实验三 重组蛋白的表达及Western boltting鉴定

实验三 重组蛋白的表达及Western boltting鉴定一、实验内容1重组蛋白在大肠杆菌中的诱导表达。2重组蛋白的Western boltting鉴定。二、实验要求通过实验，要求学生掌握外源基因在原核细胞中表达的方法，掌握Western bolt的基本原理、实验操作步骤及注意事项。三、实验方法1重组蛋白的原核表达与SDS-PAGE分析（1）将含有重组质粒的细胞在LB平板（含抗生素）上划线，37培养过夜。（2）从LB平板挑取单菌落分别移至2 mL的LB培养液（含抗生素），37 振荡培养过夜。（3）将过夜培养物按1：100转接于2 mL的LB培养液（含抗生素），37继续振摇培养至细菌生长对数中期（OD600 值达0.50.6）。（4）加入IPTG至终浓度0.5 mmol/L，37诱导表达36 hr。（5）取200 L菌液装入1.5 mL Eppendorf管中，以5000 rpm离心1 min，得到菌体细胞。将细胞重悬于30 L水，再加入10 L 4 SDS-PAGE加样缓冲液，混匀，100煮沸10 min后，12,000 rpm离心2 min，吸取上清转移至另一新的离心管中。（6）样品取510 L进行SDS-PAGE分析。2Western blot分析（1）取4 L阳性克隆诱导后的样品，利用15%SDS-PAGE电泳分离。（2）用半干式电转移法将蛋白转至NC膜上。a. 将聚丙稀酰胺凝胶浸泡在电转移缓冲液中平衡10 min。b. 裁剪与凝胶大小相同的NC膜，在电转移缓冲液中平衡10 min。c. 裁剪合适大小的滤纸，用电转移缓冲液浸润，按阳极、三层滤纸、NC膜、凝胶、三层滤纸、阴极的顺序叠放电转移三明治。d. 按0.5 mA/cm2膜恒流电转移3050 min。（3）杂交a. 将NC膜在5%脱脂奶封闭液中室温反应1 hr。b. TBST漂洗3 10 minc. 转移膜至用TBST1：100稀释的一抗工作液（抗六个组氨酸单克隆抗体）中，室温反应1 hr。d. TBST漂洗3 10 mine. 转移膜至用TBST1：2000稀释的辣根过氧化物酶（HRP）偶联的羊抗兔IgG二抗工作液中，室温反应1 hr。f. TBST漂洗3 10 min。（4）显色将膜浸泡在DAB显色液中，待出现清晰条带后，把膜转移至蒸馏水中中止反应。（5）拍照和保存结果。附：溶液配制电转移缓冲液 48 mmol/L Tris 39 mmol/L 甘氨酸 0.01% SDS 20% 甲醇TBST20 mmol/L Tris-HCl/pH 7.50.15 mol/L NaCl0.05% Tween-20Western blot封闭液：TBST + 5%脱脂奶粉或胎牛血清白蛋白抗体稀释液：TBST + 1%脱脂奶粉或胎牛血清白蛋白DAB显色液：二氧基联苯胺，Diaminobenzidine 由图可知，重组蛋白的分子量约为45KDa，由IPTG诱导表达的全菌、上清和沉淀均有表达，由乳糖诱导的仅在全菌和上清中有表达（与没有诱导的进行比较）。 由图可知，重组蛋白的分子量约为45KDa，IPTG诱导的重组蛋白均有表达，且上清表达量高，而乳糖诱导的表达仅在上清和全菌中，而且表达量比IPTG诱导的效果差。