微生物地生长及其控制

word第六章 微生物的生长与其控制要点：微生物生长的测定：测定微生物的生长情况，可选用微生物的细胞数目或生长量等作为指标。 测定细胞数目常用直接计数法、间接计数法以与其他计数法比浊法和膜过滤等；测定微生物的生长量常用测体积、称重量的直接法以与测含氮量、DNA含量和其他生理指标的间接法。同步生长：通过同步培养的手段而使细胞群体中各个体处于分裂步调一致的生长状态，称为同步生长。获得微生物同步生长的方法主要有选择法和诱导法两大类。典型生长曲线：单细胞微生物在分批培养时，其生长规律可用典型生长曲线描述，通常可分为四个时期：延滞期、指数期、稳定期和衰亡期。研究和运用微生物生长规律对基础理论研究和指导生产实践都有重要的意义，连续培养的产生就是一例。影响微生物生长的因素：影响微生物生长的环境因素主要是温度、氧气和pH。根据最适生长温度的不同可将微生物分为三类：嗜冷菌、嗜温菌和嗜热菌。根据微生物和氧的关系，可把它们分为专性好氧菌、兼性厌氧菌、微好氧菌、耐氧菌和专性厌氧菌五大类。不同微生物有其生长的最适pHX围；微生物生长会改变环境的pH并导致对自身生长的不利状态，为此，在实验室或生产实践中就应采用相应措施调整微生物培养物的pH。微生物培养法：实验室和生产实践中培养微生物的方法和装置很多。在实际工作中通常根据微生物的种类和培养目的等方面的不同进展选择。微生物生长的控制：微生物研究或生产实践中，常常需要控制所不期望的微生物的生长。任何杀死或抑制微生物的方法都可以达到控制微生物生长的目的，它们包括加热、低温、枯燥、辐射、过滤等物理方法和消毒剂、防腐剂、化学治疗剂等化学方法两大类。灭菌：利用强烈的理化因素杀死物体中所有微生物的措施称为灭菌。消毒：采用温和的理化因素杀死物体中所有病原微生物的措施称为消毒。防腐：利用某种理化因素抑制微生物生长的措施称为防腐。化疗：利用具有高度选择毒力的化学物质抑制宿主体内病原微生物或病变细胞的治疗措施称为化疗。微生物在适宜的环境条件下，不断吸收营养物质，按其自身方式进展新陈代谢。如果同化合成作用的速度超过了异化分解作用，如此其原生质的总量(重量、体积、大小)就不断增加，于是出现了个体细胞的生长；如果这是一种平衡生长，即各种细胞组分是按恰当比例增长时，如此达到一定程度后就会引起个体数目的增加，对单细胞的微生物来说，这就是繁殖，不久，原有的个体就开展成为一个群体。随着群体中各个个体的进一步生长、繁殖，就引起了这一群体的生长。群体的生长可用其重量、体积、个体浓度或密度等作指标来测定。所以个体和群体间有以下关系：个体生长 个体繁殖 群体生长群体生长 个体生长 个体繁殖除了特定的目的以外，在微生物的研究和应用中，只有群体的生长才有意义，因此，在微生物学中，凡提到“生长时，一般均指群体生长，这一点与研究大型生物时有所不同。第一节 微生物生长的测定测定不同种类、不同生长状态微生物的生长情况，需要选用不同的指标。通常对单细胞微生物来说，既可测定细胞数目，又可测定生长量；而对多细胞(尤其是丝状真菌)，如此常以菌丝生长的长度等作为生长指标。测定微生物生长的方法多种多样，在实际工作中，可根据研究对象或要解决的问题加以选择。一、微生物细胞数目的测定测定微生物细胞数目的方法很多，但它们都只适用于测定处于单细胞状态的细菌和酵母菌，而对于放线菌和霉菌等丝状生长的微生物而言，如此只能测定其孢子数。一直接计数法指用计数板如血球计数板、细菌计数板在光学显微镜下观察细胞并进展计数的方法。此法十分常用，但所得的数目是包括死细胞在内的总菌数。为解决这一矛盾，已有用特殊染料作活菌染色后再用光学显微镜计数的方法，例如用美蓝液对酵母菌染色后，其活细胞为无色，而死细胞如此为蓝色，故可作分别计数；又如，细菌经吖啶橙染色后，在紫外光显微镜下可观察到活细胞发出橙色荧光，而死细胞如此发出绿色荧光，因而也可作活菌和总菌计数。二间接计数法是一种活菌计数法，主要依据活菌在液体培养基中会使其变混或在固体培养基上内形成菌落的原理而设计的。1平板菌落计数法此法适用于各种好氧或厌氧微生物。其主要操作图6-1是把稀释后的一定量菌样通过浇注或涂布的方法，让其内的微生物单细胞一一分散在琼脂平板上内，待培养后，每一活细胞就形成一个单菌落，此即“菌落形成单位cfu，根据每皿上形成的cfu数乘上稀释度就可推算出菌样的含菌数。此法最为常用，但操作较烦琐且要求操作者技术熟练。为克制此缺点，国外已出现多种微型、快速、商品化的用于菌落计数的小型纸片或密封琼脂板。其主要原理是利用加在培养基中的活菌指示剂TTC(2，3，5-氯化三苯基四氮唑)，它可使菌落在很微小时就染成易于识别的玫瑰红色。图6-1 平板菌落计数法的一般步骤2. 液体稀释法对未知菌样作连续的10倍梯度稀释。根据估计数，从最适宜的3个连续的10倍稀释液中各取5ml试样，接种到3组共15支装有培养液的试管中(每管接入1ml)。经培养后，记录每个稀释度出现生长的试管数，然后查MPN最大可能数表，再根据样品的稀释倍数就可计算出其中的活菌含量。 三其他计数法1. 比浊法这是测定无色菌悬液中总细胞数的快速方法。其原理是在一定X围内，菌悬液中的细胞浓度与混浊度成正比，即与光密度O.D.成正比，可借助于分光光度计在一定波长450nm650nm下测量菌悬液的光密度，对照标准曲线求出菌液浓度。此法虽然灵敏度较差，然而却具有简便、快速、不干扰或不破坏样品的优点。由于可使用侧臂三角瓶在不同的培养时间重复测定样品的浊度，因而被广泛地用作微生物生长速率的测定。2. 膜过滤法此法常用于测定量大、含菌浓度低的流样样品如水、空气等。其主要操作是将定量的样品通过膜过滤器，菌体便被阻留在滤膜上，然后将滤膜放在培养基上培养。计算其上的菌落数，求出样品中的含菌数。二、微生物生长量的测定微生物生长的测定也可以不测定细胞的数目，而代之以测定细胞的生长量以与与生长量相平行的生理指标。此类方法适用于一切微生物。一直接法1. 测体积法这是一种粗放的方法，用于初步比拟。例如把待测培养液放在刻度离心管中作自然沉降或进展一定时间的离心，然后观察其体积。2. 称重法包括湿重法和干重法。将微生物培养液离心，收集细胞沉淀物然后称重的方法称为湿重法；将离心得到的细胞沉淀物置于100105的烘箱中枯燥过夜至恒重后称重的方法称为干重法。微生物的干重一般为其湿重的1020。此法适用于菌体浓度较高的样品，并要求除尽杂质。二间接法1. 含氮量测定法一般微生物细胞的含氮量比拟稳定，故可用凯氏定氮法等测其总氮量，再乘以系数625即为粗蛋白含量。蛋白含量越高，说明菌体数和细胞物质量越高。2. DNA含量测定法微生物细胞的DNA含量较稳定，故可采用适当的荧光指示剂或染色剂与菌体DNA作用，利用荧光比色或分光光度计法测得DNA的含量。3. 其他生理指标法如测定碳、磷、RNA、ATP、DAP(二氨基庚二酸) 等的含量。此外，产酸、产气、耗氧、粘度和产热等指标，有时也应用于生长量的测定。三、丝状微生物菌丝长度的测定对于丝状微生物，特别是丝状真菌，通常是通过测定其菌丝的长度变化来反映它们的生长速率。方法有：一培养基外表菌体生长速率测定法主要测定一定时间内在琼脂培养基外表的菌落直径的增加值。二培养料中菌体速率测定法主要测定一定时间内在固体培养料(如栽培食用菌的棉籽壳麸皮培养料)中菌丝体向前延伸的距离。 三单个菌丝顶端生长速率测定法可在显微镜下借助目镜测微尺测定在一定时间内单个菌丝的伸长长度。为了维持菌丝生长，可在载玻片上先用双面胶做一个小室，内盛培养液，将菌丝置于小室后，盖上盖玻片，置显微镜下观察测定。 第二节 微生物的生长规律一、微生物的个体生长和同步生长微生物的细胞是极其微小的，但是，它与一切其他细胞和个体(病毒例外)一样，也有一个自小到大的生长过程。在整个生长过程中，微小的细胞内同样发生着阶段性的极其复杂的生物化学变化和细胞学变化。可是，要研究某一细胞的这类变化，在技术上是极为困难的。目前能使用的方法，一是用电子显微镜观察细胞的超薄切片，二是使用同步培养技术，即设法使某一群体中的所有个体细胞尽可能都处于同样细胞生长和分裂周期中，然后通过分析此群体在各阶段的生物化学特性变化，来间接了解单个细胞的相应变化规律。这种通过同步培养的手段而使细胞群体中各个体处于分裂步调一致的生长状态，称为同步生长。获得微生物同步生长的方法主要有选择法和诱导法两类。1. 选择法这是一类根据微生物细胞在不同生长阶段体积与重量不完全一样的原理设计的方法，其中以膜洗脱法较有效和常用。1离心别离法 将不同步的细胞悬浮在不被该菌利用的蔗糖溶液或葡聚糖液中，通过密度梯度离心将大小不同的细胞分成不同区带，分别取出培养，便可得到同步生长细胞。2过滤别离法 利用孔径不同的微孔滤膜可将大小不同的细胞分开。选用适当孔径的微孔滤膜只允许个体较小的刚分裂的细胞通过滤膜，收集后培养即可获得同步培养物。3膜洗脱法 将异步生长的菌液通过垫有硝酸纤维薄膜的滤器，不同生长阶段的细菌均吸附于膜上，然后翻转滤膜，用无菌的新鲜培养液慢速洗脱，最初流出的是未吸附的细胞，不久，膜上细胞开始分裂，分裂后的子细胞有的不与膜接触易随培养液流下。假如滤膜面积足够大，只要收集刚滴下的子细胞培养液即可获得满意的同步生长的细胞。2. 诱导法主要是通过控制环境条件如温度、营养物或能够影响周期中主要功能的代谢抑制剂等诱导细胞同步生长。主要有：1控制温度 通过最适生长温度与允许生长的亚适温度交替处理可使不同步生长细胞转为同步分裂的细胞。在亚适温度下细胞物质合成照常进展，但细胞不能分裂，使群体中分裂准备较慢的个体赶上其他细胞，再换到最适温度时所有细胞都同步分裂。2控制培养基成分 将不同步生长营养缺陷型细胞在缺少主要生长因子的培养基中饥饿一段时间，细胞都不能分裂，再转到完全培养基中就能获得同步生长细胞。如大肠杆菌胸腺嘧啶缺陷型菌株在缺少胸腺嘧啶时DNA合成停止，但RNA和蛋白质合成不受影响，30 min后参加胸腺嘧啶，DNA合成立即恢复，40 min后几乎所有细胞都进展分裂。也可将不同步菌液在有一定浓度抑制剂(如氯霉素)的培养基里培养一段时间后再接到另一完全培养基中，获得同步生长细胞。应该明确，保持同步生长的时间因菌种和条件而变化。由于同步群体内细胞个体的差异，同步生长最多只能维持23代，又逐渐变为随机生长。二、单细胞微生物的典型生长曲线定量描述液体培养基中微生物群体生长规律的实验曲线，称为生长曲线(growth curve)。当把少量纯种单细胞微生物接种到恒容积的液体培养基中，在适宜的温度、通气等条件下，该群体就会由小到大，发生有规律的增长。如以细胞数目的对数值作纵坐标，以培养时间作横坐标，就可画出一条由延滞期、指数期、稳定期和衰亡期4个阶段组成的曲线，这就是微生物的典型生长曲线。说其“典型，是因为它只适合单细胞微生物如细菌和酵母菌，而对丝状生长的真菌或放线菌而言，只能画出一条非“典型的生长曲线，例如，真菌的生长曲线大致可分为3个时期，即生长延滞期、快速生长期和生长衰退期。典型的生长曲线与非典型的丝状菌生长曲线两者的差异是后者缺乏指数生长期，与此期相当的只是培养时间与菌丝体干重的立方根成直线关系的一段快速生长时期。根据微生物的生长速率常数，即每小时分裂次数R的不同，一般可把典型生长曲线粗分为延滞期、指数期、稳定期和衰亡期等4个时期图6-2。图6-2 微生物的典型生长曲线.延滞期，.指数期，.稳定期，.衰亡期一延滞期lag phase延滞期又称停滞期、调整期或适应期。指少量单细胞微生物接种到新鲜培养液中，在开始培养的一段时间内，因代谢系统适应新环境的需要，细胞数目没有增加的一段时间。该期的特点为：生长速率常数为零；m；细胞内的RNA尤其是rRNA含量增高，原生质呈嗜碱性；合成代谢十分活跃，核糖体、酶类和ATP的合成加速，易产生各种诱导酶； 对外界不良条件如NaCl溶液浓度、温度和抗生素等理、化因素反响敏感。延滞期的长短与菌种的遗传性、接种龄、接种量与移种前后所处的环境条件等因素有关，短的几分钟，长的可达几小时。采取措施缩短延滞期在发酵工业上有重要意义，增加培养基营养、采用最适种龄的健壮菌种(处于指数期的菌种)接种、加大接种量都可缩短延滞期和发酵周期，提高设备利用率。出现延滞期的原因，是由于接种到新鲜培养液中的种子细胞，一时还缺乏分解或催化有关底物的酶或辅酶，或是缺乏充足的中间代谢物。为产生诱导酶或合成有关的中间代谢物，就需要有一段用于适应的时间，此即延滞期。二指数期exponential phase指数期又称对数期logarithmic phase，指在生长曲线中，紧接着延滞期的一段细胞数以几何级数增长的时期。该期的特点是：生长速率常数R最大，因而细胞每分裂一次所需的时间代时generation time，G，又称世代时间或增代时间或原生质增加一倍所需的倍增时间最短；细胞进展平衡生长，故菌体各局部的成分十分均匀；酶系活跃，代谢旺盛。在指数期中，有3个重要参数，其相互关系与计算方法为： 设对数期t1时刻的菌数为x1，经过n次分裂后，t2时刻的菌数为x2。1繁殖代数n x2 x12n以对数表示：lgx2 lgx1 nlg2因此n lgx2 lgx2/ lg2 3.322lgx2 lgx22生长速率常数R 按前述生长速率常数的定义可知： R n / ( t2 t1) 3.322lgx2 lgx2/( t2 t1)3代时G 按前述平均代时的定义可知： G 1/R ( t2 t1) /3.322lgx2 lgx2不同菌种指数期的代时不同，同一菌种在不同培养条件下，代时也不同。培养基营养丰富，培养温度适宜，代时较短；反之如此长。指数期的微生物具有整个群体的生理特性较一致、细胞各成分平衡增长和生长速率恒定等优点，是用作代谢、生理等研究的良好材料，是增殖噬菌体的最适宿主，也是发酵工业中用作种子的最优材料。三稳定期stationary phase稳定期又称恒定期或最高生长期。其特点是生长速率常数R等于零，即处于新繁殖的细胞数与衰亡的细胞数相等，或正生长与负生长相等的动态平衡之中。此期活菌数达到最顶峰，且保持相对稳定。进入稳定期时，细胞内开始积累糖原、异染颗粒和脂肪等内含物；芽孢杆菌一般在这时开始形成芽孢；有的微生物在这时开始以初生代谢物作前体，通过复杂的次生代谢途径合成抗生素等对人类有用的各种次生代谢物。稳定期到来的原因是：营养物尤其是生长限制因子的耗尽；营养物的比例失调，例如CN比不适宜等；酸、醇、毒素或H202等有害代谢产物的累积；pH、氧化复原势等物理化学条件越来越不适宜；等等。稳定期的生长规律对生产实践有着重要的指导意义，例如，对以生产菌体或与菌体生长相平行的代谢产物SCP、乳酸等为目的的某些发酵生产来说，稳定期是产物的最优收获期；对维生素、碱基、氨基酸等物质进展生物测定来说，稳定期是最优测定时期；此外，通过对稳定期到来原因的研究，还促进了连续培养原理的提出和工艺、技术的创建。四衰亡期decline phase或death phase在衰亡期中，微生物个体的死亡速度超过新生速度，整个群体呈现负生长状态R为负值。这时，细胞形态发生多形化，例如会发生膨大或不规如此的退化形态；有的微生物因蛋白水解酶活力的增强而发生自溶；有的微生物在这期会进一步合成或释放对人类有益的抗生素等次生代谢物；而在芽孢杆菌中，往往在此期释放芽孢；等等。产生衰亡期的原因主要是外界环境对继续生长越来越不利，从而引起细胞内的分解代谢明显超过合成代谢继而导致大量菌体死亡。三、微生物的连续培养连续培养又称开放培养，是相对于上述绘制典型生长曲线时采用的那种分批培养或密闭培养而言的。连续培养是在研究典型生长曲线的根底上，通过深刻认识稳定期到来的原因，并采取相应的防止措施而实现的。具体地说，当微生物以分批培养的方式培养到指数期的后期时，一方面以一定速度连续流入新鲜培养基和通入无菌空气，并立即搅拌均匀；另一方面，利用溢流的方式，以同样的流速不断流出培养物。于是容器内的培养物就可达到动态平衡，其中的微生物可长期保持在指数期的平衡生长状态和恒定的生长速率上，于是形成了连续生长图6-3。图6-3 连续培养装置构造示意图培养液储藏瓶，其上有过滤器a和培养基进口b；蠕动泵；恒化器，其上有培养基入口c、搅拌器d、空气过滤装置e和取样口f；收集瓶，其上有过滤器g连续培养装置主要有恒浊器和恒化器两类表6-1。恒浊器是根据培养液细胞密度调节培养液流入的速率，使装置内细胞密度保持恒定。细胞密度通过光电控制系统调节。恒化器通过控制某种限制性营养物质生长限制因子的浓度调节微生物的生长与其细胞密度，使装置内营养物质浓度恒定。表6-1 恒浊器与恒化器的比拟装 置控制对象生长限制因子*培养液流速生长速度产 物应用X围恒浊器菌体密度内控制无不恒定最高生长速度大量菌体或与菌体生长相平行的代谢产物生产为主恒化器培养液流速外控制有恒定低于最高生长速度不同生长速度的菌体实验室为主*生长限制因子：凡处于较低浓度内可影响生长速率和菌体产量的某营养物就称为生长限制因子。连续培养的优点是微生物能在比拟恒定的环境中以恒定的速率生长，有利于研究生长速率(或营养物质)对细胞形态、组成和代谢活动的影响，可筛选出新的突变株；连续培养在生产上可缩短生产周期，提高设备利用率，提高发酵工业的效益，便于自动化生产，减轻劳动强度，已成为当前发酵工业的方向。其不足之处是营养物质利用率低，杂菌易污染，菌种易退化。第三节 影响微生物生长的主要因素影响微生物生长的外界因素很多，除第四章已介绍过的营养条件外，还有许多物理、化学因素。限于篇幅，以下仅阐述其中最主要的温度、氧气和pH 3项。一、温度由于微生物的生命活动都是由一系列生物化学反响组成的，而这些反响受温度影响又极其明显，故温度是影响微生物生长繁殖的最重要因素之一。与其他生物一样，任何微生物的生长温度X围尽管有宽有窄，但总有最低生长温度、最适生长温度和最高生长温度这3个重要指标，这就是生长温度的三基点。如果把微生物作为一个整体来看，其生长温度X围如此很广，可在1095X围内生长。根据最适生长温度的不同可将微生物分为三类：嗜冷菌、嗜温菌和嗜热菌表6-2。表6-2 微生物的生长温度类型微生物类型生长温度X围分布区域最 低最 适最 高嗜冷菌专性嗜冷型105151520海洋深处、南北极、冰窖兼性嗜冷型5010202530海洋、冷泉、冷藏食品嗜温菌室温型102020354045腐生环境体温型102035404045寄生环境嗜热菌254550607095温泉、堆肥、土壤对某一具体微生物而言，其生长温度X围的宽窄与它们长期进化过程中所处的生存环境温度有关。例如，一些生活在土壤中的芽孢杆菌，它们属宽温微生物1565；而专性寄生在人体泌尿生殖道中的淋病奈瑟氏球菌如此是窄温微生物3640。最适生长温度经常简称为“最适温度，其涵义为某种微生物分裂代时最短或生长速率最高时的培养温度。必须强调指出，对同一种微生物来说，最适生长温度并非一切生理过程的最适温度，也就是说，最适温度并不等于生长得率最高时的培养温度，也不等于发酵速率或累积代谢产物最高时的培养温度，更不等于累积某一代谢产物最高时的培养温度，例如粘质赛氏杆菌的生长最适温度为37，而其合成灵杆菌素的最适温度为2025；黑曲霉生长最适温度为37，而产糖化酶的最适温度如此为3234。这一规律对指导发酵生产有着重要的意义。例如，国外曾报道在产黄青霉总共165 h的青霉素发酵过程中，运用了上述规律，即根据其不同生理代谢过程有不同最适温度的特点，分成4段进展不同温度培养。具体做法是：接种后在30下培养5h，将温度降至25培养35h，再下降至20培养85h，最后又升温至25培养40h后放罐。结果，其青霉素产量比常规的自始至终进展30恒温培养的对照组竟提高了14.7。二、氧气微生物对氧的需要和耐受能力在不同的类群中差异很大，根据它们和氧的关系，可把它们粗分成好氧微生物(好氧菌，aerobes)和厌氧微生物(厌氧菌，anaerobes)两大类，并可进一步细分为5类图6-4。一好氧菌好氧菌又可分为专性好氧菌、兼性厌氧菌和微好氧菌3类。1. 专性好氧菌必须在较高浓度分子氧的条件下才能生长，它们有完整的呼吸链，以分子氧作为最终氢受体，具有超氧化物歧化酶SOD和过氧化氢酶，绝大多数真菌和多数细菌、放线菌都是专性好氧菌，例如醋杆菌属、固氮菌属、铜绿假单胞菌和白喉棒杆菌等。振荡、通气、搅拌都是实验室和工业生产中常用的供氧方法。2. 兼性厌氧菌以在有氧条件下的生长为主也可兼在厌氧条件下生长的微生物，有时也称“兼性好氧菌。它们在有氧时靠呼吸产能，无氧时如此借发酵或无氧呼吸产能；细胞含SOD和过氧化氢酶。它们在有氧条件下比在无氧条件下生长得更好。许多酵母菌和不少细菌都是兼性厌氧菌。例如酿酒酵母、地衣芽孢杆菌以与肠杆菌科的各种常见细菌，包括大肠杆菌、产气肠杆菌和普通变形杆菌等。3. 微好氧菌只能在较低的氧分压下才能正常生长的微生物。也是通过呼吸链并以氧为最终氢受体而产能。霍乱弧菌、氢单胞菌属、发酵单胞菌属和弯曲菌属等都属于这类微生物。图6-4 5类对氧关系不同的微生物在半固体琼脂柱中的生长状态模式图二厌氧菌厌氧菌又可分为耐氧菌和专性厌氧菌。1. 耐氧菌即耐氧性厌氧菌的简称。是一类可在分子氧存在下进展发酵性厌氧生活的厌氧菌。它们的生长不需要任何氧，但分子氧对它们也无害。它们不具有呼吸链，仅依靠专性发酵和底物水平磷酸化而获得能量。耐氧的机制是细胞内存在SOD和过氧化物酶但缺乏过氧化氢酶。通常的乳酸菌多为耐氧菌，例如乳酸乳杆菌、肠膜明串珠菌、乳链球菌和粪肠球菌等；非乳酸菌类耐氧菌如雷氏丁酸杆菌等。有一般厌氧菌与严格厌氧菌专性厌氧菌之分。该类微生物的特点是：分子氧对它们有毒，即使短期接触也会抑制甚至致死；在空气或含10CO2的空气中，它们在固体或半固体培养基外表不能生长，只有在其深层无氧处或在低氧化复原势的环境下才能生长；生命活动所需能量是通过发酵、无氧呼吸、循环光合磷酸化或甲烷发酵等提供；细胞内缺乏SOD和细胞色素氧化酶，大多数还缺乏过氧化氢酶。常见的厌氧菌有梭菌属、拟杆菌属、梭杆菌属、双歧杆菌属以与各种光合细菌和产甲烷菌等。其中产甲烷菌属于古生菌类，它们都属于极端厌氧菌。三、pH微生物作为一个整体来说，其生长的pHX围极广2 10，有少数种类还可超出这一X围。但绝大多数微生物的生长pH都在59之间。与温度的三基点相似，不同微生物的生长pH也存在最低、最适与最高3个数值。除不同种类微生物有其最适生长pH外，即使同一种微生物在其不同的生长阶段和不同的生理、生化过程，也有不同的最适pH要求。研究其中的规律，对发酵生产中pH的控制尤为重要。例如，黑曲霉在pH为2.02.5时，有利于合成柠檬酸， pH在2.56.5X围内时，就以菌体生长为主，而pH在7左右时，如此大量合成草酸。又如，丙酮丁醇梭菌在pH为5.57.0时，以菌体的生长繁殖为主，而pH在4.35.3X围内才进展丙酮、丁醇发酵。此外，许多抗生素的生产菌都有同样的情况。利用上述规律对提高发酵生产效率十分重要。虽然微生物外环境的pH变化很大，但细胞内环境中的pH却相当稳定，一般都接近中性。这就免除了DNA、ATP、菌绿素和叶绿素等重要成分被酸破坏，或RNA、磷脂类等被碱破坏的可能性。与细胞内环境的中性pH相适应的是，胞内酶的最适pH一般都接近中性，而位于周质空间的酶和分泌到细胞外的胞外酶的最适pH如此接近环境的pH。 pH除了对细胞发生直接影响之外，还对细胞产生种种间接的影响。例如，可影响培养基中营养物质的离子化程度，从而影响微生物对营养物质的吸收，影响环境中有害物质对微生物的毒性，以与影响代谢反响中各种酶的活性等。微生物在其生命活动过程中也会能动地改变外界环境的pH，这就是通常遇到的培养基的原始pH值会在培养微生物的过程中时时发生改变的原因。其中发生pH改变的可能反响有以下数种：在一般微生物的培养中变酸往往占优势，因此，随着培养时间的延长，培养基的pH会逐渐下降。当然，pH的变化还与培养基的组分尤其是碳氮比有很大的关系，碳氮比高的培养基，例如培养各种真菌的培养基，经培养后其pH值常会显著下降；相反，碳氮比低的培养基，例如培养一般细菌的培养基，经培养后，其pH值常会明显上升。在微生物培养过程中pH值的变化往往对该微生物本身与发酵生产均有不利的影响，因此，如何与时调整pH就成了微生物培养和发酵生产中的一项重要措施。通过总结实践中的经验，一般把调节pH的措施分成“治标和“治本两大类，前者是根据外表现象而进展的直接、与时、快速但不持久的外表化调节，后者如此是根据内在机制而采用的间接、缓效但可发挥持久作用的调节。现将这两类措施表解如下：pH调节治标过酸时，参加NaOH、Na2CO3等碱液中和过碱时，参加H2SO4、HCl等酸液中和治本过酸时加适当氮源：加尿素、NaNO3、NH4OH或蛋白质等提高通气量过碱时加适当碳源：加糖、乳酸、醋酸、柠檬酸或油脂等降低通气量第四节 微生物培养法概论一个良好的微生物培养装置的根本条件是：按微生物的生长规律进展科学的设计，能在提供丰富而均匀营养物质的根底上，保证微生物获得适宜的温度和良好的通气条件(厌氧菌除外)，此外，还要为微生物提供一个适宜的物理化学条件，并严防杂菌污染等。从历史开展的角度(纵向)来看，微生物培养技术开展的轨迹有以下特点：从少量培养到大规模培养；从浅层培养开展到厚层固体制曲或深层液体搅拌培养；从以固体培养技术为主到以液体培养技术为主；从静止式液体培养开展到通气搅拌式的液体培养；从分批培养开展到连续培养以至多级连续培养；从利用分散的微生物细胞开展到利用固定化细胞；从单纯利用微生物细胞到利用动物、植物细胞进展大规模培养；从利用野生型菌株开展到利用变异株直至遗传工程菌株；从单菌发酵开展到混菌发酵；从低密度培养开展到高密度培养；从人工控制的发酵罐到多传感器、计算机在线控制的自动化发酵罐；等等。以下就实验室和生产实践中一些较有代表性的微生物培养法作一简要介绍。一、实验室的微生物培养法一好氧培养法1. 固体培养法实验室中将微生物菌种接种在固体培养基的外表，使之获得充足的氧气生长。因所用器皿不同而分为试管斜面、培养皿琼脂平板、较大型的克氏扁瓶与茄子瓶斜面等平板培养方法。2. 液体培养法液体培养就是将微生物菌种接种到液体培养基中进展培养。实验室进展好氧菌液体培养的方法主要有四种: 试管液体培养、浅层液体培养、摇瓶培养和台式发酵罐培养。1试管液体培养 装液量可多可少。此法的通气效果一般较差，仅适合培养兼性厌氧菌。常用于微生物的各种生理生化试验等。2浅层液体培养 在三角瓶中装入浅层培养液，其通气量与装液量、棉塞通气程度密切相关。此法一般仅适用于兼性厌氧菌的培养。3摇瓶培养 将装有较少量液体培养基的三角瓶摇瓶，用812层纱布或疏松的棉塞封口以利于通气并阻止空气中杂菌或杂质进入，将摇瓶放置在旋转式或往复式摇床上进展振荡培养。为使菌体获得充足的氧，一般装液量为三角瓶容积的10左右，如250ml三角瓶装1020ml培养液。摇瓶培养在实验室里被广泛用于微生物的生理生化试验、发酵和菌种筛选等，也常在发酵工业中用于种子培养。4台式发酵罐 实验室用的发酵罐体积一般为几升到几十升。商品发酵罐的种类很多，一般都有多种自动控制和记录装置。如配置有pH、溶解氧、温度和泡沫检测电极，有加热或冷却装置，有补料、消泡和pH调节用的酸或碱贮罐与其自动记录装置，大多由计算机控制。因为它的结构与生产用的大型发酵罐接近，所以，它是实验室模拟生产实践的重要试验工具。二厌氧培养法1. 固体培养法实验室中培养厌氧菌除了需要特殊的培养装置或器皿外，首先应配制特殊的培养基。此类培养基中，除保证提供6种营养要素外，还须参加适当的复原剂，必要时，还要参加刃天青等氧化复原势指示剂。早期主要采用高层琼脂柱法、厌氧培养皿法，现在主要采用厌氧罐技术、厌氧手套箱技术和亨盖特滚管技术图6-5。图6-5 厌氧微生物的培养装置2. 液体培养法实验室中厌氧菌的液体培养同固体培养一样，都需要特殊的培养装置以与加有复原剂和氧化复原指示剂的培养基。假如在厌氧罐或厌氧手套箱中对厌氧菌进展液体培养，通常不必提供额外的培养措施；假如单独放在有氧环境下培养，如此在培养基中必须参加巯基乙酸、半胱氨酸、维生素C或庖肉(牛肉小颗粒)等有机复原剂，或参加铁丝等能显著降低氧化复原电位的无机复原剂，在此根底上，再用深层培养或同时在液面上封一层石蜡油或凡士林-石蜡油，如此可保证专性厌氧菌的生长。二、生产实践中的微生物培养法一好氧培养法1. 固体培养法工业生产中利用麸皮或米糠等为主要原料，加水搅拌成含水量适度的半固体物料作为培养基，接种微生物进展培养，在豆酱、醋、酱油等酿造食品工业中广泛应用。根据所用设备和通气方法的不同可分为浅盘法、转桶法和厚层通风法(图6-6)。食用菌生产中通常将棉籽壳等培养料装入塑料袋中或平铺在床架上，接种培养。图6-6 通风曲槽结构模式图2. 液体培养法早期的青霉素和柠檬酸等的发酵工业中，均使用过浅盘培养法，但因其劳动强度大、生产效率低以与易污染杂菌等缺点，未能广泛使用。现代发酵工业中主要采用深层液体通风培养法向培养液中强制通风，并设法将气泡微小化，使它尽可能滞留于培养液中以促进氧的溶解。最常用的是机械搅拌通风发酵罐图6-7。图6-7 机械搅拌通风发酵罐的构造与其运转原理二厌氧培养法1. 固体培养法生产实践中对厌氧菌进展大规模固态培养的例子还不多见，在我国的传统白酒生产中，一向采用大型深层地窖对固态发酵料进展堆积式固态发酵，这对酵母菌的酒精发酵和己酸菌的己酸发酵等都十分有利，因此可生产名优大曲酒(蒸馏白酒)。2. 液体培养法工业上主要采用液体静置培养法，接种后不通空气静置保温培养，常用于酒精、啤酒、丙酮、丁醇与乳酸等发酵过程。该法发酵速度快，周期短，发酵完全，原料利用率高，适合大规模机械化、连续化、自动化生产。第五节 微生物生长的控制在微生物研究或生产实践中，常常需要控制所不期望的微生物的生长。任何杀死或抑制微生物的方法都可以达到控制微生物生长的目的，它们包括加热、低温、枯燥、辐射、过滤等物理方法和消毒剂、防腐剂、化学治疗剂等化学方法两大类。由于目的不同，对微生物生长控制的要求和采用的方法也就有很大的不同，因而产生的效果也不同。1灭菌 利用强烈的理化因素杀死物体中所有微生物的措施称为灭菌。2消毒 采用温和的理化因素杀死物体中所有病原微生物的措施称为消毒。3防腐 利用某种理化因素抑制微生物生长的措施称为防腐。4化疗 利用具有高度选择毒力的化学物质抑制宿主体内病原微生物或病变细胞的治疗措施称为化疗。现将上述4个概念的特点和比拟列在表6-3中。表6-3 灭菌、消毒、防腐、化疗的比拟比 较 项 目灭 菌消 毒防 腐化 疗处理因素强烈理化因素温和理化因素理化因素化学治疗剂处理对象任何物体内外生物体表，酒、乳等有机质物体内外宿主体内微生物类型一切微生物有关病原菌一切微生物有关病原菌对微生物作用彻底杀灭杀死或抑制抑制或杀死抑制或杀死实例加压蒸汽灭菌，辐射灭菌，化学杀菌剂70酒精消毒，巴氏消毒法冷藏。枯燥，糖渍，盐腌，缺氧，化学防腐剂抗生素，抗代谢药物一、控制微生物生长的物理方法一高温灭菌当环境温度超过微生物的最高生长温度时就会引起死亡。高温的致死作用，主要是引起蛋白质、核酸和脂类等重要生物大分子发生降解或改变其空间结构等，从而变性或破坏。一定时间内(一般为10min)杀死微生物所需要的最低温度称为致死温度。高温灭菌分为干热灭菌和湿热灭菌，在一样温度下，湿热灭菌效果比干热灭菌好表6-4。原因是蛋白质的含水量与其凝固温度成反比，因此湿热条件下，菌体吸收水分，菌体蛋白更容易凝固表6-5；热蒸汽穿透能力强(表6-6)；湿热蒸汽有潜热存在，当蒸汽在物体外表凝结成水时放出大量热量，可提高灭菌物品的温度。表6-4 干热与湿热空气对不同细菌的致死时间比拟 加热方式细菌种类干热9090相对湿度 加热方式细菌种类干热9090相对湿度20802080白喉棒杆菌24h2h2min伤寒杆菌3h2h2min痢疾杆菌3h2h2min葡萄球菌8h3h2min表6-5 蛋白质含水量与其凝固温度的关系蛋白质含水量/%蛋白质凝固温度/灭菌时间/min蛋白质含水量/%蛋白质凝固温度/灭菌时间/min5056306145302574803001601703018809030表6-6 干热和湿热空气穿透力的比拟加热方式温度/加热时间/h透过布的层数与其温度/20层40层100层干热1301404867270以下湿热10541011011011. 干热灭菌干热灭菌是通过灼烧或烘烤等方法杀死微生物。1火焰灼烧法 实验室常用酒精灯火焰灼烧接种工具和试管口等物品。医院常燃烧污染物品与实验动物尸体等。此法灭菌彻底、迅速、简便。2烘箱热空气法 通常将灭菌物品放入电热烘箱内，在150170下维持l2 h可达到彻底灭菌包括细菌的芽孢的目的。利用热空气灭菌，灭菌时间可根据被灭菌物品的体积作适当调整。该法适用于金属器械和玻璃器皿等耐热物品的灭菌，也可用于油料和粉料物质的灭菌。2. 湿热灭菌1常压法巴氏消毒法 此法最早由法国微生物学家巴斯德采用。这是一种专用于牛奶、啤酒、果酒或酱油等不宜进展高温灭菌的液态风味食品或调料的低温消毒方法。此法可杀灭物料中的无芽孢病原菌如牛奶中的结核分枝杆菌或沙门氏菌，又不影响其原有风味。具体做法可分为2类：第一类是经典的低温维持法LTH,例如用于牛奶消毒只要在63维持30min即可；第二类是较现代的高温瞬时法HTST，用此法作牛奶消毒时只要在72维持15s。近年来，牛奶和其他液态食品一般都采用超高温瞬时灭菌技术UHT，即138142，灭菌24s，既可杀菌，又能保质，还可缩短时间，提高经济效益。煮沸消毒法 物品在水中煮沸(100)15 min以上，可使某些病毒失活，可杀死细菌与真菌的所有营养细胞和局部芽孢、孢子。如延长时间或参加l碳酸钠或25石炭酸，如此效果更好。此法适用于解剖器具、家庭餐具和饮用水等的消毒。间歇灭菌法 又称分段灭菌法或丁达尔灭菌法。将待灭菌物品于常压下加热至100处理1560min，杀死其中营养细胞。冷却后37保温过夜，使其中残存芽孢萌发成营养细胞，第二天再以同样的方式加热处理，反复三次，可杀灭所有的芽孢和营养细胞，达到灭菌目的。此法主要适用于一些不耐高温的培养基、营养物等的灭菌，缺点是较费时间。2加压法常规加压蒸汽灭菌法 一般称作“高压蒸汽灭菌法。这是一种利用高温(而非压力)进展湿热灭菌的方法，优点是操作简便、效果可靠，故被广泛使用。其原理是：将待灭菌的物件放置在盛有适量水的专用加压灭菌锅(或家用压力锅)内，盖上锅盖，并打开排气阀，通过加热煮沸，让蒸汽驱尽锅内原有的空气，然后关闭锅盖上的阀门，再继续加热，使锅内蒸汽压逐渐上升，随之温度也相应上升至100即0.07MPa)下维持35min的方法。加压蒸汽灭菌法适合于一切微生物学实验室、医疗保健机构或发酵工厂中对培养基与多种器材或物料的灭菌。连续加压蒸汽灭菌法 ：在发酵行业里也称“连消法。此法仅用于大型发酵厂的大批量培养基的灭菌。主要操作原理是让培养基在管道的流动过程中快速升温、维持和冷却，然后流进发酵罐。培养基一般加热至135140下维持515s。优点：采用高温瞬时灭菌，既进展了彻底地灭菌，又有效地减少营养成分的破坏，从而提高了原料的利用率和发酵产品的质量和产量。在抗生素发酵中，它可比常规的“实罐灭菌(120，30min)提高产量510；由于总的灭菌时间比分批灭菌法明显减少，故缩短了发酵罐的占用时间，提高了它的利用率；由于蒸汽负荷均衡，故提高了锅炉的利用效率；适宜于自动化操作，降低了操作人员的劳动强度。二低温抑菌低温的作用主要是抑菌。它可使微生物的代谢活力降低，生长繁殖停滞，但仍能保持活性。低温法常用于保藏食品和菌种。1. 冷藏法 将新鲜食物放在4冰箱保存，防止腐败。然而贮藏只能维持几天，因为低温下耐冷微生物仍能生长，造成食品腐败。利用低温下微生物生长缓慢的特点，可将微生物斜面菌种放置于4冰箱中保存数周至数月。2. 冷冻法 家庭或食品工业中采用-10 -20左右的冷冻温度，使食品冷冻成固态加以保存，在此条件下，微生物根本上不生长，保存时间比冷藏法长。冷冻法也适用于菌种保藏，所用温度更低，如-20低温冰箱、或-70超低温冰箱、或-195液氮。三辐射辐射主要有紫外光、电离辐射、强可见光等，可用于控制微生物生长和保存食品。1. 紫外光它由波长100400nm的光组成，其中200300nmX围的紫外光杀菌作用最强。紫外光杀菌作用主要是它可以被蛋白质(约280nm)和核酸(约260nm)吸收，使其变性失活。核酸中的胸腺嘧啶吸收紫外光后形成二聚体，导致DNA复制和转录中遗传密码阅读错误，引起致死突变。紫外线还可使空气中分子氧变为臭氧，分解放出氧化能力极强的新生态0，破坏细胞物质的结构，使菌体死亡。紫外光穿透能力很差，只能用于物体外表或室内空气的灭菌。紫外光灭活病毒特别有效，对其他微生物细胞的灭活作用因DNA修复机制的存在受到影响。紫外光的杀菌效果也与菌种的生理状态有关。干细胞抗紫外辐射能力比活细胞强，孢子抗性比营养细胞强，带色细胞的色素假如可吸收紫外光也可起保护作用。2. 电离辐射控制微生物生长所用的电离辐射主要是X射线和射线。电离辐射波长短，穿透力强，能量高，效应无专一性，作用于一切细胞成分。主要用于其他方法不能解决的塑料制品、医疗设备、药品和食品的灭菌。射线是某些放射性同位素，如65Co发射出的高能辐射，具较强穿透能力，能致死所有微生物。已有专门用于不耐热的大体积物品消毒的射线装置。3. 强可见光太阳光具有杀菌作用，主要是由紫外光造成的。但含有400700nm波长X围的强可见光也具有直接的杀菌效应，它们能够氧化细菌细胞内的光敏感分子，如核黄素和卟啉环(构成氧化酶的成分)。因此，实验室应注意防止将细菌培养物暴露于强光下。此外，曙红和四甲基蓝能吸收强可见光使蛋白质和核酸氧化，因此常将两者结合用来灭活病毒和细菌。四枯燥和渗透压微生物代谢离不开水。枯燥或提高溶液渗透压降低微生物可利用水的量或活度，可抑制其生长。1. 枯燥枯燥的主要作用是抑菌，使细胞失水，代谢停止，也可引起某些微生物死亡。干果、稻谷、奶粉等食品通常采用枯燥法保存，防止腐败。不同微生物对枯燥的敏感性不同，G 细菌，如淋病球菌对枯燥特别敏感，几小时便死亡；但结核分枝杆菌特别耐枯燥，在此环境中，100、20 min仍能生存；链球菌用枯燥法保存几年而不丧失致病性。休眠孢子抗枯燥能力很强，在枯燥条件下可长期不死，故可用于菌种保藏。2. 渗透压一般微生物都不耐高渗透压。微生物在高渗环境中，水从细胞中流出，使细胞脱水。盐腌制咸肉或咸鱼，糖浸果脯或蜜饯等均是利用此法保存食品的。五过滤除菌m孔径滤膜时，虽可根本滤除溶液中存在的细菌，但病毒与支原体等可通过。过滤除菌可用于对热敏感液体的灭菌，如含有酶或维生素的溶液、血清等，还可用于啤酒生产代替巴氏消毒法。六超声波超声波(频率在20000赫兹以上)具有强烈的生物学作用。它致死微生物主要是通过探头的高频振动引起周围水溶液的高频振动，当探头和水溶液的高频振动不同步时能在溶液内产生空穴(真空区)，只要菌体接近或进入空穴，由于细胞内外压力差，导致细胞破裂，内含物外溢实现的。此外，超声波振动，机械能转变为热能，使溶液温度升高，细胞热变性，抑制或杀死微生物。科研中常用此法破碎细胞，研究其组成、结构等。超声波几乎对所有微生物都有破坏作用，效果因作用时间、频率与微生物种类、数量、形状而异。一般地，高频率比低频率杀菌效果好，球菌较杆菌抗性强，细菌芽孢具有更强的抗性。二、控制微生物生长的化学方法许多化学药剂可抑制或杀灭微生物，因而被用于微生物生长的控制，它们被分为3类：消毒剂、防腐剂、化学治疗剂。化学治疗剂是指能直接干扰病原微生物的生长繁殖并可用于治疗感染性疾病的化学药物，按其作用和性质又可分为抗代谢物和抗生素。一消毒剂和防腐剂消毒剂是可抑制或杀灭微生物，对人体也可能产生有害作用的化学药剂，主要用于抑制或杀灭非生物体外表、器械、排泄物和环境中的微生物。防腐剂是可抑制微生物但对人和动物毒性较低的化学药剂，可用于机体外表如皮肤、粘膜、伤口等处防止感染，也可用于食品、饮料、药品的防腐。现消毒剂和防腐剂间的界限已不严格，如高浓度的石炭酸(35)用于器皿外表消毒，低浓度的石炭酸(O.5)用于生物制品的防腐。本节将消毒剂和防腐剂一起讨论。理想的消毒剂和防腐剂应具有作用快、效力大、渗透强、易配制、价格低、毒性小、无怪味的特点。完全符合上述要求的化学药剂很少，根据需要尽可能选择具有较多优良特性的化学药剂。1. 醇类醇类是脂溶剂，可损伤细胞膜，同时使蛋白质变性，低级醇还是脱水剂，因而具有杀菌能力。但醇类对细菌芽孢无效，主要用于皮肤与器械消毒。其杀菌作用是丁醇丙醇乙醇甲醇，丁醇以上不溶于水，甲醇毒性很大，通常用乙醇。无水乙醇与菌体接触后使细胞迅速脱水，外表蛋白凝固形成保护膜，阻止乙醇进一步渗入，影响杀菌能力。实验明确，70乙醇杀菌效果最好，实际常用75乙醇。2. 醛类醛类的作用主要是使蛋白质烷基化，改变酶或蛋白质的活性，使微生物的生长受到抑制或死亡。常用的醛类是甲醛，3740甲醛溶液称福尔马林，因有刺激性和腐蚀性，不宜在人体使用，常以2甲醛溶液浸泡器械，10甲醛溶液薰蒸房间。3. 酚类低浓度的酚可破坏细胞膜组分，高浓度的酚凝固菌体蛋白。酚还能破坏结合在膜上的氧化酶与脱氢酶，引起细胞的迅速死亡。常用的苯酚又称石炭酸，O.5可消毒皮肤，25可消毒痰、粪便与器皿，5可喷雾消毒空气。甲酚是酚的衍生物，杀菌效果比苯酚强几倍，但在水中的溶解度较低，可在皂液或碱性溶液中形成乳浊液。市售的消毒剂来苏尔是就甲酚与肥皂的混合液，常用35的溶液消毒皮肤、桌面与用具。4. 外表活性剂主要是破坏菌体细胞膜的结构，造成胞内物质泄漏，蛋白质变性，菌体死亡。肥皂是一种阴离子外表活性剂，对肺炎链球菌或链球菌有效，但对葡萄球菌、结核分枝杆菌无效，0.25的肥皂溶液对链球菌的作用比0.7来苏尔或0.1的升汞还强，但一般认为肥皂的作用主要是机械地移去微生物，微生物附着于肥皂泡沫中被水冲洗掉。常用的新洁尔灭是人工合成的季铵盐阳离子外表活性剂，0.050.1新洁尔灭溶液用于皮肤、粘膜和器械消毒。5. 染料一些碱性染料的阳离子可与菌体的羧基或磷酸基作用，形成弱电离的化合物，妨碍菌体的正常代谢，抑制生长。结晶紫可干扰细菌细胞壁肽聚糖的合成，阻碍UDP-N-乙酰胞壁酸转变为UDP-N-乙酰胞壁酸五肽。临床上常用24的水溶液即紫药水消毒皮肤和伤口。6. 氧化剂类氧化剂作用于蛋白质的巯基，使蛋白质和酶失活，强氧化剂还可破坏蛋白质的氨基和酚羟基。常用的氧化剂有卤素、过氧化氢、高锰酸钾。95乙醇-2碘-2碘化钠、83乙醇-7碘-5碘化钾、5碘-10碘化钾水溶液等的混合液称为碘酒，消毒皮肤比其他药品强。氯对金属有腐蚀作用，一般用于水消毒，氯溶解于水形成盐酸和次氯酸，次氯酸在酸性环境中解离放出新生态氧，具强烈的氧化作用而杀菌。漂白粉主要含次氯酸钙，次氯酸钙很不稳定，水解成次氯酸，也产生新生态氧。O.51的漂白粉溶液能在5min内杀死大局部细菌。8. 重金属高浓度的重金属与其化合物都是有效的杀菌剂或防腐剂，常用汞与其衍生物。二氯化汞又称升汞l：5002000液可杀灭大多数细菌，腐蚀金属，对动物有剧毒，常用于组织别离时外表消毒和器皿消毒。汞溴红又称红汞，2红汞水溶液即红药水常消毒皮肤、粘膜与小创伤，不可与碘酒共用。银是温和的消毒剂，0.1l硝酸银可消毒皮肤，l硝酸银可防治新生儿传染性眼炎。硫酸铜对真菌和藻类有强杀伤力，与石灰配制的波尔多液可防治某些植物病害。8. 酸碱类酸碱类物质可抑制或杀灭微生物。生石灰常以1：48配成糊状，消毒排泄物与地面。有机酸解离度小，但有些有机酸的杀菌力反而大，作用机制是抑制酶或代谢活动，并非酸度的作用。苯甲酸、山梨酸和丙酸广泛用于食品、饮料等的防腐，在偏酸性条件下有抑菌作用。二抗代谢物有些化合物结构与生物的代谢物很相似，竞争特定的酶，阻碍酶的功能，干扰正常代谢，这些物质称为抗代谢物。抗代谢物种类较多，如磺胺类药物为对氨基苯甲酸的对抗物；6-巯基嘌呤是嘌呤的对抗物；5-甲基色氨酸是色氨酸的对抗物；异烟胼(雷米封)是吡哆醇的对抗物。磺胺类药物是最常用的化学治疗剂，具有抗菌谱广、性质稳