重组DNA分子从受体细胞中逃逸分子从受体细胞中逃逸segregative instabilitydomainDeletionregionrearrangel受体细胞中的限制修饰系统对外源重组受体细胞中的限制修饰系统对外源重组DNA分子的降解分子的降解2 工程菌遗传不稳定性的产生机制工程菌遗传不稳定性的产生机制l外源基因的高效表达严重干扰受体细胞正常的生长代谢外源基因的高效表达严重干扰受体细胞正常的生长代谢 能量、物质的匮乏和外源基因表达产物的毒性诱导受体细胞产生应激反能量、物质的匮乏和外源基因表达产物的毒性诱导受体细胞产生应激反应应 ， 关闭合成途径关闭合成途径 ，启动降解，启动降解l重组质粒在受体细胞分裂时的不均匀分配重组质粒在受体细胞分裂时的不均匀分配 是重组质粒逃逸的基本原因是重组质粒逃逸的基本原因l受体细胞中内源性的转座元件促进重组分子的缺失重排受体细胞中内源性的转座元件促进重组分子的缺失重排Deletionl以构建稳定性高质粒以构建稳定性高质粒: 将将R1质粒上的质粒上的parB基因引入表达型载体中基因引入表达型载体中: 其表达产物可以选择性其表达产物可以选择性地杀死由于分配不均匀所产生的无质粒细胞地杀死由于分配不均匀所产生的无质粒细胞3 改进载体、受体系统改进载体、受体系统l正确设置载体上的多克隆位点正确设置载体上的多克隆位点: 禁止禁止DNA片段插在稳定区内片段插在稳定区内l将受体细胞的致死性基因安装在载体上，并构建条件致将受体细胞的致死性基因安装在载体上，并构建条件致 死性的相应受体系统死性的相应受体系统 。 eg:大肠杆菌的大肠杆菌的ssb基因基因 (DNA单链结合蛋白编码基因单链结合蛋白编码基因)根据载体上的抗药性标记根据载体上的抗药性标记 , 向培养系统中添加相应的抗生素向培养系统中添加相应的抗生素(药物和食品生产时禁止使用抗生素药物和食品生产时禁止使用抗生素)4 施加选择压力施加选择压力根据载体上的营养缺陷型标记根据载体上的营养缺陷型标记 , 向培养系统中添加相应的向培养系统中添加相应的营养组份营养组份(培养基复杂培养基复杂 , 成本较高成本较高)correspondl使用可控型启动子控制目的基因定时表达及表达程度使用可控型启动子控制目的基因定时表达及表达程度5 控制目的基因过量表达控制目的基因过量表达l使用可控型复制子控制质粒的定时增殖或降低质粒的拷贝数使用可控型复制子控制质粒的定时增殖或降低质粒的拷贝数(优化基因工程菌的培养工艺优化基因工程菌的培养工艺)l培养基组成培养基组成 : 限制培养基比丰富培养基更有利于稳定限制培养基比丰富培养基更有利于稳定l培养温度培养温度 : 较低培养温度有利于重组质粒的稳定较低培养温度有利于重组质粒的稳定replicon1982年年 , 美国美国Ely LiLi公司首先使用重组大肠杆菌生产人胰岛素公司首先使用重组大肠杆菌生产人胰岛素 , 成为世成为世界上第一个上市的基因工程药物。界上第一个上市的基因工程药物。1987年年 , Novo公司公司 , 成为世界上第一成为世界上第一个上市的基因工程药物。个上市的基因工程药物。1987年年 , Novo公司又推出了利用重组酵母菌生公司又推出了利用重组酵母菌生产人胰岛素的新工艺。产人胰岛素的新工艺。七七. 人胰岛素的生产方法人胰岛素的生产方法基因工程法生产人胰岛素基因工程法生产人胰岛素l体外胰岛素受体结合性能、淋巴细胞和成纤维细胞的应答能力、降血糖体外胰岛素受体结合性能、淋巴细胞和成纤维细胞的应答能力、降血糖作用、血浆药代动力学等指标上均与天然胰岛素没有任何区别作用、血浆药代动力学等指标上均与天然胰岛素没有任何区别l具有无免疫原性、注射吸收迅速。充分展示了基因工程在生物医药领域具有无免疫原性、注射吸收迅速。充分展示了基因工程在生物医药领域中的巨大潜力。中的巨大潜力。potentialimmunogenicSHSHSHSHC C C C COO_SHSH N C CS.S.Pre-pro-insulinSSSSC C C C COO_SSC CS-SPro-insulin NSSSSC C C C COO_C CS SS-SinsulinN基因工程菌的构建战略：化学合成A链和B链的编码序列表达重组人胰岛素的大肠杆菌工程菌的构建A链和B链分别表达法1synthesis由于由于A链和链和B链上共存在六个半胱氨酸残基，体外二硫键的正确链上共存在六个半胱氨酸残基，体外二硫键的正确配对率较低配对率较低 , 通常只有通常只有10% - 20%.采用这条工艺路线生产正确配对率较低采用这条工艺路线生产正确配对率较低 , 采用这条工艺路线生产的重组人胰岛素每克成本高达采用这条工艺路线生产的重组人胰岛素每克成本高达100美元以美元以上。上。A链和链和B链分别表达法链分别表达法生产技术评价生产技术评价为了进一步降低生产成本为了进一步降低生产成本 , 美国美国Ely LiLi公司随后又建立了第二公司随后又建立了第二条生产重组人胰岛素的工艺路线条生产重组人胰岛素的工艺路线基因工程菌的构建战略基因工程菌的构建战略 人胰岛素原表达法人胰岛素原表达法proinsulin表达产物后处理路线 B链中第22位上的Arg和第29位上的Lys , 由于良好折叠的原因 , 对胰蛋白酶不敏感在人胰岛素原表达工艺中在人胰岛素原表达工艺中 , 由于由于C肽的存在肽的存在 , 胰岛素原能形成良好的空间构象胰岛素原能形成良好的空间构象 , 三对二硫键的正确配对率也相应提高三对二硫键的正确配对率也相应提高 , 折叠率高达折叠率高达80%以上。以上。生产技术的评价生产技术的评价目前美国目前美国Ely LiLi公司采用此工艺年产十几吨的重组人胰岛素。公司采用此工艺年产十几吨的重组人胰岛素。虽然这条工艺路线不比虽然这条工艺路线不比AB链分别表达法更为简捷链分别表达法更为简捷 , 而且还要使用两种高纯而且还要使用两种高纯度的酶制剂度的酶制剂 , 但理想的折叠率在很大程度上弥补了工艺繁琐的缺陷但理想的折叠率在很大程度上弥补了工艺繁琐的缺陷 , 使得每使得每克最终产品的成本仅克最终产品的成本仅50美元。美元。 一一种能促进融合蛋白分泌的工程菌构建策略是将胰岛素或胰岛种能促进融合蛋白分泌的工程菌构建策略是将胰岛素或胰岛素原编码序列与素原编码序列与beta-內酰胺酶基因拼接內酰胺酶基因拼接 , beta-內酰胺酶通常能被內酰胺酶通常能被大肠杆菌分泌到胞外。大肠杆菌分泌到胞外。 获得的工程菌同时具备了稳定高效表达可分泌型融合蛋白的优获得的工程菌同时具备了稳定高效表达可分泌型融合蛋白的优良特性良特性 , 为胰岛素的后续分离纯化工序减轻了负担。为胰岛素的后续分离纯化工序减轻了负担。分泌型重组人胰岛素表达法分泌型重组人胰岛素表达法上述三种重组大肠杆菌的构建路线均采用胰岛素或胰岛素原编码序上述三种重组大肠杆菌的构建路线均采用胰岛素或胰岛素原编码序列与大肠杆菌列与大肠杆菌beta -半乳糖苷酶基因拼接的方法半乳糖苷酶基因拼接的方法 , 所产生的融合型所产生的融合型重组蛋白表达率高、稳定性强重组蛋白表达率高、稳定性强 , 但不能分泌但不能分泌 , 只要以包涵体的形式只要以包涵体的形式存在于胞质中。存在于胞质中。蛋白质工程和基因工程蛋白质类药物蛋白质工程和基因工程蛋白质类药物 1、蛋白质工程的理论设计：蛋白质工程的理论设计： 包括活性设计、专一性设计、框架（构象）设计等。包括活性设计、专一性设计、框架（构象）设计等。 由于对蛋白质的结构与功能之间的关系认识还不系统，由于对蛋白质的结构与功能之间的关系认识还不系统，目前的蛋白质设计仅仅是对天然蛋白质的修饰。目前的蛋白质设计仅仅是对天然蛋白质的修饰。 如：异常血红蛋白的氨基酸取代如：异常血红蛋白的氨基酸取代 去羧基端胰岛素等。去羧基端胰岛素等。 蛋白质工程的一般技术蛋白质工程的一般技术u根据需要合成具有特定氨基酸序列和空间结构的蛋白质；根据需要合成具有特定氨基酸序列和空间结构的蛋白质；u确定蛋白质化学组成、空间结构与生物功能之间的关系；确定蛋白质化学组成、空间结构与生物功能之间的关系；u从氨基酸序列预测蛋白质的空间结构和生物功能，设计合从氨基酸序列预测蛋白质的空间结构和生物功能，设计合成具有特定生物功能的全新蛋白质。成具有特定生物功能的全新蛋白质。 2、基因修饰、基因修饰点突变法点突变法 蛋白质结构的改变通过基因修饰来完成蛋白质结构的改变通过基因修饰来完成基因修饰的方法：基因修饰的方法：基因的全化学合成基因的全化学合成 按照所需蛋白质的氨基酸顺序，先后合成结构基因、转按照所需蛋白质的氨基酸顺序，先后合成结构基因、转录的起始信号及终止信号、限制酶切位点等核酸片段，然录的起始信号及终止信号、限制酶切位点等核酸片段，然后用连接酶将各片段连接起来，通过基因工程转移到细菌后用连接酶将各片段连接起来，通过基因工程转移到细菌中进行目标蛋白质的表达。中进行目标蛋白质的表达。 目前用此法已合成了：人血细胞干扰素、胰岛素、生长目前用此法已合成了：人血细胞干扰素、胰岛素、生长激素释放抑制激素等基因。激素释放抑制激素等基因。 调节基因启动基因结构基因终止基因连接酶连接酶完整基因基因直接修饰法基因直接修饰法 将连接于质粒上的某一蛋白质的基因用酶法去除一小段，将连接于质粒上的某一蛋白质的基因用酶法去除一小段，然后用合成的核苷酸片段接上，从而获得新的突变体。然后用合成的核苷酸片段接上，从而获得新的突变体。 已修饰过的酶有：已修饰过的酶有： 内酰胺酶、酪氨酰内酰胺酶、酪氨酰tRNA合成酶、二氢叶酸还原酶等酶蛋白。合成酶、二氢叶酸还原酶等酶蛋白。限制性内切酶限制性内切酶外源外源DNA限制性内切酶限制性内切酶退火退火重组质粒重组质粒转化转化受体细胞受体细胞筛选筛选表达表达带重组体的细胞带重组体的细胞目的产物目的产物质粒质粒目的基因目的基因酶切割蛋白基因蛋白基因核苷酸片段核苷酸片段新突变质粒新突变质粒盒式突变盒式突变 1985年年Wells提出的一种基因修饰技术，一次可以在一提出的一种基因修饰技术，一次可以在一个位点上产生个位点上产生20种不同氨基酸的突变体，可以对蛋白质分种不同氨基酸的突变体，可以对蛋白质分子中重要氨基酸进行子中重要氨基酸进行“饱和性饱和性”分析。分析。蛋白质工程的运用 酶切割蛋白基因蛋白基因核苷酸片段核苷酸片段新突变质粒新突变质粒同时获得多个突变体同时获得多个突变体图3-1胰岛素的分子结构和从前胰岛素原合成胰岛素的简要过程30个氨基酸B链21个氨基酸A链胰岛素利于重组生产的特点前导序列BCA前胰岛素原（胰岛素原=BCA无前导序列）胰岛素SSSSBA剪切-S-S-S-S-LBAC自发折叠蛋白质工程的应用图3-2 由人工合成的A,B链的基因合成重组胰岛素lac启动子lacZA基因运载人工合成的A基因的 载体B基因运载人工合成的B基因的 载体(a)人工合成的基因(b)合成胰岛素蛋白ABmet-半乳糖苷酶片段A链胰岛素纯化A链和B链二硫键连接metB链溴化氰处理pBR322pBR322转化的大肠杆菌合成AB融合蛋白图3-3重组促生长素抑制素的合成lac启动子lacZ人工促生长素抑制素基因met-半乳糖苷酶片段促生长素抑制素融合蛋白转化大肠杆菌促生长素抑制素（14氨基酸）溴化氰图3-4重组生长素的合成密码子01911912424024Hae保留除去（a）生长素cDNA片段的准备过程（b）表达024合成前导序列191cDNAlac启动子插入表达载体合成生长素转化大肠杆菌图3-5 凝血因子基因及其翻译产物外显子（26）内含子（25）（a）凝血因子基因（b）凝血因子的翻译后的加工初级翻译产物（2351个氨基酸）ABCAC成熟的凝血因子蛋白加工重组凝血因子合成的几种方法在哺乳动物细胞中合成（仓鼠细胞）利用活体动物生产（猪）利用表达载体Ag启动子SV40聚腺甘酸化序列凝血因子的cDNA导入仓鼠细胞重组蛋白干扰素的合成图3-7 利用分离的病毒壳体蛋白作疫苗的原理分离的病毒壳体蛋白壳体蛋白的特异抗体注射到血液循环抗体包围整个病毒被完整病毒感染图3-8 重组牛痘病毒可能用途的基本原理乙型肝炎表面抗原基因牛痘病毒启动子重组牛痘病毒基因组牛痘病毒乙型肝炎病毒抗乙型肝炎抗体抗牛痘病毒抗体注射重组牛痘病毒颗粒到血液循环免疫系统合成抗牛痘病毒和乙型肝炎病毒的抗体表3-2 在重组牛痘病毒中表达的外源基因BACKBACK80（ inclusion bodies IBs)基因工程包含体的纯化基因工程包含体的纯化基因工程菌培养液不同表达形式的前处理基因工程菌培养液不同表达形式的前处理(胞外分泌型表达：离心胞外分泌型表达：离心, ,收集液相收集液相浓缩浓缩纯化。纯化。(胞内表达：胞内表达：l胞内可溶性表达：离心胞内可溶性表达：离心, ,收集菌体收集菌体细胞破碎细胞破碎离心，离心，收集上清收集上清纯化纯化l胞内周质表达：离心胞内周质表达：离心, ,收集菌体收集菌体低浓度溶菌酶或渗透低浓度溶菌酶或渗透压冲击等溶解目标物压冲击等溶解目标物离心离心, ,收集上清液收集上清液纯化。纯化。l不溶性包涵体：离心不溶性包涵体：离心, ,收集菌体收集菌体细胞破碎细胞破碎离心离心, ,收集收集沉淀沉淀包涵体洗涤包涵体洗涤目标蛋白变性溶解目标蛋白变性溶解复性复性纯化。纯化。81蛋白蛋白产物占菌体总蛋白产物占菌体总蛋白外源蛋白的积累外源蛋白的积累人胰岛素人胰岛素50%50%形成包涵体形成包涵体 - -丙酰胺酶丙酰胺酶20%20%在细胞间区在细胞间区- -人体干扰素人体干扰素25%25%形成包涵体形成包涵体凝乳酶原凝乳酶原形成包涵体形成包涵体牛生长激素牛生长激素30%30%形成包涵体形成包涵体 - -内酰胺酶内酰胺酶形成间区包涵体形成间区包涵体人胰岛素原人胰岛素原5%26%5%26%形成包涵体形成包涵体82Z 包涵体：一种蛋白质不溶性聚集体，包括目标蛋白、菌体蛋白等。包涵体：一种蛋白质不溶性聚集体，包括目标蛋白、菌体蛋白等。目标蛋白一级结构是正确的，但立体结构是错误的，所以没有生目标蛋白一级结构是正确的，但立体结构是错误的，所以没有生物活性。物活性。Z 包涵体的形成：大肠杆菌中目标产物的表达水平过高，超过正常包涵体的形成：大肠杆菌中目标产物的表达水平过高，超过正常代谢水平，过多表达产物聚集在细胞内，形成不溶性的包涵体。代谢水平，过多表达产物聚集在细胞内，形成不溶性的包涵体。Z 高表达产生的积聚物在细胞内部形高表达产生的积聚物在细胞内部形成不溶物原因？成不溶物原因？蛋白过量积聚，超过溶解度，导致沉淀；蛋白过量积聚，超过溶解度，导致沉淀；蛋白生成太快，分子间疏水基团相互作用而聚集沉淀；蛋白生成太快，分子间疏水基团相互作用而聚集沉淀；蛋白生成太快，分子内部二硫键的错误连接导致沉淀；蛋白生成太快，分子内部二硫键的错误连接导致沉淀；表达蛋白过多，与其结合表达蛋白过多，与其结合/ /诱导组分不足，不能形成溶解状态诱导组分不足，不能形成溶解状态 蛋白质自身不稳定。蛋白质自身不稳定。包含体的构成包含体的构成83收集菌体细胞收集菌体细胞细胞破碎细胞破碎包涵体的洗涤包涵体的洗涤目标蛋白的变性溶解目标蛋白的变性溶解目标蛋白的复性目标蛋白的复性包含体的出现不仅增加了包含体的出现不仅增加了生物分离设计的难度，也生物分离设计的难度，也为蛋白质折叠机理研究提为蛋白质折叠机理研究提出了新的课题。出了新的课题。欲获得天然活性态的目标欲获得天然活性态的目标产物，必需分离包含体后，产物，必需分离包含体后，溶解包含体并使其中的目溶解包含体并使其中的目标蛋白恢复应有的天然活标蛋白恢复应有的天然活性。性。841）包涵体的洗涤）包涵体的洗涤l细胞破碎后，包含体呈颗粒状，致密。细胞破碎后，包含体呈颗粒状，致密。l洗涤的重要性：收集的沉淀中，除包涵体外，洗涤的重要性：收集的沉淀中，除包涵体外，还包括许多杂质，如膜蛋白、肽聚糖、脂多糖还包括许多杂质，如膜蛋白、肽聚糖、脂多糖等，复性时会与目标蛋白一起复性形成杂交分等，复性时会与目标蛋白一起复性形成杂交分子而聚集，给后步纯化带来困难。子而聚集，给后步纯化带来困难。l洗涤剂：温和的表面活性剂、蔗糖、低浓度的洗涤剂：温和的表面活性剂、蔗糖、低浓度的弱变性剂（如尿素）或脱氧胆酸等。能溶解除弱变性剂（如尿素）或脱氧胆酸等。能溶解除去部分膜蛋白和脂质类杂质。去部分膜蛋白和脂质类杂质。l洗涤剂浓度以溶解杂质，不溶解包涵体中表达洗涤剂浓度以溶解杂质，不溶解包涵体中表达产物为原则。产物为原则。85 2）目标蛋白的变性溶解）目标蛋白的变性溶解 包涵体中不溶性的目标蛋白必须溶解到液相中，才能包涵体中不溶性的目标蛋白必须溶解到液相中，才能进一步纯化。一般水溶液很难将其溶解，只有采用蛋进一步纯化。一般水溶液很难将其溶解，只有采用蛋白质变性才能使其形成可溶性的形式。白质变性才能使其形成可溶性的形式。 常用变性剂：常用变性剂： 5-8 mol/L盐酸胍和盐酸胍和6-8 mol/L尿素尿素, 作用：破坏离子间相互作用；作用：破坏离子间相互作用； 表面活性剂如表面活性剂如1-2 SDS，作用：破坏蛋白质肽链间的疏水相互作用。作用：破坏蛋白质肽链间的疏水相互作用。 PH9.0的碱溶液和有机溶剂，使用较少。的碱溶液和有机溶剂，使用较少。影响变性因素：时间、影响变性因素：时间、pH、离子强度、变性剂种类和、离子强度、变性剂种类和浓度。浓度。86原理：原理：在变性剂溶液中，溶解的蛋白质呈变性在变性剂溶液中，溶解的蛋白质呈变性状态，即蛋白质高级结构被破坏，但一级结构状态，即蛋白质高级结构被破坏，但一级结构和共价键没有破坏。当部分变性剂被除去后，和共价键没有破坏。当部分变性剂被除去后，蛋白质会重新折叠成具有活性的正确构型，该蛋白质会重新折叠成具有活性的正确构型，该过程称复性。过程称复性。复性方法：复性方法：l稀释法除变性剂稀释法除变性剂 加入大量水或缓冲液。加入大量水或缓冲液。l膜分离法除变性剂膜分离法除变性剂 透析、超滤、电渗析。透析、超滤、电渗析。l层析法：凝胶层析，层析法：凝胶层析，高效疏水层析高效疏水层析 3） 目标蛋白的复性目标蛋白的复性87 蛋白质复性影响因素：蛋白质复性影响因素：u变性剂浓度变性剂浓度u目标蛋白浓度；目标蛋白浓度；upH和离子强度；和离子强度； u氧化还原条件。氧化还原条件。 还原剂：还原剂： 二硫苏糖醇、二硫苏糖醇、-巯基乙巯基乙醇、还原型谷胱甘肽；醇、还原型谷胱甘肽；氧化剂：氧化剂： 氧化型谷胱甘肽氧化型谷胱甘肽; 碱性下通空气。碱性下通空气。 复性区复性区 多聚物生成区多聚物生成区 絮凝沉淀区絮凝沉淀区盐酸胍浓度盐酸胍浓度mol/L红血球碳酐酶复性操作中变性剂红血球碳酐酶复性操作中变性剂与蛋白质浓度对复性的影响与蛋白质浓度对复性的影响蛋白质浓度蛋白质浓度 mol/L88肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体蛋白在肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体蛋白在E.coliE.coli中的高密度发酵过程中以两种形式表达：中的高密度发酵过程中以两种形式表达： 细胞内有活性的可溶性蛋白形式（约占目细胞内有活性的可溶性蛋白形式（约占目标蛋白的标蛋白的30%30%） 无活性的包涵体形式（约占目标蛋白的无活性的包涵体形式（约占目标蛋白的70%70%）。）。 悬浮破壁悬浮破壁PBS洗涤洗涤离心离心硫铵沉淀硫铵沉淀 亲和层析亲和层析阳离子交换层析阳离子交换层析溶解溶解复性复性亲和层析亲和层析湿菌体湿菌体发酵液发酵液干净菌体干净菌体上清液上清液包涵体包涵体纯品纯品活性检测活性检测破壁液破壁液离心离心离心液离心液洗涤洗涤举例：举例：TRAIL的分离纯化的分离纯化891. 1. 包涵体的洗涤包涵体的洗涤 粗制包涵体用粗制包涵体用 50mM50mM磷酸盐缓冲液，含磷酸盐缓冲液，含150mM 150mM NaClNaCl pH=7.4 pH=7.4 (1:3 (1:3 w/vw/v) )洗涤洗涤2-32-3次；次； 用含有用含有1M 1M NaClNaCl的磷酸缓冲液洗涤的磷酸缓冲液洗涤1 1次次 (1:3 (1:3 w/vw/v) )，将粘附，将粘附其表面的大部分蛋白及水溶性杂质除去；其表面的大部分蛋白及水溶性杂质除去； 用用6M6M尿素及尿素及0.5%TritonX-100 0.5%TritonX-100 联合洗涤联合洗涤1 1次次 (1:3 (1:3 w/vw/v) )，去，去除另一些杂蛋白，这时得较纯包涵体（纯度达除另一些杂蛋白，这时得较纯包涵体（纯度达80%80%左右）；左右）； 用用SDS-PAGESDS-PAGE电泳检测纯度。电泳检测纯度。 2. 2. 包涵体的变性溶解包涵体的变性溶解 洗涤后包涵体用含有洗涤后包涵体用含有30mM DTT30mM DTT及及5mol/l5mol/l盐酸胍的盐酸胍的TrisTris 缓冲缓冲液液 pH =8.0 (1:5 pH =8.0 (1:5 w/vw/v) )变性溶解变性溶解 室温搅拌室温搅拌2h2h，95%95%以上以上的包涵体可被溶解；的包涵体可被溶解； 离心，离心，13000rpm13000rpm，20min 20min 弃沉淀得到溶解液。弃沉淀得到溶解液。903. 3. 包涵体复性（间歇式流加稀释复性法）包涵体复性（间歇式流加稀释复性法）l以含以含DTTDTT和和ZnSO4ZnSO4的的Tris-HClTris-HCl为复性缓冲液，再添加为复性缓冲液，再添加0.4M L-0.4M L-ArgArg，0.5M0.5M尿素，尿素，0.5M 0.5M NaClNaCl作为蛋白聚集抑制剂，作为蛋白聚集抑制剂，l变性溶解液可多次流加，每次流加的时间是以上一次流加变性溶解液可多次流加，每次流加的时间是以上一次流加蛋白已达到部分复性为准。本实验中，流加间隔时间确定为蛋白已达到部分复性为准。本实验中，流加间隔时间确定为90min90min，每次流加浓度为，每次流加浓度为150mg/L150mg/L，变性液流加次数可高达，变性液流加次数可高达6 6次，最终浓度可达到次，最终浓度可达到1mg/ml1mg/ml，44缓慢搅拌一段时间，缓慢搅拌一段时间，l对对50mM 50mM Tris-HClTris-HCl，300mM 300mM NaClNaCl，0.1M0.1M尿素及尿素及0.2mM ZnSO4 0.2mM ZnSO4 混合液透析过夜，透析后离心除去复性过程中聚集的蛋白，混合液透析过夜，透析后离心除去复性过程中聚集的蛋白，l超滤浓缩（也可用硫酸铵沉淀进行浓缩）得复性蛋白液。超滤浓缩（也可用硫酸铵沉淀进行浓缩）得复性蛋白液。91 5. 复性后纯化复性后纯化 复性浓缩后蛋白复性浓缩后蛋白 金属亲和层析金属亲和层析 吸附吸附 洗涤：洗涤： 40mmol/L咪唑，洗除非特异性吸附的杂蛋白咪唑，洗除非特异性吸附的杂蛋白 洗脱：洗脱： 100mmol/L咪唑咪唑 目标蛋白目标蛋白 纯度达纯度达95%以上（由以上（由SDS-PAGE和和RP-HPLC鉴定）鉴定） 收率收率75%9293 来自发酵罐的菌体经过离心除去培养液后来自发酵罐的菌体经过离心除去培养液后加入缓冲液悬浮，通入高压匀浆器反复破碎三加入缓冲液悬浮，通入高压匀浆器反复破碎三次。匀浆经过离心和水洗除去细胞碎片，再添次。匀浆经过离心和水洗除去细胞碎片，再添加溶菌酶、加溶菌酶、EDTAEDTA和促进剂以除去脂蛋白和未和促进剂以除去脂蛋白和未破碎的细胞。包含体经离心沉淀和水洗后进行破碎的细胞。包含体经离心沉淀和水洗后进行变性溶解，溶解剂为变性溶解，溶解剂为6mol/L6mol/L盐酸胍。溶解的同盐酸胍。溶解的同时通入空气氧化以打断错误连接的双硫键。离时通入空气氧化以打断错误连接的双硫键。离心除去沉淀，含变性蛋白质的上清液经超滤浓心除去沉淀，含变性蛋白质的上清液经超滤浓缩后过凝胶柱除去杂蛋白，再加入复性缓冲液缩后过凝胶柱除去杂蛋白，再加入复性缓冲液进行透析复性。复性过程中产生的絮凝沉淀用进行透析复性。复性过程中产生的絮凝沉淀用离心除去。离心除去。包含体产物分离工艺包含体产物分离工艺（牛生长激素分离提取）（牛生长激素分离提取）质谱在蛋白质、多肽分析中的应用 质谱在蛋白质、多肽分析中的应用质谱在蛋白质、多肽分析中的应用一分子量的测定二蛋白质、多肽纯度的鉴定三肽质量指纹谱四肽序列测定技术 五蛋白质的翻译后修饰鉴定六其他蛋白质鉴定分子量的测定分子量的测定l用ESI-MS和MALDI-TOF-MS测定蛋白质和多肽的分子量，精确度可达0.10.01，这远比其它方法(如SDS-PAGE、凝胶过滤、超离心等）精确。l正确测定蛋白质的分子量，可以提供很多信息，如确定分子大小，从氨基酸组成分析的结果求得准确的氨基酸组成，验证已测定的一级结构是否正确等。分子量测定实例分子量测定实例l采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，高效凝胶过滤色谱以及电喷雾离子化质谱三种方法对新发现的一种蛋白质（来源于福建尖吻蝮蛇蛇毒,是一种具有类凝血酶活性的弱酸性蛋白质）的分子量进行了测定。 测定方法分子量非还原 SDS - PAGE26. 2kDa (二硫键未打开) 还原 SDS - PAGE29kDa (二硫键被还原) HPGFC24. 5kDa ESI - MS30298Da 分子量测定实例分子量测定实例l天花粉蛋白的一级结构测定，在86年时曾出现差错，当时测定的结果表明它是由234个氨基酸残基组成，分子量为25682Da 。90年，我们发现结构测定有误，重新修正了其一级结构。它应由247个氨基酸残基组成，正确分子量为27141.32Da。l93年，用MALDL-TOF-MS和ESI-MS测定了天花粉的分子量。 天花粉蛋白（TCS）的MALDI-TOF-MS的分子量图谱天花粉蛋白（TCS）的ESI-MS的分子量图谱分子量测定实例分子量测定实例l-苦瓜子蛋白的一级结构计算(包括糖部分)的分子量为29156Da，用MALDI-TOF-MS测定的分子量为29074Da，二者相差82Da。这种差异可能是个别氨基酸测定的差错造成，估计整个结构测定不会有大错误。分子量测定实例分子量测定实例l-苦瓜子蛋白其C 端用羧肽酶的方法测定为-S-T-A-D-E-N，但尚不能完全确定。l苦瓜子蛋白在190位有一个色氨酸，我们用BNPS-Skatole降解色氨酸，降解后的肽用HPLC分离，得到含有C 端的一段小肽(59个氨基酸残基)用MALDI-TOF-MS测定其分子量为6443与计算得到的59肽的分子量为6442.9非常相符，因此也就证明了C 端59个氨基酸残基的顺序是正确的。 -苦瓜子蛋白Trp降解C 端肽分子量蛋白质、多肽纯度的鉴定 l根据质谱测定分子量的作用，质谱还可用来作蛋白质、多肽纯度的鉴定。l只要质量有差异的杂质都可以被检出，此方法灵敏度高，用量少(pmol水平)、速度快，并有独到之处。 蛋白质、多肽纯度的鉴