基因突变的检测方法

基因突变的检测方法 基因突变的检测方法 基因突变的研已成为当今生命科学研究的热点之一 检测方法也随之迅速发展 人类细胞 癌基因的突变类型已如上所述 对于基因突变的检测 1985 以前 利用 Southern 印迹法 可以筛选出基因的缺失 插入和移码重组等突变形式 对于用该法法不能检测的突变 只 能应用复杂费时的 DNA 序列测定分析法 多聚酶链反应 polymerase chain reaction PCR 技术是突变研究中的最重大进展 使基因突变检测技术有了长足的发展 目前几乎所有的基因突变检测的分子诊断技术都是建立于 PCR 的基础之上 并且由 PCR 衍 生出的新方法不断出现 目前已达二十余种 自动化程度也愈来愈高 分析时间大大缩短 分析结果的准确性也有很大很提高 其中包括单链构象多态性 single strand comformational polymorphism SSCP 和异源双链分析法 heteroduplex analysis HA 下面分别介绍几种 PCR 衍生技术及经典突变检测方法 可根据检测目的和实验室条件选择 时参考 PCR SSCP 法 PCR SSCP 法是在非这性聚丙烯酰胺凝胶上 短的单链 DNA 和 RNA 分子依其大 街基序列不同而形成不同构象 一个碱基的改变将影响其构象而导致其在凝胶上的移动速 度改变 其基本原理为单链 DNA 在中性条件下会形成二级结构 这种二级结构依赖于其碱 基组成 即使一个碱基的不同 也会形成不同的二级结构而出刺同的迁移率 由于该法简 单快速 因而被广泛用于未知基因突变的检测 用 PCR SSCP 法检测小于 200bp 的 PCR 产物 时 突变检出率可达 70 95 片段大于 400bp 时 检出率仅为 50 左右 该法可能会 存在 1 的假阳性率 应用 PCR SSCP 法应注意电泳的最佳条件 一般突变类型对检测的灵 敏度无大的影响 同时该法不能测定突变的准确位点 还需通过序列分析来确定 Sarkar 等认为对于大于 200bp 的片段 用其 RNA 分子来做 SSCP 会提高其录敏度 应用 PCR SSCP 检测点突变已见报道于人类大部分的肿瘤组织或细胞 如乳腺癌 食管癌 肺癌 胃癌 肝癌 胰腺癌等 检测的基因包括多种癌基因及抑癌基因 也是检测抑癌基因 p53 突变最 常用的方法 仅检测第 5 8 外显子即可发现 85 以上的 p53 基因突变 由于该法简便快速 特别适合大样本基因突变研究的筛选工作 异源双链分析法 HA HA 法直接在变性凝胶上分离杂交的突变型一野生型 DNA 双链 由 于突变和野生型 DNA 形成的异源杂合双链 DNA 在其错配处会形成一突起 在非变性凝胶中 电泳时 会产生与相应的同源双 DNA 不同的迁移率 该法与 SSCP 相似 所不同的是 SSCP 分离的是单链 DNA HA 法分离的是双链 DNA 也只适合于小片段的分析 但 HA 对一些不能 用 SSCP 检出的突变有互补作用 两者结合使用 可使突变检出率提高到近 100 突变体富集 PCR 法 mutant enriched PCR 本法的基本原理是利用 ras 基因家族某个密码 子部位存在已知的限制性内切酶位点 如 K ras 基因第 12 密码子的 BstNI 位点 第 13 密 古巴子有 Bg 位点 用链续二次的巢式 PCR 来扩增包括 K ras 第 12 13 密码子的 DNA 片段 在两次扩增反应之间用相应的内切酶消化扩增的 DNA 片段 野生型因被酶切而不能 进入第二次 PCR 扩增 而突变型则能完整进入第二次 PCR 扩增并得到产物的富集 变性梯度凝胶电泳法 denaturing gradinent electrophoresis DGGE DGGE 法分析 PCR 产物 如果突变发生在最先解链的 DNA 区域 检出率可达 100 检测片段可达 1kb 最适 围为 100bp 500bp 基本原理基于当双链 DNA 在变性梯度凝胶中进行到与 DNA 变性湿度一 致的凝胶位置时 DNA 发生部分解链 电泳适移率下降 当解链的 DNA 链中有一个碱基改 变时 会在不同的时间发生解链 因影响电泳速度变化的程 而被分离 由于本法是利用温度和梯度凝胶迁移率来检测 需要一套专用的电泳装置 合 成的 PCR 引物最好在 5 末端加一段 40bp 50bp 的 GC 夹 以利于检测发生于高熔点区的突 变 在 DGGE 的基础上 又发展了用湿度梯度代替化学变性剂的 TGGE 法 温度梯度凝胶电 泳 temperature gradient gelelectrophoresis TGGE DGGE 和 TGGE 均有商品化的电泳 装置 该法一经建立 操作也较简便 适合于大样本的检测筛选 化学切割错配法 chemical cleavage of mismatch CCM CCM 为在 Maxam Gilbert 测序法 的基础上发展的一项检测突变的技术 其检测突变的准确性可与 DNA 测序相仿 其基本原 理为将待测含 DNA 片段与相应的野生型 DNA 片段或 DNA 和 RNA 片段混俣变性杂交 在异源 杂合的双链核酸分子中 错配的 C 能被羟胺或哌啶切割 错配的 T 能被四氧化饿切割 经 变性凝胶电泳即可确定是否存在突变 该法检出率很高 也是检片段最长的方法 已有报 功检测了 1 7kb 片段 如果同时对正 反义链进行分析 检出率可达 100 应用荧光检 测系统可增强敏感度 可检测到 10 个细胞中的 1 个突变细胞 该法中的化学试剂有毒 又 发展了碳二亚胺检测法 catodiimide CDI CDI 为无毒物质 也可检测大片段 DNA 的点 突变 等位基因特异性寡核苷酸分析法 allele specific oligonucleotide ASO ASO 为一种 以杂交为基础对已知突变的检测技术 以 PCR 和 ASO 相结合 设计一段 20bp 左右的寡核苷 酸片段 其中包含了发生突变的部位 以此为探针 与固定在膜上的经 PCR 拉增的样品 DNA 杂交 可以用各种突变类型的寡核苷酸探针 同时以野生型探针为对照 如出现阳性 杂交带 则表运河样品中存在与该 ASO 探针相应的点突变 ASO 需严格控制杂交条件和设 置标准对照避免假阳性和假阴性 目前已有商品化的检测盒检测部分癌基因 ASO 突变 DNA 芯片技术 DNA chip DNA 芯片技术是 90 年代后发展的一项 DNA 分析新技术 它集合 了集成电路计算机 激光共聚焦扫描 荧光标记探针和 DNA 合成等先进技术 可用于基因 定位 DNA 测序 物理图谱和遗传图谱的构建等 在基因突变检测方面 DNA 芯片也有广阔 的前景 其基本原理为将许多已知序列的寡核苷酸 DNA 排列在 1 块集成电路板上 彼此之 间重叠 1 个碱基 并覆盖全部所需检测的基因 将荧光标记的正常 DNA 和突变 DNA 发别与 2 块 DNA 芯片杂交 由于至少存在 1 个碱基的差异 正常和突变的 DNA 将会得到不同的杂 交图谱 经过共聚集显微镜分别检测两种 DNA 分子产生的荧光信号 即可确定是否存在突 变 该方法快速简单 片动化程度高 具有很大的发展潜力 将在基因突变检测中心发挥 非常重要的作用 连接酶链反应 ligase chain reaction LCR 与其他核酸扩增技术比较 其最大特点为 可准确区分基因序列中单个基因突变 由 Landegree 于 1988 年首次应用于镰刀奖细胞贫血 的分子诊断 LCR 是以 DNA 连接酶将某一 DNA 链的 5 磷酸与另一相邻链 3 羟基连接为基 础 应用两对互补的引物 双链 DNA 经加热变性后 两对引物分别与模板复性 若完全互 补 则在连接酶的作用下 使相邻两引物的 5 磷酸与 3 羟基形成磷酸二酯二酯键而连接 前一次的连接产物又作为下一次循环反应的模板 如果配对的碱基存在突变则不能连接和 扩增 LCR 产物检测最初是通过这 32p 标记上游引物 3 未端 经变性凝胶电泳分离后放射 自显影加以鉴定 其检测敏感性达到 200 个靶分子 也可设计 1 个横跨两引物的检测探针 用它与 LCR 产物进行杂交检测 近年有应用荧光素 地高辛等非核素标记方法 Batt 在 1994 年发展了一种更为简的方法 好微孔板夹心杂交法 由于 LCR 的快速 特蛋和敏感的 特性 以及能检测单个碱基突变的能力 因此被应用于肿瘤基因突变的分子诊断 并与 PCR 结合用以提高其敏感性 等位基因特异性扩增法 Allele specific amplification ASA ASA 于 1989 年建立 是 PCR 技术应用的发展 也称扩增阻碍突变系统 amplification refractory mutation system ARMS 等位基因特性 PCR allele specific PCR ASPCR 等 用于对已知突变 基因进行检测 该法通过设计两个 5 端引物 一个与正常 DNA 互补 一个与突变 DNA 互补 对于纯合性突变 分别加入这两种引物及 3 端引物进行两个平行 PCR 吸有与突变 DNA 完 互补的引物才可延伸并得到 PCR 扩增产物 如果错配位于引物的 3 端则导致 PCR 不能延伸 则称为 ARMS ARMS 和 ASPCR 借鉴多重 PCR 原理 可在同一系统中同时检测两种或多种等位 基因突变位点 ASA 法的检出率依赖于反应条件的优化和可能发生的引物与靶 DNA 有氏配 时错配延伸 特别是当错配碱基为 G T 时 这时可通过调整实验条件如引物靶 DNA Taq DNA 聚合酶的浓度等来得高瓜在特异性 在反应体系中加入甲酰胺也可减少非特异性扩增 还可通过在引物 3 端的第二个碱基引入一个错配碱基 使之与模板之间形成双重错配以阻 止错误延伸 RNA 酶 A 切割法 RNase A cleavage 在一定条件下 氨基源双链核酸分子 RNA RNA 或 RNA DNA 中的错配碱基可被 RNaseA 切割 切割产物可通过变性凝胶电泳分离 当 RNA 探 针上错配的碱基为嘌呤时 RNaseA 在错配处的切割效率很低 甚至不切割 而当错配碱基 为嘧啶时 则其切割效率较高 故如果仅分析被检 DNA 的一个条链 突变检出率只有 30 如同时分析正义和反义二条链 检出率可达 70 该法需要制备 RNA 探针 增加了 操作的复杂性 但可用于 1 2kb 的大片段进行检测 并能确定突变位点 于这些优越性 它仍被作为一种经典方法用于对未知突变进行分析 染色体原位杂交 In situ hybridization of chromosome 染色体发现距今已有 150 多年 的历史 染色体检测被广泛用于动 植物及人类的细胞遗传学研究 随着染色体分技术和 分子生物学技术的发展 染色体研究范围也不断扩大 特别是用于肿瘤分子诊断 肿瘤细 胞的染色体变化是一非常普遍的现象 可分为原发和继发两类 在肿瘤形成的生物学基础 方面 原发性的染色体变化与引起肿瘤的直接原因有关 肿瘤细胞中可以发现各种形式的 染色体畸变 如缺失 重复 易位 重排 单体断裂及核内复制等 继发性变化主要是肿 瘤细胞核型的改变 染色体的检测对于肿瘤的诊断 鉴别诊断 生物学行为判别等方面都 重要意义 染色体的检测方法进展很快 检测的精确率也不断提高 这里主要介绍荧光原 位杂交和 PRINS 法 荧光原位杂交技术 fluorescent in situ hybridiaation FISH 创建于 1986 年 1969 年 Gall 和 Pardue 首先应用核素标记核苷酸制备探针 通过放射自显影检测杂交信号 应 用核素标记的探针其敏感性可以检测到中期染色体上几百 碱基的单拷贝靶核苷酸序列 敏感性虽高 但定位不够精确 FISH 具有探针稳定 操作安 全 可快速 多色显示多个不同探针的杂交信号等优点 FISH 的灵敏感与探针标记方法和 检测仪器性能有关 探针标记时掺入的修饰核苷酸比例直接影响杂交信号强度 FISH 探针 一般采用随机引物法或切口翻译法 如将 PCR 技术引入 FISH 探针标记 可使其灵敏度提高 到 0 25kb 应用慢扫描 CCD 配合影像处理理软件 增强信噪比 有利于检测微弱信号 如 应用 TSA 系统 tyramide signal amplification 能将杂交信号再放大 1000 倍 可用于 单拷贝基因的定位 FISH 分辨率大约为 1 3Mb 如果应用强变性剂处理染色体 让 DNA 分子 从蛋白质中分离出来 使双 DNA 完全伸展并粘附在玻片上 经引处理后 分辨率可达 1 2kb 还可采用对分裂中期染色体进行显微解剖 microdissect 法以提高分辨率 FISH 的另一个特点是可以联合庆用地高辛 生物素等多种标记系统 在一次杂交中可检测多种 探针在染色体上的位置及探针间的相互关系 即多色 FISH 或多靶 FISH FISH 技术已被广 泛应用于肿瘤研究中的基因扩增 易位重排及缺失等的检测 在肿瘤诊断和鉴别诊断 预 后和治疗监控等方面都有重要意义 Klch 等于 1989 年发明了染色体上寡核苷酸引物原位 DNA 合成技术 oligonucleotide primed in situ DNA synthesis PRINS 并成功地用于染色体特异 卫星 DNA 标记 其 基本原理是用非标记的寡核苷酸引物同染色体上靶序列特异性地杂交 在 DNA 聚合酶作用 下 当引物延伸时 掺入标记的核革酸可直接或间接地检量标记位点 PRINS 技术的优点 是不需克隆基因作探针 且由于杂交反应在前 标记在后 故非特异怀背景低 缺点是信 号弱 灵敏度低 为克服这一制眯 Terkelsen 等建立了重复引物原位标记技术 repeated PRINS 重复进行 PRINS 反应 使信号号强度明显提高 基于 FISH 的原理 发展了多色原位经物标记 multicolor PRINS 可测定二个以上靶序列在 DNA 分子上的相 互的位置 且特异性比 FISH 还高 DNA 序列分析 DNA sequencing 应用各种突变检测技术检测到的基因突变 最后都需用 序列分析才能确定突变类型及突变位置 其效率可以达到 100 现在的测序方法已与经 典的方法有了很大的不同 其基本原理虽仍是双脱氧终止法 但自动化程度大为提高 操 作更简便 测序时间也大大缩短 随着 PCR 技术与测序联合使用 不需经过 M13 亚克隆步 骤 故称为直接测序法 direct sequencing DS DS 法测序的模板主主要来源于 PCR 应用不对称 PCR asymmetric PCR 和基因组扩增转录同步测序法 genomic amplification with transcript sequencing GAWTS 等 使单链产物大大增加 近年来 PCR 循环测序法的建立 使模板扩增与同步进行 引物用四种不同前颜色的荧光标记 使 每个样品的四个测序反应可在一个反应管和一个泳道内进行 大大提高了测邓的自动化程 度 目前 PE 公司推同出的 DNA 自动测序仪已发展到 96 泳道 并仍在不断改进 这些高度 自动化的测序方法是经较理想的基因突变分析技术 但其昂贵的费用其使用范围 所以对 一些小样本或为了某些特定目的的样本分析 仍进行经典的手工测序 突变基因的检测方法多种多样 特别是 PCR 技术诞生后 许多检测技术都是在 PCR 基础上 衍生的 由于 PCR 扩增南非要的模板量少 使对肿瘤的突变分析可以精确到单细胞 如霍 奇金病的 R S 细胞的单细胞基因突变分析 另外 应用显微解剖法 microdissection 可 在组织切片上较精确地挑选需检测的靶点 其优点是可克服肿瘤组只中间质或癌周组织的 混杂 提高准确性 除上述介绍的方法外 还有多种方法也用于基因突变的分子检测 如 对未知突变基因进行分析的酶促切割错配法 enzyme mismatc cleavage EMC 切割片段 长度多态性 cleavage fragment length polymor phism CEFLP 双脱氧指纹图谱法 dideoxy finger printing ddF 错配接合蛋白质截短测试法 protein truncation test PTT 等 对已知突变基因进行分析 的有引物延伸法 primer extension PEX 寡 核苷酸链接检测法 oligonucleotide ligation assay OLA 毛细管电泳法 capillary electrophoresis CE 等方法