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word质粒DNA的提取、定量、酶切与PCR鉴定一、实验目的1.学习并掌握用碱裂解法提取质粒DNA的方法；2.学习并掌握了解质粒酶切鉴定的方法；3.学习并掌握紫外吸收检测DNA浓度和纯度的原理和方法；4.学习并掌握PCR基因扩增的实验原理和操作方法；5.学习并掌握水平式琼脂糖凝胶电泳的原理和使用方法。二、实验原理1.PCR(多聚酶链式反响)在DNA聚合酶催化下，可以DNA为模板，以特定引物为延伸起点，以dNTP为原料，通过变性、退火、延伸等步骤， 在体外缓冲液中复制DNA，使目的DNA按2n方式呈指数形式扩增。 PCR一次循环的具体反响步骤为：A.变性：加热反响系统至95，使模板DNA在高温下完全变性，双链解链 。 B.退火：逐渐降低溶液温度，使合成引物在低温3570,一般低于模板Tm值的5左右，与模板DNA互补退火形成局部双链。 C.延伸：溶液反响温度升至中温72，在 Taq酶作用下，以dNTP为原料，引物为复制起点，模板DNA的一条单链在解链和退火之后延伸为一条双链。 2.质粒DNA的提取与制备(1).碱裂解法：染色体DNA与质粒DNA的变性与复性存在差异：A.高碱性条件下，染色体DNA和质粒DNA均变性；B.当以高盐缓冲液调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA复性并保存在溶液中，染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，可通过离心形成沉沉淀去除。(2).离心层析柱：A.硅基质膜在高盐、低pH值状态下可选择性地结合溶液中的质粒DNA，而不吸附溶液中的蛋白质和多糖等物质；B.通过去蛋白液和漂洗液将杂质和其它细菌成分去除；C.低盐，高pH值的洗脱缓冲液将纯净质粒DNA从硅基质膜上洗脱。3. 质粒DNA的定量分析紫外分光光度法：A.物质在光的照射下会产生对光的吸收效应，且其对光的吸收是具有选择性；B.各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱:DNA分对波长260nm的紫外光有特异的吸收峰蛋白质对波长280nm的紫外光有特异的吸收峰碳水化合物对230nm的紫外光有特异的吸收峰C.A260/A280与A260/A230的比值可以反响DNA的纯度；A260/A280=1.8 DNA纯净A260/A2801.8 含RNA杂质，用RNA酶去除。4. 质粒DNA的酶切鉴定：限制性内切酶是DNA重组操作过程中所使用的根本工具。限制性内切酶能特异性地与一段被称为限制酶识别序列的特殊DNA序列结合，或是与其附近的特异位点结合，并在结合位点切割双链DNA。 5. 琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应：不同的DNA，分子量大小与构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带(迁移速度与分子量的对数值成反比关系).三、材料与方法： 一实验材料：1.PCR仪器：PCR仪、台式离心机、微量加样枪、灭菌的薄壁离心管材料：菌液【大肠杆菌DH5a菌株(pMD19-T质粒,含目的片段-绿色荧光蛋白GFP)】、无菌去离子水、2PremixTaq、引物2. 质粒DNA的提取与制备仪器：恒温培养箱、台式离心机、离心层析柱、Eppendorf管、微量加样枪、离心管材料：溶液 P1S1、溶液P2 (S2、溶液P3S3、去蛋白液PEW1漂洗液WBW2、洗脱液EBEluent)、含pMD19-T质粒的大肠杆菌DH53. 质粒DNA的定量紫外分光光度法仪器：比色杯、紫外分光光度计、微量加样枪材料：蒸馏水、质粒4.质粒DNA的酶切鉴定仪器：1.5ml的EP管、微量加样枪材料：无菌水、10M酶切缓冲液Buf R、质粒DNA、Hind III (15U/ul)、EcoR I(12U/ul)5.琼脂糖凝胶电泳仪器：凝胶电泳系统、凝胶成像系统材料：电泳指示剂、Gelview、TBE、琼脂糖、DNA Marker 5000、电泳缓冲液二实验方法准备目的DNA：菌液煮沸10min，冷冻，室温解冻后离心取上清液1.PCR取0.2mlPCR反响管一只，用微量加样枪按下述顺序分别参加：灭菌去离子水5.5l、2*Premix Taq12.5l、引物1 (10 mol/L) 1l、引物2 (10 mol/L) 1l、菌液5l 将PCR反响管置台式离心机中瞬时离心将装有PCR反响体系的PCR反响管放入PCR仪上进展如下操作：94预变性5分钟后开始以下循环 循环为9430 秒，5030 秒，72 1 分钟。循环为30次 72 5 分钟 4 保温将扩增后的基因用微量加样枪加到电泳仪的凝胶孔中2.质粒DNA的提取与制备取1.5ml培养物参加Eppendorf管中 13000rpm x 1min，弃上清参加250l 溶液S1，吹打，使细菌沉淀分散，彻底悬浮 参加250l 溶液S2，颠倒46次混匀不要剧烈振荡，直到溶液变得清亮 参加350l 溶液S3，立即温和混匀68次。13000rpm离心10min，小心取上清液500-800l 将吸附柱放于收集管中，将上一步所得上清液参加吸附柱中，13000rpm离心3min，弃滤液 参加500l去蛋白液(W1)，13000rpm离心1min，弃滤液 向吸附柱中参加700l 漂洗液W2， 13000rpm离心1min ，弃滤液；重复一遍操作 空柱13000rpm离心1min，然后室温放置3min，使残留乙醇挥发取出吸附柱，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间加50l洗脱缓冲液(Eluent)，室温放置1min，13000rpm离心1min洗脱质粒DNA， -20保存备用3.质粒DNA的定量紫外分光光度法清洗比色皿：用微量加样枪向比色皿参加适量的蒸馏水刷洗，23次。并用滤纸擦拭干净空白对照比色测定 向比色皿参加98ul蒸馏水，进展Blank调零再向比色皿参加2ul的质粒DNA，于紫外分光光度计上进展sample测定，记录相关数据4.质粒DNA的酶切鉴定小心混匀试剂，将EP管置于恒温水浴箱中371.5小时。取质粒DNA、经酶切反响后的DNA片段和PCR扩增的DNA各6l于三个EP管中并做好标记5.琼脂糖凝胶电泳往每个EP管中参加1lGelview染料，室温放置一分钟用微量加样枪分别各吸取10ul，按序号参加到电泳仪的凝胶孔中电泳30分钟 取出凝胶紫外光下观察，拍照四、结果与讨论：一实验现象1.参加溶液P1，出现悬浮现象；2.参加溶液P2,温和混匀，溶液会变得清亮；3.参加溶液P3,有白色絮状沉淀生成；4.电泳时，可观察到在电流作用下，点样的溶液出现电泳现象，电泳速度不同。在紫外检测仪条件下，可以观察到不同的物质出现不同的电泳带。二实验结果原始实验数据测量次数 质粒DNA浓度ug/ml Ratio比值(A260/A280)1 1481.46 2 1063 115平均值 123电泳后的图片四实验分析1.由上数据可知，Ratio=1.47 明确样品中含有较多的蛋白质芳香族2. 在图片中，其他三类DNA与Maker相比拟，可知质粒DNA的分子大小在2500bp-3500bp，酶切反响的质粒DNA片段分子大小在2800-3000bp和400-500左右，PCR的DNA分子大小在400-500bp。根本符合预期。四实验讨论1.质粒DNA中出现三条带，分别对应超螺旋质粒DNA、线性DNA和开环状质粒DNA。这三种不同构型的分子有不同的迁移率，在一般情况下，迁移速度最快的为超螺旋型，其次为线性分子，最慢的为开环状分子，所以条带从上到下分别为：超螺旋型DNA、线性分子、开环状分子。,2.对于实验结果中：的可能原因为：“取上清液步骤中吸入沉淀导致引入较多的蛋白杂质，进而导致后续实验中因蛋白质量较多而难以去除。B.可能为试剂污染引起杂质蛋白的引入。3.实验中需注意的事项：用微量加样枪加试剂时，同种试剂可以不用换吸头，每次换不同试剂时要记得换一个新吸头。在PCR中，如果配好的反响液较多沾到管壁上，要将PCR反响管置台式离心机中瞬时离心，使反响液集中于管底，然后才将反响管放到基因扩增仪上。在质粒DNA提取的实验中，参加溶液S2时，时间不能太久，动作要温柔，轻轻颠倒几次。在电泳实验中，点样时枪头下伸，点样孔内不能有气泡。在电泳中，Geldview有毒，切勿用手接触。思考题：1碱裂解法提取质粒时，溶液I、II、III的作用分别为？答：溶液I：螯合金属离子，抑制脱氧核酸酶对DNA的降解作用；有利于溶酶体的作用。溶液II：细胞壁肽聚糖在碱性下水解，核酸和蛋白质变性。溶液III：酸性条件下质粒DNA复性，变性蛋白-SDS+线性DNA沉淀，Na+可中和DNA。2结合实验情况，如何提高限制性酶切的反响效率？答：尽量选择粘端酶切和那些酶切效率高的限制酶。酶量的选择任何时候2种酶的总量不能超过反响体系的1/10体积，而且最大反响体系最好不要小于20 ul，且酶切反响中甘油浓度应低于5%。底物DNA的纯度：主要污染DNA 的某些物质，如酚、氯仿、乙醇等均能抑制酶反响应尽量纯化底物。反响系统：主要是反响缓冲液中的离子强度,如NaCl和Mg2+, 适宜离子强度可以激发酶切反响。9 / 9
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